Name: Schwimmen induzierte Paralyse zu beurteilen Dopamin Signalisierung in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Lernen Sie das Swimming-Induced Paralysis (SWIP)-Verfahren zur Untersuchung der Dopamin-Signalübertragung in Caenorhabditis elegans. Diese Methode ermöglicht die schnelle Identifizierung von Genen im dopaminergen Synapsenbereich.

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Die Autoren möchten Dr. Osama Refai von Dr. Randy Blakely Lab zur Orientierung mit der automatisierten Analyse der SWIP danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung von NIH R01 DA042156, LC.

1. Vorbereitung von Lösungen und Medien
<ol><li>M9 Puffer durch Auflösen von KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM) vorbereiten und NaCl 5,0 g (85,5 mM) in 1 L autoklaviert deionisiertes Wasser. Nach dem Autoklavieren 1,0 mL 1 M MgSO4 (12 g in einem Endvolumen von 100 mL autoklaviert deionisiertes Wasser) hinzugeben. Mix 100 mL der resultierenden 10 X M9 mit 900 mL autoklaviert deionisiertes Wasser, um eine 1 X Lösung machen.</li>
	<li>Um Ei Puffer zu machen, lösen Sie 6,896 g NaCl (118 mM), 3,578 g KCl (48 mM), 0,294 g CaCl2-2 H2O (2 mM), 0,406 g MgCl2-6 H2O (2 mM) und 5,958 g (25 mM auf) von HEPES in 1 L autoklaviert deionisiertes Wasser. Einstellen Sie pH bis 7.3 mit NaOH.</li>
	<li>Bereiten Sie frische Natriumhypochlorit/NaOH Lösung durch Zugabe von 1 mL ca. 5-6 % Natriumhypochlorit (Chlorid) und 180 µL 10 N NaOH auf 3,8 mL entionisiertem Wasser.</li>
	<li>60 g Saccharose wiegen und lösen sich im Autoklaven deionisiertes Wasser zu einem Endvolumen von 100 mL bis 60 % Saccharoselösung machen.</li>
	<li>Auflösen von 0,684 g Saccharose in 10 mL autoklaviert deionisiertes Wasser, 200 mM Saccharose zu machen. Prüfen Sie und einstellen Sie der gleichen eine Osmolarität mit XR. 1 mL Aliquots in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und frieren bei-20 ° C.</li>
	<li>0,184 g AMPH (Molmasse 184.75 g/Mol) wiegen und lösen sich in 10 mL entionisiertem Wasser, eine 100 mM-Stammlösung zu machen. Mix 2 µL der Stammlösung in 400 µL Wasser 0,5 mM funktionierende Lösung zu machen.</li>
	<li>
Bereiten Sie Nährstoff Wachstum Medien (NGM) Platten
	<ol>
<li>Mix 3 g NaCl (52,65 mM), 20 g Pepton, 25 g Bacto-Agar und 975 mL entionisiertem Wasser in einen 2 L-Erlenmeyer-Kolben. Gehören Sie ein magnetisches rühren Bar und Autoklaven (121 ° C, 15 PSI) für 1 Stunde mit flüssigen Zyklus.</li>
		<li>Abkühlen lassen Sie und behalten Sie die Temperatur bei ca. 50 ° C, indem Sie den Kolben auf einer Heizung unter Rühren. 0,5 mL des Cholesterins (5 mg/mL in Ethanol), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2 und 25 mL 1 M Phosphatpuffer Kalium, pH-Wert 7,4 (108,3 g KH2PO4, 35,6 g K2HPO4 hinzufügen deionisiertes Wasser bis 1 L).</li>
		<li>Pipette 25 mL in 100 mm x 15 mm Petri Platten und lassen die Medien zu festigen. Speichern Sie die Platten auf den Kopf bei 4 ° C in einer Box für bis zu 4 Wochen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Lysogeny Brühe (LB) Brühe
	<ol>
<li>5 g LB Trockenmischung in 200 mL entionisiertem Wasser in einen Erlenmeyerkolben auflösen. Autoklaven für 30 Minuten unter Verwendung der flüssigen Sterilisation radeln. Lassen Sie die Brühe abkühlen lassen. Für 1-2 Wochen bei Raumtemperatur lagern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der bakteriellen Platten NA22
	<ol>
<li>Verwenden Sie einen sterilen Pipettenspitze oder einer sterilen bakterielle Schleife Streifen eine LB-Platte mit einem kleinen Volumen der NA22 E. Coli -Bakterien aus Glycerin und inkubieren Sie die Platte auf dem Kopf stehend in einem Inkubator 37 ° C über Nacht um isolierte Kolonien wachsen. Wählen Sie und führen Sie eine einzige Kolonie in 200 mL LB Brühe zubereitet im Schritt 1,8 ein und über Nacht bei 37 ° C auf ein Schütteln Plattform wachsen zu lassen.</li>
		<li>Verzichten Sie, um die Platten zu säen, 200 µL der bakteriellen Kultur auf die NGM Teller weiter oben in Schritt 1.7 vorbereitet und mit einem sterilen Glas Hockeyschläger zu verbreiten. Lassen Sie die Platten trocknen über Nacht oder länger unter einer Haube und kopfüber in einer luftdichten Box bei 4 ° c lagern</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um die Wimpern/Platin-Werkzeug, um Würmer holen zu machen, kleben Sie eine dicke Wimpern oder ein Platin-Glühfaden in ein Glas Pasteur pipette mit super-Klebstoff. Schneiden Sie die Spitze der Wimpern in einem Winkel mit einer Rasierklinge. Alternativ kann ein Bunsenbrenner schmelzen die Pipettenspitze Glas um das Platin Filament verwendet werden.</li>
</ol>2. C. Elegans Tierhaltung
Hinweis: Kultur von Wildtyp N2C. Elegans Belastung für Escherichia coli NA22 Platten. Die detaillierte Kulturmethoden werden nachfolgend beschrieben.
<ol><li>
Vorbereitung der Wurm Kultur
	<ol>
<li>Um eine Starterkultur von Würmern, schneiden Sie ein kleines Stück des Nährbodens aus einer Platte mit gut genährte Tiere und übertragen Sie es auf einen NA22 E. Coli -Bakterien-Teller vorbereitet im Schritt mit einem sterilen Spatel 1,9. 3-4 Tage inkubieren Sie Platten bei 20 ° C. Bestätigen Sie unter einem Stereomikroskop visuell das Vorhandensein von trächtigen Erwachsene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der synchronisierten Bevölkerung von worms
	<ol>
<li>Sammeln Sie trächtige Erwachsenen von mindestens 2 Platten durch den Verzicht auf autoklaviert deionisiertes Wassers rund um die Platte mit einer Spritzflasche. Vorsichtig schwenken die Platte, um die Würmer zu verdrängen und die Würmer in einem 15 mL Polystyrol konischem Rohr mit einer Einweg-Kunststoff-Pipette zu sammeln.</li>
		<li>Spin-down das Rohr in einer Zentrifuge bei 140 X g für 2 min, pellet-Würmer, dann überstand mit einer Vakuumpumpe abgesaugt oder mit integriertem Labor Vakuum.</li>
		<li>Aufschwemmen und waschen die Würmer durch das Ausfüllen der Röhre autoklaviert deionisiertes Wasser und Mischung mit Zentrifuge bei 140 X g für 2 min. Aspirieren überstand und wiederholen Sie diese letzte Schritt zwei weitere Male oder bis Würmer klar von Bakterien sind (Wasser wird deutlich, wenn Sie gemischt mit den Würmern).</li>
		<li>Das Wurm-Pellet 5 mL frisch zubereiteten Natriumhypochlorit/NaOH-Lösung (Schritt 1.3) hinzu und schnell mischen mit einem Wirbel. Inkubieren Sie das Rohr auf einer Wippe für ca. 4-8 min. Die Zeit der Inkubation mit Natriumhypochlorit/NaOH Lösung schwankt zwischen 4-8 Minuten anhand der Qualität der Lager Natriumhypochlorit-Lösung (Bleichmittel).</li>
		<li>Setzen Sie einen Tropfen (2-50 µL) Lösung, die Würmer auf einen Glas-Objektträger enthält, und überprüfen Sie alle 2 min unter dem Mikroskop für Wurm Lyse. Bei etwa 70 % der Würmer lysiert und Eier werden freigesetzt, füllen Sie das Rohr mit Ei Puffer in Schritt 1.2 und sofort Zentrifuge für 1 min bei 140 X g pellet-Embryonen und Wurm Schlachtkörper vorbereitet.</li>
		<li>Den Überstand abgesaugt und waschen das Pellet 3 mehrmals durch das Rohr jedes Mal mit Ei-Puffer zu füllen. Spin-down bei 140 X g für 1 min und den Überstand jedes Mal zu entfernen. Das Pellet wird weiß am Ende der Waschgänge.</li>
		<li>Trennen Sie nach der letzten Wäsche die Embryonen von die Toten Kadaver in 30 % Saccharoselösung. 5 mL autoklaviert deionisiertes Wasser zum Pellet, Aufschwemmen dazugeben und 5 mL 60 % Saccharose in Schritt 1.4 vorbereitet. Gründlich mischen und bei 160 X g für 6 min zentrifugieren.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Glas Pasteurpipette schwimmende am oberen Meniskus in ein frisches 15 mL konische Röhrchen Embryonen übertragen. Nehmen Sie nicht mehr als 3 bis 4 mL. Entfernen Sie alle verbleibenden Saccharose, waschen die Embryonen 3 Mal mit autoklaviert Wasser durch Zentrifugieren bei 140 X g für 3 min, entfernen des Überstands und resuspending das Pellet (und füllt das Rohr) jedes Mal.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Waschungen mit 1 x M9-Puffer. Aufschwemmen Sie nach der letzten Wäsche das Pellet in 10 mL M9. Lassen Sie die Rohre auf einen Shaker über Nacht (nicht mehr als 14 h) für die Eier in die L1-Larven schlüpfen. Würmer bleiben in L1 Larvenstadium aufgrund des Fehlens von Essen.</li>
		<li>Waschen die L1-Larven 3 Mal mit autoklaviert Wasser Pheromone freigegeben durch die Larven durch Zentrifugieren bei 140 X g für 2 min. entfernen Aufschwemmen der Larven in 1 mL Wasser. Machen Sie eine 01:10 Verdünnung der Würmer im Wasser, pipette 10 µL Tropfen auf einen Objektträger, einem Deckgläschen auflegen und die Anzahl der Würmer unter ein Stereoskop. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal und durchschnittliche Ergebnisse.</li>
		<li>Pipette das Volumen von Worms, das entspricht etwa 1.000 Würmer auf eine NA22-Platte (das zuvor auf Zimmertemperatur gebracht wurde), indem man kleine auf der Platte Tropfen. Lassen Sie die Platte halboffene, bis die Tropfen trocknet aus. Dann decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie kopfüber in 20 ° C Inkubator für ca. 44-48 h oder bis die Würmer L4 Spätstadium bestätigten visuell unter einem Stereomikroskop erreichen. Nun können die Würmer, SWIP getestet werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) SWIP
Hinweis: Wir beschreiben die manuelle Methode zur Beurteilung der SWIP in Wildtyp Würmer mit AMPH behandelt. Wir diskutieren auch kurz die Verfolgung von Würmern und weiteren Analyse der Wurm Kinetik mit einer automatisierten Wurm-Tracker und eine Tracking-Software, die zuvor durch Huber Et Al.10beschrieben wurden.
<ol><li>
Manuelle Methode für SWIP testen
	<ol>
<li>Aliquoten 40 µL 200 mOsm/L Zuckerlösung mit oder ohne 0,5 mM Ladeeffekt in eine Glasplatte vor Ort. Unter das Stereoskop Pick 8-10 späten L4 Stadium mit einer Wimper oder Platin Würmer holen und die Abholung in der Platte mit der Lösung bis Würmer aus dem Pick bewegen und in die Lösung schwimmen eintauchen. Beachten Sie die Anzahl der Würmer in den Brunnen holte, der Timer gestartet wird, beobachten und notieren Sie die Anzahl der Würmer, SWIP auf jeder Minutenmarke ausstellen.</li>
		<li>Kopieren Sie die raw-Daten in eine Tabellenkalkulation und berechnen Sie den Prozentsatz der Würmer gelähmt, indem die Anzahl der Würmer gelähmt in jeder Minute durch Gesamtzahl der Würmer in den Assay getestet und mit 100 multiplizieren. Kopieren Sie die prozentuale Werte in eine grafische Darstellung und Statistiksoftware und Handlung die Daten mit prozentuale Werte auf der y-Achse und Zeit auf der X-Achse mit der XY-Diagramm zu formatieren.</li>
		<li>Führen Sie zwei-Wege-ANOVA gefolgt von Post-hoc-Analyse (z.B. Bonferroni Posttest), um statistische Signifikanz unter Kontrolle, AMPH Gruppen und Dauer der Behandlung zu testen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Automatisierte Analyse von SWIP
	<ol>
<li>Automatisierte Analyse auf einen einzigen Wurm zu einem Zeitpunkt ausführen. Das Protokoll zum set Kamera, die Wurm-Tracker-Software und Skript, um die Tracking-Software Analyse in Hardaway Et Al.16ausführlich beschrieben sind.</li>
		<li>Kurz, legen Sie ein einzelnes späten L4 Stadium Zwitter in eine Glasplatte vor Ort unter Verwendung einer Wimper Pick, wie in der manuellen Methode im Abschnitt 3.1.2 beschrieben. Schwimmen-Videoaufnahmen von einem Wurm zum Zeitpunkt und der Wurm-Tracker-Software verwenden, um die Häufigkeit der Körper Kurven zu berechnen.</li>
		<li>Führen Sie das Skript mit der Tracking-Software Wurm Prügel Frequenz und Heatmaps aus den Wurm-Prügel-Daten zu generieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschreiben wir Schritt für Schritt-Protokoll um einen Verhaltens-Assay, SWIP, in C. Elegansdurchzuführen. Dieses Protokoll ist einfach und unkompliziert ohne großen technischen Hürden, die Herstellung dieser Assay sehr benutzerfreundlich. Dennoch gibt es einige kritische Aspekte, die berücksichtigt werden, um effektiv den Test durchführen müssen.
Darauf sollte geachtet werden, um sicherzustellen, dass die Würmer für den Assay verwendet gut genährt, da diätetische Einschränkung S...

Tiere führen eine Vielzahl von angeborenen und komplexe Verhaltensweisen, die durch verschiedene Neurotransmitter, die von komplizierten Signalisierung Prozesse koordiniert vermittelt werden. Der Neurotransmitter Dopamin (DA) vermittelt hoch konservierte Verhaltensweisen über Arten, darunter lernen, Motorik und Belohnung Verarbeitung.
Boden-Nematoden C. Elegans, zeigt mit einem relativ einfach und gut gemappten Nervensystem nur 302 Neuronen bestehend deutlich komplexe Verhaltensweisen, darunter viele, die DA wie Paarung, lernen, Nahrungssuche, Fortbewegung und Eiablage geregelt sind 1. unter anderen Funktionen, kurze Lebensdauer, einfache Handhabung und die Erhaltung der Signalmoleküle, markieren Sie die Vorteile der Verwendung von C. Elegans als Modell für die Erforschung der neuronalen Grundlagen von konservierten Verhaltensweisen.
Die Zwitter C. Elegans enthält acht dopaminergen Neuronen; Darüber hinaus enthält das Männchen sechs zusätzliche Paare zur Paarung Zwecke. Wie bei Säugetieren diese Neuronen DA zu synthetisieren und express DA Transporter (DAT-1), ein Membranprotein fand ausschließlich in dopaminergen Neuronen, die transportiert, DA in den synaptischen Spalt zurück in den dopaminergen Neuronen freigesetzt. Darüber hinaus die meisten Proteine, die in jedem Schritt der Synthese, Verpackung und Freisetzung von DA sind hoch konserviert zwischen Würmern und Menschen, und wie bei Säugetieren, DA moduliert Fütterung Verhaltensweisen und Fortbewegung in C. Elegans2.
C. Elegans kriecht auf festen Oberflächen und mit einem charakteristischen Prügel Verhalten im Wasser schwimmt. Interessanterweise Mutanten fehlt Ausdruck des DAT-1 (Dat-1) kriechen normalerweise auf festen Untergrund aber nicht schwimmen als in Wasser untergetaucht aufrecht zu erhalten. Dieses Verhalten wurde schwimmen induzierten Lähmungen oder SWIP bezeichnet. Bisherige Experimenten gezeigt, dass SWIP, teilweise durch ein Übermaß an DA in den synaptischen Spalt verursacht wird, die letztlich die postsynaptischen D2-Like-Rezeptoren (DOP-3) overstimulates. Obwohl ursprünglich in Dat-1 Ko Tiere3identifiziert, SWIP wird auch beobachtet, in Wildtyp Tiere mit Medikamenten dieser Block die Aktivität der DAT (z. B. Imipramin4) behandelt und/oder DA Version (z. B. Amphetamin5) induzieren. Auf der anderen Seite zu verhindern, dass pharmakologische oder genetische Manipulationen Abwendung Synthese und Freisetzung von DA und DOP-3-Rezeptor-Funktion sperren SWIP6. Zusammengenommen haben diese bereits veröffentlichten Daten SWIP als ein zuverlässiges Werkzeug, die Auswirkungen auf das Verhalten verursacht durch mutierte Proteine innerhalb von dopaminergen Synapsen3,4,7 zu studieren und für anzuwendende etabliert leiten Sie genetische Bildschirme für die Identifizierung der neuartige rechtliche Wege DA Signalisierung7,8,9,10,11,12beteiligt. Zusätzlich, indem eine leicht quantifizierbare Auslesen des Medikamenten-induzierten Verhalten bei lebenden Tieren SWIP ermöglicht die Aufklärung der Mechanismen der Wirkung von Drogen wie Amphetamin (AMPH) und Azaperone bei der dopaminergen Synapsen5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protokolle für die Durchführung der SWIP-Assays wurden vor16beschrieben. Hier beschreiben wir ausführlich die Methodik und das Setup Ausführen des Tests mit dem Ziel, eine visuelle Anleitung für die Gemeinschaft von C. Elegans SWIP effektiv durchführen.

<table><tbody><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Reynolds wrap</td><td>1091835</td><td></td></tr><tr><td>Amphetamin</td><td>Sigma</td><td>51-63-8&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Autoklav-Bakterien-Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1352-0000</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriologische Qualität, Agar</td><td>Lab Scientific, Inc</td><td>&nbsp; A466</td><td></td></tr><tr><td>Bacto (TM) Pepton</td><td>BD</td><td>REF 211677</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid (Dihydrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Kamera&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>U-CMAD3</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf 5810R 15amp</td><td>E215059</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>Deionisiertes Wasser</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW</td><td>Milli-Q</td></tr><tr><td>Depression Glasspotplatte</td><td>Corning</td><td>Corning, Inc. 722085</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben</td><td>ThermoFisher</td><td>4103-0250PK</td><td></td></tr><tr><td>Wimpern</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektträger Fisherbrand</td><td></td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Grafik- und Statistiksoftware</td><td>Prism</td><td></td><td>Graphpad 5</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=H3375 & H7006</td><td></td></tr><tr><td>Hypochlorit</td><td>Hawkins</td><td>Natriumhypochlorit 4-6%, USP" 1 gal</td><td></td></tr><tr><td>LB Brühe, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (Hexahydrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=M0250</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat (Heptahydrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührstab</td><td>Fisherbrand</td><td>16-800-510&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>ThermoFisher</td><td>69715</td><td></td></tr><tr><td>NA 22 Bakterien</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma</td><td>1400-61-9</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Advanced Instruments, Inc</td><td>Modell 3320</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Petriplatten</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Orion VersaStar Pro</td><td>IS-68X591202-B 0514</td><td></td></tr><tr><td>Konische Röhrchen aus Polystrin</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat - DIBASIC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8281</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat - MONOBASIC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten</td><td>VWR</td><td>10ml=89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Reliable Scientific</td><td>55S 12x16</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher</td><td>RB=BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat</td><td>Fisher</td><td>RB=S381</td><td></td></tr><tr><td>Tabellenkalkulation</td><td>MS Office</td><td></td><td>Microsoft Excel</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Modell tlb3. 1 stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipettenspitzen</td><td>Verschiedenes</td><td>02-707-400</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=S5016</td><td></td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>Loctite</td><td>1647358 .14 oz.</td><td></td></tr><tr><td>SwimR Software</td><td>10.18129/B9.bioc.SwimR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracker 2</td><td>Worm Tracker 2.0</td><td>www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td><td></td></tr> <tr><td>Videoaufzeichnungssoftware</td><td>Virtualdub</td><td>http://www.virtualdub.org/</td><td></td></tr></tbody></table>

schwimmen induzierte paralyse zu beurteilen dopamin signalisierung in caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Der Swimming-Assay in diesem Protokoll beschrieben ist, dass Synapsen ein gültige Instrument zur Regulierung der dopaminergen Proteine zu identifizieren. Ähnlich wie bei Säugetieren, Dopamin (DA) steuert mehrere Funktionen in C. Elegans einschließlich Lern- und motorische Aktivität. Bedingungen, die DA Version (z. B. Amphetamin (AMPH) Behandlungen) zu stimulieren oder zu verhindern, dass DA Abstand (z. B. Tieren fehlt DA Transporter (Dat-1) die sind unfähig, reaccumulating DA in den Neuronen) erzeugen einen Überschuss an extrazellulären DA schließlich mit dem Ergebnis gehemmte Fortbewegung. Dieses Verhalten ist besonders deutlich, wenn Tiere im Wasser schwimmen. In der Tat, während Wildtyp Tiere über einen längeren Zeitraum zu schwimmen weiterhin, Dat-1 null Mutanten und Wildtyp behandelt mit AMPH oder Inhibitoren der DA-Transporter auf den Boden des Brunnens sinken und bewegen sich nicht. Dieses Verhalten wird als "Schwimmen induzierte Paralyse" (SWIP) bezeichnet. Obwohl der SWIP-Test gut etabliert ist, fehlt eine detaillierte Beschreibung der Methode. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt um SWIP durchzuführen. Um den Test durchzuführen, sind späten larvalen Phase 4 Tiere in einer Glasplatte vor Ort mit Saccharose Kontrolllösung mit oder ohne AMPH platziert. Tiere sind für ihr Verhalten schwimmen erzielte durch Visualisierung unter ein Stereoskop manuell oder automatisch durch die Aufnahme mit einer Kamera auf das Stereoskop montiert. Videos werden dann analysiert verwenden eine Tracking-Software, die eine visuelle Darstellung der Prügel Frequenz und Lähmungen in Form von Heatmaps ergibt. Die manuelle und automatisierte Systeme garantieren eine leicht quantifizierbare Auslesen der Schwimmfähigkeit der Tiere und ermöglichen so Screening für Tiere tragen Mutationen innerhalb des dopaminergen Systems oder für zusätzliche Gene. SWIP ist darüber hinaus lässt sich den Mechanismus der Wirkung von Drogen wie AMPH aufzuklären.

Wir präsentieren Ihnen ein Beispiel der SWIP Assay durch AMPH Behandlung induziert. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der Assay-Installation wie oben beschrieben. Für die manuelle Assay, ca. 8-10 Alter synchronisierte Ende L4 Stadium Würmer gesammelt mit einer Wimper oder Platin sind wählen und eine Glasplatte vor Ort gefüllt mit 40 µL 200 mOsm/L Saccharose (Control-Lösung) oder Saccharose mit 0,5 mM Ladeeffekt und getestet für SWIP gelegt.
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Schwimmen-induziert Lähmung (SWIP) ist ein etablierter Verhaltens-Assay verwendet, um die zugrunde liegenden Mechanismen von Dopamin Signalisierung in Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) zu studieren. Allerdings fehlt eine detaillierte Methode, um den Test durchzuführen. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt Protokoll für SWIP.

Schwimmen induzierte Paralyse zu beurteilen Dopamin Signalisierung in Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Schwimmen-induzierte Lähmung oder SWIP zu demonstrieren, ein Verhaltenstest zur Beurteilung der Dopamin-Signalisierung bei C.elegans. SWIP ermöglicht die schnelle Identifizierung von Genen innerhalb oder im Zusammenhang mit der dopaminergen Synapsis. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Wirkungen, die durch einen Überschuss an extrazellulärem Dopamin erzeugt werden, das zum Beispiel durch Medikamente oder durch Mutationen am Dopamin-Transporter verursacht wird.Um sicherzustellen, dass alle Würmer, die während des Assschwimmens getestet wurden, für die gleiche Zeit schwimmen, müssen die Tiere schnell in die Lösung übertragen werden. Demonstriert werden Sirisha Kudumala und Serene Sossi. Beide arbeiten in meinem Labor.Um Schneckenstarterkulturen einzurichten, verwenden Sie einen sterilen Spachtel, um kleine Agarstücke von einer Platte mit gut gefütterten C.elegans zu schneiden und die Agarstücke in einzelne NA22 E.coli-Platten zu übertragen. Nach der Inkubation der Platten bei 20 Grad Celsius für drei bis vier Tage, visuell bestätigen das Vorhandensein von gravid Erwachsenen unter einem Stereomikroskop. Um eine synchronisierte Population von Würmern zu erhalten, spritzen Sie Wasser auf eine Platte voller gravid Erwachsener.Wirbeln Sie die Platte vorsichtig, um die Würmer zu lösen und verwenden Sie eine Entsorgungspipette, um die Würmer in ein 15 Milliliter Polystyrol-Konrohr zu übertragen. Nachdem Sie die Würmer von einer zweiten Platte in das Rohr gezogen haben, sammeln Sie die Würmer durch Zentrifugation für drei Wäschen in 15 Milliliter autoklaviertem Wasser pro Wäsche. Das Wasser sollte nach der letzten Wäsche klar erscheinen.Nach der letzten Zentrifugation fünf Milliliter einer frisch zubereiteten Natriumhypochlorid-Natriumhydroxidlösung zu den Würmern geben und schnell mit einem Wirbel vermischen. Inkubieren Sie die Röhre auf einer Wippe, legen Sie einen Tropfen Wurmlösung auf ein Glasmikroskop-Dia und überprüfen Sie alle zwei Minuten unter einem Stereoskop für vier bis acht Minuten auf Wurmlyse. Wenn etwa 70% der Würmer lysiert und die Eier freigesetzt wurden, stoppen Sie sofort die Lyse mit dem Zusatz von Eipuffer.Dann zentrifugieren Sie die Embryonen und Wurmkadaver viermal das Pellet mit frischem Eipuffer zwischen den Waschungen, um alle verbleibenden Bleichmittel zu entfernen. Nach der letzten Wäsche sollte das Pellet weiß erscheinen. Setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter autoklaviertem Wasser und fünf Milliliter nukzessirose, um die Embryonen durch Zentrifugation von den Kadavern zu trennen.Entfernen Sie das Rohr nach der Dichtegradiententrennung vorsichtig aus der Zentrifuge und verwenden Sie eine Glaspasteurpipette, um drei bis vier Milliliter der am oberen Meniskus schwebenden Embryonen in ein neues 15-Milliliter-Konusrohr zu übertragen. Waschen Sie die Embryonen dreimal mit autoklaviertem Wasser, um die Saccharose zu entfernen, gefolgt von drei Wäschen im M9-Puffer. Nach der letzten Wäsche die Embryonen über Nacht auf einem Shaker in 10 Milliliter n frischer M9-Puffer brüten, damit die Eier schlüpfen und im L1-Larvenstadium bleiben.Nach nicht mehr als 14 Stunden auf dem Shaker, waschen Sie die L1 Larven dreimal mit dem autoklavierten Wasser, um alle Pheromone zu entfernen, die von den Larven freigesetzt werden, und setzen Sie das Larvenpellet in einem Milliliter Wasser wieder auf. Verdünnen Sie ein Aliquot von Würmern auf ein Verhältnis von eins zu 10 und fügen Sie 1:10 Mikroliter Tropfen auf einem Glasschlitten hinzu und zählen Sie die Würmer unter dem Stereomikroskop. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um eine durchschnittliche Anzahl von Würmern zu erhalten.Verwenden Sie eine Pipette, um genügend Tröpfchen der Wurmlösung auf eine Raumtemperatur NA22 Platte hinzuzufügen, um etwa ein mal 10 zu den dritten Würmern für die Kultur auszusäen und die Platte halb offen zu lassen, bis die Tropfen austrocknen. Dann inkubieren Sie die Platte bedeckt und kopfüber bei 20 Grad Celsius für etwa 44 bis 48 Stunden oder bis die Würmer späte L4-Stufe erreichen, wie visuell unter einem Stereomikroskop bestätigt. Zur manuellen Beurteilung von SWIP 40 Mikroliter Steuerlösung mit oder ohne 0,5 Millimolar Amphetamin in eine Glas-Spotplatte geben.Unter einem Stereoskop acht bis zehn späte L4-Bühnenwürmer mit einem Wimpernpick chenlassen und die Pick in den Brunnen, der die Lösung enthält, untertauchen, bis sich die Würmer von der Pick entfernen und in die Lösung schwimmen. Starten Sie den Timer. Beachten Sie die Anzahl der Würmer, die in den Brunnen freigesetzt werden, und beobachten und notieren Sie die Anzahl der Würmer, die SWIP bei jeder Minutenmarke für insgesamt 10 Minuten ausstellen.Kopieren Sie am Ende des Verfahrens die Rohdaten in eine Kalkulationstabelle und berechnen Sie den Prozentsatz der gelähmten Würmer, indem Sie die Anzahl der Würmer, die in jeder Minute gelähmt sind, durch die Gesamtzahl der Würmer dividieren, die während des Tests getestet wurden, und multiplizieren sich mit 100. Kopieren Sie die Prozentwerte in jede Grafik- und Statistiksoftware, und zeichnen Sie die Daten mit Prozentwerten von SWIP auf der y-Achse und Zeit auf der x-Achse im XY-Diagrammformat. Statistische Analysen zwischen den Kontroll- und Amphetamin-behandelten Gruppen und der Behandlungszeitpunkt können beispielsweise mittels zweiseitiger ANOVA- und Post-hoc-Analyse durchgeführt werden.Für die automatisierte Analyse der schwimminduzierten Lähmung richten Sie die Kamera, die Wurm-Tracker-Software und das Skript ein, um die Tracking-Softwareanalyse auszuführen, und verwenden Sie eine Wimpernauswahl, um einen einzelnen L4-Wurm im späten Stadium in eine Glasfleckplatte zu legen, wie zuvor gezeigt. Nehmen Sie dann Schwimmvideos eines Wurms nach dem anderen auf und verwenden Sie die Wurm-Tracker-Software, um die Häufigkeit von Körperbiegungen zu berechnen, nach dem Skript, das mit der Tracking-Software geliefert wurde, um die Wurm-Thrashing-Frequenz zu erhalten, und um Wärmekarten aus den Wurm-Thrashing-Daten zu generieren. Die meisten der in der Steuerungslösung getesteten Würmer schwimmen mindestens 10 Minuten ununterbrochen.Würmer, die entweder der Kontrolle oder Amphetamin ausgesetzt sind, zeigen SWIP nicht in der ersten Minute der Beobachtung. Während würmer, die mit der Kontrolllösung behandelt werden, jedoch 10 Minuten lang schwimmen, beginnen mit Amphetamin behandelte Würmer nach zwei Minuten Behandlung SWIP auszustellen. Und nach 10 Minuten zeigen 66% der Tiere SWIP.Hier werden Beispiele für Wärmekarten von Tieren gezeigt, die der Kontrolle oder Amphetamin ausgesetzt sind, mit einer erwarteten erheblichen Zunahme der Lähmung, die bei den mit Amphetaminen behandelten Tieren beobachtet wird. Bevor man diesen Test versucht, sollte man mit der Kommissionierung und Entwicklungsinszenierung von C.elegans gut vertraut sein. Die Beteiligung des dopaminergen Systems in das SWIP-Verhalten sollte mit Tieren ohne expression von dopaminergen Proteinen oder durch die Erschöpfung von Dopaminvesikeln mit Reserpin bestätigt werden.SWIP kann bei der Identifizierung neuer Proteine, die am Wirkmechanismus von Medikamenten beteiligt sind, die bei der dopaminergen Synapsis wirken, eine wichtige Rolle spielen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

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Schwimmen induzierte Paralyse zu beurteilen Dopamin Signalisierung in Caenorhabditis elegans

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