Name: Dissektion der lokalen Ca2 + Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca2 + Indikatoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Lernen Sie die Calcium-Imaging-Methode zur Untersuchung lokaler Ca²⁺-Signale in Neuronen und Gliazellen. Dieses Protokoll ermöglicht die Echtzeitüberwachung subzellulärer Calciumdynamiken.

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Diese Arbeit wird unterstützt durch die folgende Zuschüsse: Japan Science and Technology Agency (JST) / Precursory Research für embryonale Wissenschaft und Technologie (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japan); der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) / Stipendien an Hilfe für die wissenschaftliche Forschung (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Takeda Foundation. Die Autoren danken Haruhiko Bito (Universität Tokio) für die Bereitstellung von RCaMP2 und Arthur J.Y. Huang und Thomas McHugh (RIKEN CBS) für die AAV-Vektoren und Anweisungen bezüglich AAV Vorbereitung. Die Autoren möchten auch Editoren danken im Journal of visualisiert Experiments für ihre Hilfe mit video Dreh und Schnitt.

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<li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+high-affinity%2C+fast%2C+red+calcium+indicator+R-CaMP2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2.</a> Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).</li>
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<li>Kanemaru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+subtle%2C+transient%2C+and+local+activity+of+astrocytes+using+an+ultrasensitive+Ca%282%2B%29+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator.</a> Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).</li>
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<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Vielfältigen biologischen Ausgänge werden von Ca2 + Signale eingeleitet. Ca2 + ist ein vielseitiger intrazellulären Signal Bote. Decodierung Ca2 + Signale an bestimmte Ausgänge evozieren wurde eine grundlegende biologische Frage, und Ca2 + bildgebende Verfahren zu beschreiben, die Vielfalt der Ca2 + Signale sind erforderlich. Die derzeit ausführliche Protokoll ermöglicht die Erkennung von unterschiedlichen Ca2 + Signale an die Plasmamembran und ER (Abbildung 3 und Abbildung 4) und lokalen Ca2 + Microdomains innerhalb einer Zelle (Abbildung 4 und Abbildung 5). Dies trägt zu beschreiben die Vielfalt der intrazellulären Ca2 + Signale. Die zeitliche Auflösung von Ca2 + signalisiert wurde auch verbessert, durch gezielte GECIs in der Plasmamembran und ER, weil es kann die Wirkung von einer dreidimensionalen Diffusion von Ca2 + und GECIs selbst vermeiden, und es das Potenzial hat zu erkennen, die Augenblick der Ca2 + Zustrom oder Ca2 + Release, das auf der Membran auftritt.
Das Protokoll hat einige Einschränkungen. Benutzer sollten beachte bitte, dass die detektierten Signale die Summierung von "the Moment of Ca2 + Zustrom oder Release sind" und "Ca2 + verbreitet heraus aus der Originalquelle ca.2 +" , vor allem für große Ca2 + Signale. Zum Beispiel obwohl seine Anregung in HeLa-Zellen Ca evoziert befreien2 + die ER, seine daraus resultierende Ca2 + Signale, nicht nur indem ER gezielt OER-GCaMP6f, sondern auch durch Plasma-Membran-gezielte Lck-RCaMP2 (Abbildung 3 erkannt werden). Eine weitere Einschränkung ist, dass die räumlich-zeitliche Muster Ca2 + Signale möglicherweise nicht der einzige bestimmende Faktor der Leistung von Ca2 + Signale. Die Verteilung der nachgeschaltete Effektor-Proteine (z. B. Ca2 +-abhängigen Kinasen und Phosphatasen) kann auch ein bestimmender Faktor2. Um die intrazellulären Ca2 + Signale vollständig zu entschlüsseln, ist Analyse der nachgeschalteten Enzym Verhalten, die in diesem Protokoll nicht abgedeckt ist, absolut notwendig.
Einer der kritischsten Aspekte für erfolgreiche Ca2 + Imaging ist der bildgebenden Setup und Bild Erwerb Bedingungen, ebenso wie bei anderen live-Imaging-Studien. Bisher zeigten wir, dass Ca2 + Reaktionen in der Zelle auf die Dauer und Intensität der Erregung und Bild Erwerb Bedingungen, einschließlich Belichtung Zeit und Übernahme Frequenz16sehr angewiesen sind. Erregerleistung Beleuchtung ist der kritischste Faktor, da es leichte Toxizität und Immunofluoreszenz GECIs verursachen kann. Die Aufnahmebedingungen der Exposition Zeiterfassung, Frequenz, Anregung Intensität und Dauer der Aufnahme sollte nach dem Zweck des Experiments optimiert werden. Es wird empfohlen, die Belichtungszeit und die Erregung Lichtintensität Immunofluoreszenz und Phototoxizität zur Zelle zu vermeiden so weit wie möglich reduzieren. Die Aufnahmefrequenz und die Dauer der Aufnahme sollte ausreichen, um die Ca2 + Höhe Ereignisse von Interesse, aber sollte zur Vermeidung von Immunofluoreszenz und Phototoxizität auch möglichst gering gehalten werden. Wir empfehlen bestimmen zunächst die Aufnahmefrequenz und die Dauer und der Lichtintensität und der Belichtungszeit zu optimieren, so dass die Immunofluoreszenz die GECIs minimiert wird. Ein weiterer wichtiger Faktor ist der Ausdruck der GECIs. GECIs haben Ca2 +-Pufferung Wirkung sind Ca2 +-bindende Proteine. Daher führt die Überexpression von GECIs in die Pufferung von Ca2 +, die physiologisch notwendig ist für die Zellen. Die Höhe der GECI Ausdruck sollte zur Vermeidung von bildgebenden Zellen mit dem Ausdruck hoher Mengen an GECIs minimiert werden. 
  Zusammenfassend ist das Sezieren von Ca2 + Signale mit einer subzellulären Auflösung einer der wichtigsten Schritte für die Decodierung der intrazellulären Ca2 + Signale, die die Ausgabe biologisches Phänomen zu bestimmen. Dieses Protokoll bietet eine neue Methode für das Sezieren von Ca2 + Signale, die Vielfalt dieser Signale zu beschreiben. Derzeit beschränkt sich diese Technik für in-vitro-Experimente. Jedoch Lck-GCaMP6f dient bereits zur in-vivo Ca2 + Bildgebung bei Mäusen17und OER-GCaMP6f bestätigt wurde, um Ca2 + überwachen in vivo im VD motorischen Neuronen in C. Elegans7 signalisiert. Targeting GECIs subzelluläre Fach hat daher das Potenzial, erweitert werden, um in-vivo Bildgebung in der Zukunft so förderlichen Ca2 + Dissektion in-vivo.

Ca2 + Signale stellen die Höhe der intrazellulären Ca2 + Konzentration. Ca2 + ist die universelle zweiten Messenger für eukaryotische Zellen. Mit Ca2 +, Zellen funktionieren über verschiedene intrazelluläre Signalwege und verschiedenen biologischen Ausgänge zu induzieren. Z. B. in Neuronen, synaptischen Vesikel Release am präsynaptischen Terminal Genexpression in den Zellkern und Induktion der synaptischen Plastizität an der Postsynapse unterstehen verschiedene Ca2 + Signale, die genau den entsprechenden aktivieren nachgeschalteter Enzyme an den richtigen Standorten und mit präzisem Timing1.
Spezifischen räumlich-zeitliche Muster Ca2 + Signale aktivieren die spezifischen nachgeschalteter Enzyme. Ca2 + -Signale werden generiert, indem die Koordination zwischen zwei verschiedenen Ca2 + Quellen: Ca2 + Zustrom aus dem Extrazellulärraum und Ca2 + Entlassung aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER), dient als eine intrazelluläre Ca2 + speichern. Die sinnvolle raumzeitliche Ca2 + Signalisierung Muster induzieren eine bestimmte Zelle-Funktion wird auch durch Nanodomains von 10-100 µM Ca2 + erzeugt in der Nähe von Ca2 + -Kanäle in der Plasmamembran oder ER-Membran-2unterstützt. Wichtig ist, ist die Quelle von Ca2 + Signale eines der wichtigsten Faktoren, die die nachgeschaltete biologischen Ausgabe. In Neuronen haben Ca2 + Zustrom und Ca2 + Release entgegengesetzte Effekte auf das clustering von Gamma - Aminobuttersäure (GABA)A -Rezeptoren (GABA-AR) an den GABAergen Synapsen, der verantwortlich für die Hemmung der neuronale Erregbarkeit3. Ca2 + Zustrom begleitet von massiven neuronale Erregung induziert die Streuung der synaptischen GABAAR Cluster, während anhaltende Ca2 + Entlassung aus der Notaufnahme fördert das clustering von synaptischer GABA-A-Rs. Andere Gruppen haben auch berichtet, dass Tune Richtung Wachstum Kegel Ca2 + Signalquelle kritisch abhängig ist: Ca2 + Zustrom induziert Abstoßung, während Ca2 + Release die Attraktion für das neuronale Wachstum führt Kegel4. Daher, um die Ca2 + Signalwege zugrunde liegenden spezifischen zellulären Ausgänge zu verstehen, ist es wichtig zur Identifizierung der Quelle von Ca2 + Signale von Ca2 + Signale in der subzellulären Auflösung zu beschreiben.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Ca2 + bildgebende Methode um Ca2 + Signale in der subzellulären Auflösung ermöglicht die Abschätzung der Ca2 + Signalquellen (Abbildung 1) zu melden. Ca2 + Microdomains unterhalb der Plasmamembran werden erfolgreich von genetisch codierte Ca2 + Indikatoren (GECIs) gezielt an die Plasmamembran über die Befestigung der Plasmamembran-Lokalisierung Signal Lck in Src überwacht. Kinase N-Termini GECIs5. Um das Ca2 + Signalmuster in der Nähe der ER auf eine bessere räumliche und zeitliche Auflösung erkennen, entwickelten wir vor kurzem OER-GCaMP6f, welche GCaMP6f6 Ziele der ER äußere Membran, mit der ER transmembranen Protein. OER-GCaMP6f kann sensibel Ca2 + Entlassung aus der Notaufnahme mit einer besser räumlich-zeitliche Auflösung als herkömmliche nontargeted GCaMP6f COS-7 Zellen7 und HEK293 Zellen8, durch die Vermeidung der Verbreitung von Ca2 + und GECIs melden. . Wir auch bestätigt, dass die spontane Ca2 + Erhebung im kultivierten hippocampal Astrozyten berichtet von OER-GCaMP6f ein anderes räumlich-zeitliche Muster zeigte im Vergleich zu jener von Plasmamembran ausgerichtete GCaMP6f überwacht (Lck-GCaMP6f)7 ,9, darauf hinweist, dass Ca2 + Bildgebung mit OER-GCaMP6f in Kombination mit Lck-GCaMP6f, das Sezieren von Ca2 + Signale in der subzellulären Auflösung trägt, ihre Quellen zu identifizieren.
Derzeit zeigen wir das Protokoll für die Ca2 + Signal Dissektion im HeLa-Zellen und Neuron-Astrozyten Mischkulturen auf Glasdeckgläser überzogen. Die Ca2 + bildgebende Verfahren mit GECIs angegeben hier Lck-GCaMP6f, Plasma-Membran-bezogenen RCaMP210 (Lck-RCaMP2) und OER-GCaMP6f (Abbildung 1) gelten für alle Zellen, in denen diese GECIs ausgedrückt werden können.

<table><tbody><tr><td>(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycin (DHPG)</td><td>Tocris</td><td>#0342</td><td></td></tr><tr><td>0,5% DNase I Stammlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#11284932001</td><td>0,5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution herstellen&nbsp; ergänzt mit 120 mM MgSO4. Vorbereiten 160 & Mikro; L aliquotiert und bei -30 °C lagern.</td></tr><tr><td>0,5% Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#25300054</td><td></td></tr><tr><td>100 mM L-Glutamin (&mal; 100 Stock)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#25030081</td><td>Erstellung kleiner Aliquots von 250-750 & Mikro; L und bei -30 °C lagern.</td></tr><tr><td>100 mM Natriumpyruvat (&mal; 100 Lagerbestand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#11360070</td><td>Aliquots (10 mL) können bei -20 °C gelagert werden. Nach dem Auftauen kann die Lösung bei 4 & Grad gehalten werden; C für 2 Monate.</td></tr><tr><td>12-Well-Multiwell-Kulturplatten mit Deckel mit geringer Verdunstung</td><td>Falcon</td><td>#353043</td><td>Deckel mit geringer Verdunstung ist entscheidend für die Kultivierung von Neuronen-Glia-Mischkulturen. Für Zellen der Zelllinie können alternative Kulturschalen verwendet werden.</td></tr><tr><td>Runddeckgläser mit 18 mm Durchmesser</td><td>Karl Hecht "Assistent"</td><td>#41001118</td><td>Stärke 1, 18 mm Durchmesser kreisförmige Deckgläser; es können auch andere Deckgläser verwendet werden.</td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#15630080</td><td>pH 7,2-7,6</td></tr><tr><td>2,5% Trypsin-Stammlösung (&mal; 20 Lager)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T4674</td><td>Prepare 150 &micro; L aliquotieren und bei -30 °C lagern.</td></tr><tr><td>50%ige Poly(ethylenimin) (PEI)-Lösung&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P3143</td><td>Bereiten Sie eine 2%ige (V/V) PEI-Stammlösung vor (& mal ; 50) mit destilliertem Wasser, das durch Filtration sterilisiert wird. Lagerlösung bei -30 & Grad; C nach der Herstellung kleiner Aliquots von 250-750 μl. 0,04%ige PEI-Lösung mit destilliertem Wasser am Tag der Deckglasbeschichtung herstellen.</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>In einer Sprühflasche aufbewahrt, um zur Oberflächendesinfektion verwendet zu werden.</td></tr><tr><td>Adeno-assoziierte Viren (AAV) für die Lck-GCaMP6f-, Lck-RCaMP2- und OER-RCaMP2-Expression unter der Leitung des EF1a-Promotors</td><td></td><td></td><td>AAV können unter Verwendung des AAV Helper Free System (Agilent Technologies) und HEK293-Zellen oder alternativer Methoden hergestellt werden. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2 und&nbsp; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f sind auf Anfrage erhältlich.</td></tr><tr><td>B-27 Zuschlag (&times; 50 Lager)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#17504044</td><td>Diese kann durch B-27 plus Supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) oder MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland; #130-093-566) ersetzt werden.</td></tr><tr><td>B57BL/6</td><td>Japan SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera für mikroskopische Bildaufnahme</td><td></td><td></td><td>Folgende Kameras standen zur Verfügung: gekühlte CCD-Kamera (z.B. Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD-Kamera (z.B. Hamamatsu Photonics,&nbsp; ImagEM; Andor, iXon) oder&nbsp; CMOS-Kamera (z.B. Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td></tr><tr><td>Behälter zum Einfrieren von Zellen</td><td>Sarstedt K.K.</td><td>#95.64.253</td><td>Alternativer Zellen-Gefrierbehälter kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>Falcon</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td></td><td></td><td>Bei 37 > halten C, 5 % CO2.</td></tr><tr><td>Kryorohr</td><td>Corning</td><td>#430661</td><td>Alternative Kryoröhrchen können verwendet werden.</td></tr><tr><td>Kryokonservierungsmedium</td><td>Zenoaq</td><td></td><td>"CELLBANKER1"</td></tr><tr><td>Kulturmedium (für HeLa-Zellen)</td>Das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) <td></td><td></td><td>von Dulbecco, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und Penicillin-Streptomycin-Lösung (Endkonzentration: Penicillin 100 U/ml und Streptomycin 100 & Mikro; g/mL)</td></tr><tr><td>Präpariermedium&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Ein Milliliter 1 M HEPES (Endkonzentration 20 mM) auf 49 mL DMEM&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>#08456-65</td><td>Alternatives DMEM kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>#08456-65</td> DNA-Transfektionsreagenz <td>mit niedrigem Glukosegehalt</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#6366244001</td><td>"X-tremegene HP DNA-Transfektionsreagenz" Alternative Transfektionsreagenzien können verwendet werden.</td></tr><tr><td>Glas mit Deckel</td><td></td><td></td><td>500 ml Glas (für Maus) oder 1.500 ml Glas (für Ratte) zur Betäubung des Tieres&nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#14170161</td><td>HBSS frei von Calcium und Magnesium</td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes Rinderserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#10100147 HeLa-Zellen</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RIKEN BioResource Center</td><td>#RCB0007</td><td></td></tr><tr><td>Histamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H7125</td><td></td></tr><tr><td>Bildanalyse-Software</td><td></td><td></td><td>Wie Metamorph (Molecular Devices), ImageJ (NIH) und TI Workbench14 (Custom Made)&nbsp;</td></tr><tr><td>Bildteileroptik</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>#A12801-01</td><td>W-view GEMINI</td></tr><tr><td>Bildteileroptik dichroitischer Spiegel</td><td>Semrock</td><td>#FF560-FDi01-25&mal; 36</td><td>Zur Trennung von grün fluoreszierendem Protein/rot fluoreszierendem Protein&nbsp; (GFP/RFP) Signal</td></tr><tr><td>Bildaufteilungsoptik Emissionsfilter</td><td>Semrock</td><td>#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td><td>Für die Emission des GFP/RFP-Signals</td></tr><tr><td>Abbildungsmedium und Puffer</td><td></td><td></td><td>Verwenden Sie das optimale Medium oder den optimalen Puffer für das Experiment. Bei der Verwendung von Medium ist ein Medium ohne Phenolrot wünschenswert, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Fügen Sie 20 mM HEPES hinzu, um den pH-Wert außerhalb des CO2-Inkubators aufrechtzuerhalten.</td></tr><tr><td>Inkubationssalzlösung&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Fügen Sie 1 ml 1 M HEPES (20 mM) zu einem 49 mL HBSS</td></tr><tr><td>Inversen Fluoreszenzmikroskop</td><td></td><td></td><td>hinzu, z. B. IX73 (Olympus) oder&nbsp; Eclipse TI (Nikon Instech)</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Wird für die Anästhesie</td></tr><tr><td>verwendet Erhaltungsmedium (für 4 & 12 Well-Schalen)</td><td></td><td></td><td>48,5 mL Neurobasal-A Medium ergänzt mit 1 mL B-27, 500 &micro; L L-Glutamin-Bestand und 25 & micro; L Penicillin-Streptomycin-Lösung.</td></tr><tr><td>Erhaltungsmedium für gefrorene kortikale Zellen (für 1- & 12-Well-Schalen)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>12,2 mL Neurobasal plus Medium, ergänzt mit 250 & Mikro; L B-27, 125 &micro; L L-Glutamin-Bestand und 6,2 &micro; L Penicillin-Streptomycin-Lösung.</td></tr><tr><td>MEM (Minimum Essential Medium)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Filterset für GCaMP6f-Bildgebung</td><td></td><td></td><td>Geeigneter Filter für GFP (Anregung, 480 &plusmn; 10 nm; Emission, 530 &plusmn; 20 nm)</td></tr><tr><td>Mikroskop-Filterset für RCaMP2-Bildgebung</td><td></td><td></td><td>Geeigneter Filter für RFP (Anregung, 535 &plusmn; 50 nm; Emission, 590 nm Langpass)</td></tr><tr><td>Mikroskop-Filtersets für die Doppelabbildung von RCaMP2 und GCaMP6f</td><td>Semrock</td><td>#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&fach; 36, #FF01-512/630-25</td><td>Dualer Anregungsfilter, Dualer dichroitischer Spiegel und Emissionsfilter für GFP/RFP-Bildgebung.</td></tr><tr><td>Mikroskop-Heizsystem</td><td></td><td></td><td>Ein Heizsystem, um die Zellen bei 37 ° C zu halten. C während der Bildgebung. Um Drift durch Wärmeausdehnung zu vermeiden, werden Heizsysteme empfohlen, die das gesamte Mikroskop selbst abdecken (z. B. Tokai Hit, Thermobox).</td></tr><tr><td>Mikroskop-Lichtquelle zur Anregung</td><td></td><td></td><td>Quecksilberlampe (100 W), Xenonlampe (75 W), Leuchtdiode (LED) Beleuchtungssystem (z. B. CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wellenlängen-LED-Quelle; Lumencor, SPECTRA X Light Engine). Im Falle von Quecksilberklumpen und Xenonlampen verwenden Sie einen ND-Filter, um die Anregungsintensität zu reduzieren.</td></tr><tr><td>Das</td><td></td><td></td><td>Plan-Apochromat Öl-Immersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von mehr als 1,3 wird dringend für die Aufzeichnung der spontanen Ca2+-Aktivität in Neuronen und Astrozyten empfohlen.</td></tr><tr><td>Neurobasal plus medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A3582901</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#10888022</td><td>Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) kann anstelle von Neurobasal-A Medium verwendet werden.</td></tr><tr><td>PBS(-): Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, frei von Ca2+ und Mg2+&nbsp;</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td><td>#164-23551</td><td>Das Fehlen von Ca2+ und Mg2+ ist entscheidend, um die Trypsinaktivität nicht zu hemmen. Eine Alternative zu PBS(-) kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>PC- und Bilderfassungssoftware</td><td></td><td></td><td>wie Metamorph (Molecular Devices); Mikromanager; TI Workbench14.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#15140122</td><td>Penicillin 10.000 U/ml und Streptomycin 10.000 & Mikro; g/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Plasmid für die Expression von Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 und OER-RCaMP2 unter dem Cytomegalievirus-Promotor 7-9</td><td>Auf Anfrage erhältlich</td>Plattierungsmedium (für 4- & 12-Well-Gerichte<td></td><td></td></tr><tr><td>)</td><td></td><td></td><td>48 mL MEM, ergänzt mit 1 mL B-27 Supplement, 500 &micro; L L-Glutamin Bestand (Endkonzentration: 2 mM), 500 &micro; L Natriumpyruvat-Stamm (1 mM) und 25 &micro; L Penicillin-Streptomycin-Lösung (Penicillin 5 U/ml, Streptomycin 5 & Mikro; g/mL). Diese Konzentration von Penicillin-Streptomycin, die 1/20 von&nbsp; Die vom Hersteller empfohlene Konzentration ist entscheidend für das Überleben der Neuronen.</td></tr><tr><td>Aufnahmekammer</td><td>Elveflow</td><td>Ludin-Kammer</td><td>Diese Aufnahmekammer ist für runde Deckgläser mit einem Durchmesser von 18 mm.</td></tr><tr><td>Reduziertes Serummedium</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11058021</td><td>Opti-MEM</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td></td><td></td><td>Wird zum Präparieren von Hippocampus verwendet. Olympus SZ60 oder gleichwertige Stereomikroskope sind erhältlich.</td></tr><tr><td>Chirurgische Instrumente</td><td></td><td></td><td>Standard-Präparierschere zum Schneiden des Bauches einer Maus oder Ratte, Pinzette zum Einklemmen der Gebärmutter, feine Präparierschere zum Durchtrennen der Gebärmutter und des Kopfes des Embryos, Ringzange zum Einklemmen der Embryonen, 13 cm gebogene Semken-Zange (Fine Science Tools #11009-13) zur Entnahme von Gehirnen&nbsp; 3 Pinzetten mit feinen Spitzen&nbsp; (Dumont Inox #5)</td></tr><tr><td>Transfektionsreagenz für Neuronen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#L3000008</td><td>"Lipofectamine 3000" Reagenz. Es besteht aus dem "Supplement (P3000)", das in Schritt 2.2.3 mit Plasmid-DNA gemischt werden sollte, und dem "Transfektionsreagenz (Lipofectamine 3000)", das in Schritt 2.2.4 verwendet wird.</td></tr><tr><td>Trypanblau (0,4%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#15250061</td><td></td></tr><tr><td>Waschmedium für gefrorene kortikale Zellen&nbsp;</td><td></td><td></td><td>25 mL DMEM, ergänzt mit 250 & micro; L hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum + 12,5 &micro; L Penicillin Streptomycin.</td></tr><tr><td>Wistar Ratten</td><td>Japan SLC, Inc</td><td></td><td>Trächtige Ratten (E18)</td></tr></tbody></table>

dissektion der lokalen ca2 + signale in kultivierten zellen durch die membran-gezielte ca2 + indikatoren

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium-Ion (Ca2 +) ist eine universelle intrazelluläre Messenger-Molekül, das mehrere Signalwege, führt zu vielfältigen biologischen Ausgänge treibt. Die Koordination der beiden Ca2 + Signalquellen – "Ca2 + Zustrom" von außerhalb der Zelle und "Ca2 + Release" von der intrazellulären Ca2 + speichern endoplasmatische Retikulum (ER) – gilt die vielfältigen räumlich-zeitliche Muster von Ca zugrunde liegen 2 + Signale, die mehrere biologische Funktionen in Zellen verursachen. Dieses Protokoll soll ein Ca2 + bildgebendes Verfahren zu beschreiben, das ermöglicht die Überwachung der Augenblick der "Ca2 + Zustrom" und "Ca2 + release". OER-GCaMP6f ist ein genetisch codierte Ca2 + Indikator (GECI) bestehend aus GCaMP6f, die auf der äußeren Membran ER ausgerichtet ist. OER-GCaMP6f kann Ca2 + Version auf eine höhere zeitliche Auflösung als herkömmliche GCaMP6f überwachen. In Kombination mit der Plasmamembran ausgerichtete GECIs, kann die räumlich-zeitliche Ca2 + Signalmuster mit einer subzellulären Auflösung beschrieben werden. Die subzelluläre gezielt Ca2 + Indikatoren hier beschrieben sind, im Prinzip für alle Zelltypen, auch für die in-vivo von Caenorhabditis Elegans Neuronen imaging. In diesem Protokoll wir Ca2 + Bildgebung in Zellen von Zelllinien, Neuronen und Gliazellen bei dissoziierten Primärkulturen einzuführen, und die Vorbereitung der gefrorenen Bestand an Ratte kortikale Neuronen beschreiben.

LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f wurden in HeLa-Zellen ausgedrückt, und beide Signale gleichzeitig mit Bild-splitting Optik, 24 h nach Transfektion (Abb. 3A und Video 1) aufgezeichnet wurden. Die Bilder wurden bei 10 Hz. Histamin (seiner 1 µM), die induziert Ca2 + Entlassung aus der Notaufnahme, wurde hinzugefügt, während der Aufnahme erworben. Auf Antrag seiner erhöht die Signalintensität von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f, dargestellt durch die Pseudofarben Anzeige von ΔF/F0, die die Änderung von der ursprünglichen Fluoreszenzintensität (Abb. 3 b) darstellt. Die Zeit-Kurse von Ca2 + Höhe (ΔF/F0) berichtet von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f wurden in der gleichen Region of Interest (ROI) (Abbildung 3) verglichen. Die ΔF/F0-Werte wurden auf ihre Spitzenwerte der Zeit Kurs Vergleich zwischen die zwei verschiedenen GECIs ermöglichen die verschiedenen Ausdruck Niveaus und Distributionen haben normalisiert. Beide Sensoren berichtet eine Schwingung wie Ca2 + Höhe. LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f zeigte den gleichen zeitlichen Verlauf für Ca2 + Höhe in zwei Zellen unter den fünf Zelle Arten untersucht (Abbildung 3, ROI 1 und 3). Ca2 + Erhebungen gezeigt von Lck-RCaMP2 blieb jedoch auf einer höheren Ebene im Vergleich dazu von OER-GCaMP6f (Abb. 3 C, ROI, 2, 4 und 5) gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Ca2 + Höhe in der Nähe der Plasmamembran verlängert wird, während es früher um das ER gekündigt wird, welches ist die Quelle dieses Ca2 + Signal induziert durch seine Stimulation.
Spontane Ca2 + -Signale von Astrozyten in der Neuron-Astrozyten gemischte Kultur von Ratte Hippokampi (Abbildung 4A) und Cortexes (Abbildung 4 b) zeigten sich von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f (Abbildung 4, Video 2, Video 3 , 4 Videound Video 5). Kortikale Kulturen wurden aus dem gefrorenen bestand wieder belebt, die vorbereitet wurde, wie in diesem Protokoll beschrieben. LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f Signale wurden nacheinander bei 2 Hz aus den gleichen Zellen aufgenommen. Drei ROIs in der Gegend, die Ca2 + Höhe zeigte von jedem GECI ausgewählt wurden, und der zeitlichen Verlauf der ΔF/FBasis (d. h. der Fluoreszenzintensität) geändert von der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität während der gesamten Aufzeichnungsdauer (FBasis ). Wenn die Basislinie Fluoreszenz stabil ist und Ca2 + Höhen seltener sind, wird FBasis eine nützliche Grundlage für Ca2 + Höhe-Ereignisse zu erkennen. Spontane Ca2 + Höhen waren sichtbar, nur bei den astrocytic Process, nicht an den Zellkörper. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der früheren Berichten über astrocytic spontan Ca2 + Signale von anderen GECIs visualisierte in-vitro-13 und in-vivo-14. Im Hippokampus und kortikalen Astrozyten waren Ca2 + Erhebungen gezeigt von Lck-RCaMP2 (oben) häufiger als diejenigen von OER-GCaMP6f gezeigt. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit unserer früheren Demonstration, dass Ca2 + Erhebungen in Astrozyten durch Lck-GCaMP6f häufiger als die durch OER-GCaMP6f7 erkannt wurden und legt nahe, dass dieser Begriff auch auf die einzellige Ebene.
Spontane Ca2 + Höhen von Lck-GCaMP6f in unreifen Ratte hippocampal Neuronen (10 DIV) wurden bei 2 Hz (Abb. 5A und Video 6) gesehen. Die Zeit-Kurse von ΔF/F0 in fünf verschiedenen ROIs legen nahe, dass diese Ca2 + Erhebungen vor Ort auf der subzellulären Domänen beschränkt sind. Abbildung 5 b (Video 7) zeigt die Ca2 + Antworten in reife Maus hippocampal Neuronen (30 DIV) mit OER-GCaMP6f-Ausdruck AAV-Vektoren infiziert. Neuronen wurden mit 100 µM DHPG, stimuliert die Agonisten für metabotropen Glutamatrezeptoren, induzierende Ca2 + Release ist. DHPG-induzierte Ca2 + Freigabe durch OER-GCaMP6f wurde erkannt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> Abbildung 1: Diagramm mit Membran-gezielte GECIs. Schematische Darstellung der Plasmamembran ausgerichtete GECIs (Lck-GCaMP6f und Lck-RCaMP2) und äußeren ER Membran-bezogenen GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> Abbildung 2: Flussdiagramm für hippocampal und kortikalen Zelle Vorbereitung, Plasmid Transfektion und AAV Infektion. Die mikroskopischen Aufnahmen sind repräsentativ, frisch vergoldeten DIV-6 kortikale Zellen (links) und Zellen aus dem gefrorenen bestand (rechts) wiederbelebt. Maßstabsleiste = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> Abbildung 3: Beispiel für die gleichzeitige Darstellung von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f in HeLa-Zellen. (A) schematische Darstellung der Signaltrennung mit Bild-splitting-Optik. Die gleiche Sichtfeld für Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f wird gleichzeitig an der Kamera projiziert. Eine repräsentative Aufnahme erworben bei 10 Hz mit einer CMOS-Kamera finden Sie in Video 1, und ein Bild von dieser Aufnahme ist in zentrale A (rechts) angezeigt. (B) Pseudo-farbige Bilder von ΔF/F0 für Lck-GCaMP2 (oben) und OER-GCaMP6f (unten). Histamin (seiner, 1 µM) wurde am 0 S. (C) Vertreter normalisierten ΔF/F0 zeitlichen Verlauf der Lck-GCaMP2 (Magenta) und OER-GCaMP6f (grün) hinzugefügt. Daten wurden auf den maximalen ΔF/F0-Wert für jedes Grundstück normalisiert. Der graue Balken zeigt den Zeitpunkt seines Antrags. Daten wurden mit einer maßgeschneiderten Software TI Workbench15analysiert. Maßstabsleiste = 50 µm (mikroskopische Bild).  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> Abbildung 4: Spontane Ca2 + Höhe in Astrozyten überwacht Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f. (A) Vertreter hippocampal und (B) kortikale Astrozyten transfiziert mit Lck-RCaMP2 (oben) und OER-GCaMP6f (unten). Kortikale Zellen wurden aus gefrorenen Stammkulturen wiederbelebt. LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f Bilder wurden nacheinander in derselben Zelle, bei 2 Hz mit einer EM-CCD Kamera erworben. Die Grundstücke auf dem linken erscheinen die Zeit Kurse von ΔF/Nutzun ROIs gemessen in das mikroskopische Bild angegeben. Daten wurden mit TI-Workbench analysiert. Aktuelle Filme werden in Video 2, Video 3 Video 4und 5 Videobereitgestellt. Die Maßstabsleiste = 20 µm (mikroskopische Bild). Die Baseline Drift schlägt die Änderungen in der globalen Ca2 + Ebene in der Zelle.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> Abbildung 5: Beispiele für Ca2 + Bildgebung in Neuronen mit Lck-GCaMP6f und OER-GCaMP6f. (A) repräsentative Ratte hippocampal Neuronen Lck-GCaMP6f DIV 10 (links) und Grundstücke zeigt die Zeit, die Kurse von ΔF/F0 gemessen in ROIs (gelbe Kreise) angegeben worden im Bild (rechts) zum Ausdruck zu bringen. Die Zahlen in den zeitlichen Verlauf entsprechen die ROI-Zahlen im Bild. Beachten Sie, dass das zeitliche Muster der Ca2 + Höhe unterschiedlich zwischen den verschiedenen Regionen von Interesse ist. Die Baseline Drift schlägt die Erhöhung der globalen Ca2 + Ebene in diesem Neuron. (B) ein Beispiel für reife Maus hippocampal Neuronen (DIV 30) infiziert mit OER-GCaMP6f Ausdruck AAV Vektoren (links). Die Zeit, die Kurs-Plot von ΔF/F0 gemessen Ca2 + Antwort bis 100 µM zeigt angewendet (RS) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG) auf das Timing durch die graue Leiste angezeigt. Gelbe Kreise zeigen die Position des ROIs, der zeitlichen Verlauf ermittelt wurden. Die Bilder wurden bei 2 Hz mit einer gekühlten CCD Kamera (zentrale A) oder einer EM-CCD-Kamera (Gruppe B) erworben und mit TI-Workbench analysiert. Maßstabsleiste = 20 µm (mikroskopische Bild). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> Video 1: Beispiel für gleichzeitige Darstellung von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f in HeLa-Zellen. Repräsentative Aufnahme bei 10 Hz erworben und in Abbildung 3dargestellt. Maßstabsleiste = 50 µm.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> Video 2: Spontane Ca2 + Transient in Lck-RCaMP2 im Hippokampus Astrozyten beobachtet. Repräsentative Aufnahme erworben bei 2 Hz (Abb. 4A), aufgenommen im gleichen Sichtfeld als Video 3. Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> Video 3: Spontane Ca2 + Transient in OER-GCaMP6f im Hippokampus Astrozyten beobachtet. Repräsentative Aufnahme bei 2 Hz (Abb. 4A), im gleichen Sichtfeld als Video 2erworben. Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> Video 4: Spontane Ca2 + Transient in Lck-RCaMP2 in einer kortikalen Astrozyten beobachtet repräsentative Aufnahme erworben bei 2 Hz (Abbildung 4 b), aufgenommen im gleichen Sichtfeld als Video 5. Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> Video 5: Spontane Ca2 + Transient beobachtet in OER-GCaMP6f in einer kortikalen Astrozyten. Repräsentative Aufnahme bei 2 Hz (Abbildung 4 b), im gleichen Sichtfeld als Video 4erworben. Die Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> Video 6: Beispiel für Ca2 + Bildgebung in einem hippocampal Ratte Neuron (DIV 10) von Lck-GCaMP6f. Beispiel für neuronale Ca2 + -Signale aufgezeichnet bei 2 Hz (Abb. 5A). Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> Video 7: Ca2 + Release in einem Maus hippocampal Neuron (DIV 30) mit dem Ausdruck OER-GCaMP6f. Beispiel für neuronale Ca2 + Signale aufgezeichnet in einem Maus hippocampal Neuron mit OER-GCaMP6f Ausdruck AAV Vektoren (Abb. 5 b) infiziert. Das Neuron wurde angeregt, mit 100 µM Dihydroxyphenylglycine (DHPG) angewendet um 30 s, Ca2 + Entlassung aus der Notaufnahme zu erwähnen. Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.</a>

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Ca2 + Bildgebung in Neuronen und Gliazellen, die das Sezieren von Ca2 + Signale in subzellulären Auflösung ermöglicht. Dieser Prozess gilt für alle Zelltypen, die die Expression von genetisch codierte Ca2 + Indikatoren zu ermöglichen.

Dissektion der lokalen Ca2 + Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca2 + Indikatoren

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Die Zerlegung von Calciumsignalen bei subzellulärer Auflösung ist einer der wichtigsten Schritte zur Dekodierung intrazellulärer Calciumsignale, die das biologische Ausgangsphänomen bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt eine neue Calcium-Bildgebungsmethode, die die Überwachung des Moments des Kalziumzuflusses und der Kalziumfreisetzung ermöglicht. Dieses Protokoll gilt für alle Zelltypen, die die Expression genetisch kodierter Kalziumindikatoren ermöglichen.Wir glauben, dass unsere Methode das Potenzial hat, auf die Sezieren von Kalziumsignalen bei der subzellulären Auflösung bei lebenden Tieren in der Laborkultur erweitert zu werden. Um das Verfahren zu demonstrieren, hilft Matsumi Hirose, ein Techniker aus unserem Labor. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie 18 Millimeter Durchmesser Glasabdeckung schlupf in jedem Brunnen einer 12 Brunnenplatte.Verwenden Sie sterilisiertes Wasser und bereiten Sie 12,5 Milliliter einer 0,4%PEI-Lösung für jede verwendete 12 Wellplatte vor. Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter der PEI-Lösung hinzu und stellen Sie sicher, dass sich unter den Deckelzetteln keine Blasen befinden. Inkubieren Sie über Nacht in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius.Verwenden Sie am nächsten Tag einen Aspirator, um die PEI-Lösung zu entfernen. Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter sterilisiertes Wasser hinzu und schütteln Sie die Platte so, dass die PEI-Lösung zwischen Deckelschlupf und Platte gründlich ausgewaschen wird. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zwei weitere Male mit frischem sterilisiertem Wasser.Nach der letzten Wäsche, das Wasser aus jedem Brunnen vollständig aspirieren. Verwenden Sie ein ultraviolettes Licht, um die Abdeckungsrutschen für mindestens 15 Minuten zu trocknen und zu sterilisieren. Die PEI-beschichtete Schale kann bis zu zwei Monate bei vier Grad Celsius gelagert werden.Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, beleuchten Sie die Gerichte mit dem ultravioletten Licht für 15 Minuten, kurz vor Dem Gebrauch. Fügen Sie fünf Milliliter steriles destilliertes Wasser in den Raum zwischen den Brunnen, um verdunsten des Kulturmediums zu verhindern. Waschen Sie zunächst die Kortizes mit Inkubationskochin.Dann inkubieren Sie die Kortiken mit Trypsin und DNAse in Inkubationssaline für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Dann waschen Sie die Kortizes dreimal mit eiskalter Inkubationskochin. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie zwei Milliliter Beschichtungsmedium mit 150 Mikroliter DNAse I Lager ergänzt.Dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie zwanzigmal oder weniger Pipetten und filtern Sie die Zellen durch ein Zellsieb mit einer Porengröße von 70 Mikrometern. Als nächstes waschen Sie das Zellsieb mit 20 Milliliterdes Beschichtungsmedium. Für die Herstellung von gefrorenen Zellvorräten die Zellen mit 20 Millilitern des Waschmediums waschen.Verdünnen Sie die kortikalen Zellen mit einem Beschichtungsmedium auf eine Dichte von 140 000 lebensfähigen Zellen pro Milliliter. Dann fügen Sie einen Milliliter der verdünnten Zellsuspension zu den PEI-beschichteten Abdeckungsscheinen in den 12 Brunnenkulturplatten hinzu. Halten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator für zwei bis drei Tage.Wenn die Zellen stabil sind, zwei bis drei Tage nach der Beschichtung, ändern Sie das Kulturmedium auf das Wartungsmedium. Für die Herstellung von gefrorenen Zellvorräten, spinn die Zelle, mit einem Schwenkrotor, um die Zellen bei 187 mal G für drei Minuten zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie das Kryokonservierungsmedium hinzu, das bei vier Grad Celsius gehalten wird, um eine Zelldichte von 10 Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten.Aliquot einen Milliliter der Zellsuspension in kryogene Röhren. Legen Sie die Rohre in einen Zellgefrierbehälter mit einer Gefrierrate von minus einem Grad Celsius pro Minute, bis eine Temperatur von minus 80 Grad Celsius erreicht ist. Den Gefrierbehälter bei minus 80 Grad Celsius in einen Gefrierschrank geben.Um die gefrorenen Zellen wiederzubeleben, erwärmen Sie das Waschmedium und das Pflegemedium für gefrorene kortikale Zellen. Als nächstes tauen Sie die gefrorenen Zellen schnell in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf. Verdünnen Sie die Zellen mit vorgewärmtem Waschmedium und Zentrifuge mit einem Schwenkrotor bei 187 mal G für drei Minuten.Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Waschmedium wieder auf und messen Sie die lebensfähige Zelldichte. Verdünnen Sie dann die Zellen mit dem Erhaltungsmedium für gefrorene kortikale Zellen, um eine Zelldichte von 300 000 Zellen pro Milliliter zu ergeben. Einen Milliliter dieser Zellsuspension in die Brunnen der PEI-beschichteten 12 Brunnenplatten geben.Zur Transfektion drei bis acht Tage nach der Beschichtung, beschriften Sie zwei Röhren, eine für Plasma-DNA und die andere für das Transfektionsreagenz. Fügen Sie 50 Mikroliter reduziertes Serummedium pro Brunnen zu jedem Rohr hinzu. Fügen Sie 0,5 Mikrogramm Plasma-DNA pro Abdeckungsschlupf und einen Mikroliter Ergänzung mit Transfektionsreagenz für Neuronen, pro Brunnen in die Plasma-DNA-Röhre.Für die Co-Transfektion von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f, mischen Sie 0,5 Mikrogramm jedes Plasmids und einen Mikroliter Ergänzung in 50 Mikroliter reduzierten Serummedium pro Brunnen. Als nächstes fügen Sie dem Transfektionsreagenz tube einen Mikroliter Transfektionsreagenz pro Brunnen hinzu. Wirbel beide Rohre für ein bis zwei Sekunden.Fügen Sie dann die Transfektionsreagenz-Mischung in die DNA-Mischung ein. Rohrleitung vorsichtig mischen und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubieren. Laden Sie diese Mischung tropfenweise auf die Zellen.Inkubieren Sie in einem Kohlendioxid-Inkubator für zwei bis drei Tage, bis die Markerproteine exprimiert werden. Mischen Sie L und O, um die AAC-Infektion zu machen. Fügen Sie der gemischten Neuron-Astrozyten-Kultur drei Mikroliter AAC pro Brunnen hinzu.Schaukeln Sie die Schale sanft zu mischen. Bewahren Sie die Kultur ein bis zwei Wochen, bis die GECIs zum Ausdruck gebracht werden. Montieren Sie zunächst den Abdeckschein mit den mit Lck-RCaMP2 und OER-CaMPG6f transfizierten Zellen in die Aufnahmekammer des Mikroskops.Fügen Sie 400 Mikroliter des Bildmediums hinzu und legen Sie einen Deckel auf die Kammer. Wählen Sie den Filtersatz für GCaMP6f und die Lichtquelle aus. Suchen Sie die Astrozyten, die OER-GCaMP6f exdrücken.Wählen Sie als Nächstes einen Filtersatz und eine Lichtquelle für RCaMP2 aus und bestätigen Sie, ob Lck-RCaMP2 in den gleichen Astrozyten ausgedrückt wird. Zeichnen Sie Zeitrafferbilder von Lck-RCaMP2 bei zwei Hertz für zwei Minuten auf und speichern Sie die Bilddaten. Danach ändern Sie den Filtersatz zurück zu GCaMP6f.Zeichnen Sie Zeitrafferbilder von OER-GCaMP6f bei zwei Hertz für zwei Minuten auf und speichern Sie die Bilddaten. In dieser Studie werden Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f in HeLa-Zellen exprimiert und beide Signale wurden 24 Stunden nach der Transfektion gleichzeitig mit Bildspaltoptik aufgezeichnet. Durch die Zugabe von Histamin erhöhte sich die Signalintensität von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f.Die von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f gemeldeten Zeitkurse der Calciumionenhöhe werden in den gleichen Interessengebieten verglichen. Beide Sensoren berichten von einer oszillierenden Kalziumionenhöhe. Und beide zeigen den gleichen Zeitverlauf in zwei der fünf untersuchten Zellen.Die von Lck-RCaMP2 dargestellten Calciumionenhöhen bleiben jedoch in den anderen Zellen auf dem höheren Niveau als OER-GCaMP6f. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Calciumionenhöhe in der Nähe der Plasmamembran verlängert wird, während sie früher um den ER beendet wird, das die Quelle dieses Kalziumionensignals ist, das durch Histaminstimulation induziert wird. Spontane Calciumionensignale von Astrozyten in der Neuron-Astrozyten-Mischkultur von Ratten-Hippocampi und Kortiken werden von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f gezeigt.Spontane Kalziumionenerhöhungen sind nur im astrozytischen Prozess sichtbar, nicht am Zellkörper, der mit früheren Berichten übereinstimmt. Spontane Calciumionenerhöhungen von Lck-GCaMP6f in unreifen Hippocampus-Neuronen der Ratte sind bei zwei Hertz zu sehen. Die Zeitkurse für fünf verschiedene Interessensgebiete deuten darauf hin, dass diese Erhebungen lokal auf die subzellulären Domänen beschränkt sind.Reife Maus-Hippocampus-Neuronen, die mit OER-GCaMP6f-Expression AAV-Vektoren infiziert sind, zeigen Kalziumionenreaktionen als Reaktion auf die Zugabe von DHPG. Bei der Kalzium-Bildgebung ist die Anregungsstärke der kritischste Faktor. Bitte halten Sie das Anregungslicht so gering wie möglich, um Photobleichungen und Phototoxizität zu vermeiden.Die Quelle der Calciumsignale kann von Pomakorzi mit spezifischen Inhibitoren an Kalziumkanälen weiter bestätigt werden. Die Dekodierung von Kalziumsignalen, um einen bestimmten Ausgang zu evozieren, war eine grundlegende biologische Frage. Diese Kalzium-Bildgebungstechnik ebnet den Weg, um die Vielfalt der intrazellulären Calciumsignale zu beschreiben.

dissection-local-ca2-signals-cultured-cells-membrane-targeted-ca2

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Das endoplasmatische Retikulum spielt eine wichtige Rolle in Protein Biogenese und in Calcium-Homöostase. Wir haben ein experimentelles System, das uns auf die Rolle der Ca2 +-Kanäle Leck-Adresse und ihrer vermeintlichen Regulationsmechanismen charakterisieren lässt etabliert. Dieses System beinhaltet siRNA-vermittelten Gen-Silencing-und Live-Cell-Ca2 +-Imaging.

Live Cell Imaging mit Calcium siRNA vermittelte Gene Silencing Combined Identifiziert Ca 2 + Leck-Kanäle in der ER-Membran und deren Regulationsmechanismen

Echtzeit-Bildgebung von Zellen mit dem lipophilen Farbstoff FM1-43 ausgesetzt ermöglicht eine präzise Bestimmung der Kinetik durch die porenbildende Toxine sind von der Plasmamembran entfernt. Dies ist ein empfindlicher Test, der verwendet werden kann, um Anforderungen für die Ca 2 +, Sphingomyelinase und anderen Faktoren auf die Plasmamembran Reparatur zu beurteilen.

Live-Imaging-Assay für die Bewertung der Rollen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sphingomyelinase und in der Reparatur von Pore Toxin-bildenden Wunden

Ca2 + Signalweg reguliert verschiedene biologische Prozesse in Pflanzen. Hier präsentieren wir Ansätze zur Überwachung abiotischen Stress induziert räumliche und zeitliche Ca 2 +-Signale in Arabidopsis Zellen und Geweben unter Verwendung der genetisch codierten Ca2 +-Indikatoren Aequorin oder Case12.

Mess räumliche und zeitliche Ca 2 + Signale in Arabidopsis-Pflanzen

Hier präsentieren wir Techniken zur Abbildung lokaler IP3-vermittelter Ca2+-Ereignisse mittels Fluoreszenzmikroskopie in intakten Säugetierzellen, die mit Ca2+-Indikatoren beladen sind, zusammen mit einem Algorithmus, der die Identifizierung und Analyse dieser Ereignisse automatisiert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Derzeit werden die meisten verfügbaren Kalziumindikatoren verwendet, um zytoplasmatische Kalziumtransienten als indirekte Maße für das aus dem sarkoplasmatischen Retikulum freigesetzte Kalzium in kultivierten glatten Muskelzellen zu quantifizieren. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines spezifischen FRET-basierten Indikators, der die direkte Messung von Calciumsignalen innerhalb des sarkoplasmatischen Retikulumlumens ermöglicht.

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Hier beschreiben wir eine Methodik, um eine reine Population von menschlichen Myoblasten aus erwachsenem Muskelgewebe zu erhalten. Diese Zellen werden verwendet, um die In-vitro- Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen und insbesondere Proteine ​​zu untersuchen, die an der Ca 2+ -Signalisierung beteiligt sind.

Isolierung von menschlichen Myoblasten, Beurteilung der myogenen Differenzierung und speicherbetriebenen Kalziumeintrittsmessung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von einem oder mehreren Plasma und/oder intrazellulären Membranproteinen mit Grundzustand Erschöpfung (GSD) Super-Auflösung Mikroskopie in Säugerzellen. Hier besprechen wir die Vorteile und die Überlegungen der Verwendung solcher Ansätze zur Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Proteinen.

Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bild Kalzium signalisieren in den Populationen der einzelnen Zelltypen bei der murinen neuromuskulären Synapse.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

Genetisch codierte Ca2 + Indikatoren (GECIs) haben sich radikal verändert wie in-situ Ca2 + Bildgebung durchgeführt wird. Um die Wiederherstellung von Daten aus solchen Aufnahmen zu maximieren, ist die entsprechende Analysen von Ca2 + Signale erforderlich. Die Protokolle in diesem Papier erleichtern die Quantifizierung von Ca2 + Signale an Ort und Stelle mit räumlich-zeitliche Zuordnung und partikelbasierten Analyse aufgezeichnet.

Anwendungen der räumlich-zeitliche Zuordnung und Partikel-Analyse-Techniken zu quantifizieren, intrazellulären Ca2 + Signalisierung In Situ

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Verfügung, um anfängliche lokale Ca2+ -Signale, sogenannte Ca2+ -Mikrodomänen, in primären murinen und humanen T-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie aufzuklären. Dieses Protokoll dient als wertvolle Ressource für Forscher, die die Ca2+ -Signalwege in Immunzellen untersuchen und ihre Funktion weiter entschlüsseln können.

Bildgebung von anfänglichen Ca2+ -Mikrodomänen in primären T-Zellen

Lernen Sie die Calcium-Imaging-Methode zur Untersuchung lokaler Ca²⁺-Signale in Neuronen und Gliazellen. Dieses Protokoll ermöglicht die Echtzeitüberwachung subzellulärer Calciumdynamiken.

Dissektion der lokalen Ca^{2 +} Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca^{2 +} Indikatoren

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