Dissektion der lokalen Ca^{2 +} Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca^{2 +} Indikatoren

Die Zerlegung von Calciumsignalen bei subzellulärer Auflösung ist einer der wichtigsten Schritte zur Dekodierung intrazellulärer Calciumsignale, die das biologische Ausgangsphänomen bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt eine neue Calcium-Bildgebungsmethode, die die Überwachung des Moments des Kalziumzuflusses und der Kalziumfreisetzung ermöglicht. Dieses Protokoll gilt für alle Zelltypen, die die Expression genetisch kodierter Kalziumindikatoren ermöglichen.

Wir glauben, dass unsere Methode das Potenzial hat, auf die Sezieren von Kalziumsignalen bei der subzellulären Auflösung bei lebenden Tieren in der Laborkultur erweitert zu werden. Um das Verfahren zu demonstrieren, hilft Matsumi Hirose, ein Techniker aus unserem Labor. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie 18 Millimeter Durchmesser Glasabdeckung schlupf in jedem Brunnen einer 12 Brunnenplatte.

Verwenden Sie sterilisiertes Wasser und bereiten Sie 12,5 Milliliter einer 0,4%PEI-Lösung für jede verwendete 12 Wellplatte vor. Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter der PEI-Lösung hinzu und stellen Sie sicher, dass sich unter den Deckelzetteln keine Blasen befinden. Inkubieren Sie über Nacht in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Verwenden Sie am nächsten Tag einen Aspirator, um die PEI-Lösung zu entfernen. Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter sterilisiertes Wasser hinzu und schütteln Sie die Platte so, dass die PEI-Lösung zwischen Deckelschlupf und Platte gründlich ausgewaschen wird. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zwei weitere Male mit frischem sterilisiertem Wasser.

Nach der letzten Wäsche, das Wasser aus jedem Brunnen vollständig aspirieren. Verwenden Sie ein ultraviolettes Licht, um die Abdeckungsrutschen für mindestens 15 Minuten zu trocknen und zu sterilisieren. Die PEI-beschichtete Schale kann bis zu zwei Monate bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, beleuchten Sie die Gerichte mit dem ultravioletten Licht für 15 Minuten, kurz vor Dem Gebrauch. Fügen Sie fünf Milliliter steriles destilliertes Wasser in den Raum zwischen den Brunnen, um verdunsten des Kulturmediums zu verhindern. Waschen Sie zunächst die Kortizes mit Inkubationskochin.

Dann inkubieren Sie die Kortiken mit Trypsin und DNAse in Inkubationssaline für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Dann waschen Sie die Kortizes dreimal mit eiskalter Inkubationskochin. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie zwei Milliliter Beschichtungsmedium mit 150 Mikroliter DNAse I Lager ergänzt.

Dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie zwanzigmal oder weniger Pipetten und filtern Sie die Zellen durch ein Zellsieb mit einer Porengröße von 70 Mikrometern. Als nächstes waschen Sie das Zellsieb mit 20 Milliliterdes Beschichtungsmedium. Für die Herstellung von gefrorenen Zellvorräten die Zellen mit 20 Millilitern des Waschmediums waschen.

Verdünnen Sie die kortikalen Zellen mit einem Beschichtungsmedium auf eine Dichte von 140 000 lebensfähigen Zellen pro Milliliter. Dann fügen Sie einen Milliliter der verdünnten Zellsuspension zu den PEI-beschichteten Abdeckungsscheinen in den 12 Brunnenkulturplatten hinzu. Halten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator für zwei bis drei Tage.

Wenn die Zellen stabil sind, zwei bis drei Tage nach der Beschichtung, ändern Sie das Kulturmedium auf das Wartungsmedium. Für die Herstellung von gefrorenen Zellvorräten, spinn die Zelle, mit einem Schwenkrotor, um die Zellen bei 187 mal G für drei Minuten zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie das Kryokonservierungsmedium hinzu, das bei vier Grad Celsius gehalten wird, um eine Zelldichte von 10 Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten.

Aliquot einen Milliliter der Zellsuspension in kryogene Röhren. Legen Sie die Rohre in einen Zellgefrierbehälter mit einer Gefrierrate von minus einem Grad Celsius pro Minute, bis eine Temperatur von minus 80 Grad Celsius erreicht ist. Den Gefrierbehälter bei minus 80 Grad Celsius in einen Gefrierschrank geben.

Um die gefrorenen Zellen wiederzubeleben, erwärmen Sie das Waschmedium und das Pflegemedium für gefrorene kortikale Zellen. Als nächstes tauen Sie die gefrorenen Zellen schnell in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf. Verdünnen Sie die Zellen mit vorgewärmtem Waschmedium und Zentrifuge mit einem Schwenkrotor bei 187 mal G für drei Minuten.

Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Waschmedium wieder auf und messen Sie die lebensfähige Zelldichte. Verdünnen Sie dann die Zellen mit dem Erhaltungsmedium für gefrorene kortikale Zellen, um eine Zelldichte von 300 000 Zellen pro Milliliter zu ergeben. Einen Milliliter dieser Zellsuspension in die Brunnen der PEI-beschichteten 12 Brunnenplatten geben.

Zur Transfektion drei bis acht Tage nach der Beschichtung, beschriften Sie zwei Röhren, eine für Plasma-DNA und die andere für das Transfektionsreagenz. Fügen Sie 50 Mikroliter reduziertes Serummedium pro Brunnen zu jedem Rohr hinzu. Fügen Sie 0,5 Mikrogramm Plasma-DNA pro Abdeckungsschlupf und einen Mikroliter Ergänzung mit Transfektionsreagenz für Neuronen, pro Brunnen in die Plasma-DNA-Röhre.

Für die Co-Transfektion von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f, mischen Sie 0,5 Mikrogramm jedes Plasmids und einen Mikroliter Ergänzung in 50 Mikroliter reduzierten Serummedium pro Brunnen. Als nächstes fügen Sie dem Transfektionsreagenz tube einen Mikroliter Transfektionsreagenz pro Brunnen hinzu. Wirbel beide Rohre für ein bis zwei Sekunden.

Fügen Sie dann die Transfektionsreagenz-Mischung in die DNA-Mischung ein. Rohrleitung vorsichtig mischen und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubieren. Laden Sie diese Mischung tropfenweise auf die Zellen.

Inkubieren Sie in einem Kohlendioxid-Inkubator für zwei bis drei Tage, bis die Markerproteine exprimiert werden. Mischen Sie L und O, um die AAC-Infektion zu machen. Fügen Sie der gemischten Neuron-Astrozyten-Kultur drei Mikroliter AAC pro Brunnen hinzu.

Schaukeln Sie die Schale sanft zu mischen. Bewahren Sie die Kultur ein bis zwei Wochen, bis die GECIs zum Ausdruck gebracht werden. Montieren Sie zunächst den Abdeckschein mit den mit Lck-RCaMP2 und OER-CaMPG6f transfizierten Zellen in die Aufnahmekammer des Mikroskops.

Fügen Sie 400 Mikroliter des Bildmediums hinzu und legen Sie einen Deckel auf die Kammer. Wählen Sie den Filtersatz für GCaMP6f und die Lichtquelle aus. Suchen Sie die Astrozyten, die OER-GCaMP6f exdrücken.

Wählen Sie als Nächstes einen Filtersatz und eine Lichtquelle für RCaMP2 aus und bestätigen Sie, ob Lck-RCaMP2 in den gleichen Astrozyten ausgedrückt wird. Zeichnen Sie Zeitrafferbilder von Lck-RCaMP2 bei zwei Hertz für zwei Minuten auf und speichern Sie die Bilddaten. Danach ändern Sie den Filtersatz zurück zu GCaMP6f.

Zeichnen Sie Zeitrafferbilder von OER-GCaMP6f bei zwei Hertz für zwei Minuten auf und speichern Sie die Bilddaten. In dieser Studie werden Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f in HeLa-Zellen exprimiert und beide Signale wurden 24 Stunden nach der Transfektion gleichzeitig mit Bildspaltoptik aufgezeichnet. Durch die Zugabe von Histamin erhöhte sich die Signalintensität von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f.

Die von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f gemeldeten Zeitkurse der Calciumionenhöhe werden in den gleichen Interessengebieten verglichen. Beide Sensoren berichten von einer oszillierenden Kalziumionenhöhe. Und beide zeigen den gleichen Zeitverlauf in zwei der fünf untersuchten Zellen.

Die von Lck-RCaMP2 dargestellten Calciumionenhöhen bleiben jedoch in den anderen Zellen auf dem höheren Niveau als OER-GCaMP6f. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Calciumionenhöhe in der Nähe der Plasmamembran verlängert wird, während sie früher um den ER beendet wird, das die Quelle dieses Kalziumionensignals ist, das durch Histaminstimulation induziert wird. Spontane Calciumionensignale von Astrozyten in der Neuron-Astrozyten-Mischkultur von Ratten-Hippocampi und Kortiken werden von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f gezeigt.

Spontane Kalziumionenerhöhungen sind nur im astrozytischen Prozess sichtbar, nicht am Zellkörper, der mit früheren Berichten übereinstimmt. Spontane Calciumionenerhöhungen von Lck-GCaMP6f in unreifen Hippocampus-Neuronen der Ratte sind bei zwei Hertz zu sehen. Die Zeitkurse für fünf verschiedene Interessensgebiete deuten darauf hin, dass diese Erhebungen lokal auf die subzellulären Domänen beschränkt sind.

Reife Maus-Hippocampus-Neuronen, die mit OER-GCaMP6f-Expression AAV-Vektoren infiziert sind, zeigen Kalziumionenreaktionen als Reaktion auf die Zugabe von DHPG. Bei der Kalzium-Bildgebung ist die Anregungsstärke der kritischste Faktor. Bitte halten Sie das Anregungslicht so gering wie möglich, um Photobleichungen und Phototoxizität zu vermeiden.

Die Quelle der Calciumsignale kann von Pomakorzi mit spezifischen Inhibitoren an Kalziumkanälen weiter bestätigt werden. Die Dekodierung von Kalziumsignalen, um einen bestimmten Ausgang zu evozieren, war eine grundlegende biologische Frage. Diese Kalzium-Bildgebungstechnik ebnet den Weg, um die Vielfalt der intrazellulären Calciumsignale zu beschreiben.