Probenvorbereitungsmethode des Raster- und Transmissionselektronenmikroskops für die Anhänge von Woodboring Beetle

Holzbohrkäfer ihre Körperoberfläche sind immer hart in SEM. Der Tween-20 wird in fixative und Waschlösung hinzugefügt. Die Körperoberfläche des Holzbohrkäfers In TEM, der Tween-20 kann fixatives Eindringen in die Körperwand verbessern und Gewebe und Organ besser im Körper fixieren.

Das Fluoreszenzmikroskop ist hilfreich, um die Schnittgenauigkeit zu verbessern. Die Technik ist hilfreich, um die Körperoberfläche zu waschen und in die Körperwand im Holzbohrkäfer einzudringen. Damit würde die Vision von SEM und TEM klar.

Fluoreszenzmikroskop ist hilfreich, um die Schnittgenauigkeit in TEM zu verbessern. Demonstriert wird das Verfahren von Zhang Yanru, einem Doktoranden unseres Labors. In einem Gebiet, in dem Chlorophorus caragana lebt, legen Feldfallen, die mit Pflanzenlockmitteln wie Isophoron geködert werden, auf eine Trichterfalle.

Locken Sie Holzbohrkäfer-Erwachsene in die Fallen. Bewahren Sie die sauberen Körper der erwachsenen Chlorophorus caragana in 0,1 Mol pro Liter PBS bei pH 7,2, 2,5 % Volumengewicht Glutaraldehyd und 0,06 % Volumenvolumen Tween-20 auf. Fixieren Sie die Probe bei vier Grad Celsius für drei Tage.

Entfernen Sie die Körper aus der Konservierungsflüssigkeit und spülen Sie in PBS. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop Zangen, um die Anhänge zu entfernen und sie bei 40 Kilohertz in PBST ultrasonisch zu reinigen. Nach der Reinigung für 100 Sekunden, übertragen Sie die Probe auf das Mikroskop, um zu überprüfen, ob es sauber ist.

Reinigen Sie nicht länger als 400 Sekunden, um Schäden zu vermeiden. Dann tauchen Sie die Proben in Ethanol in einer Reihe von Konzentrationen für jeweils 20 Minuten, um Dehydrierung durchzuführen. Verwenden Sie nach der Austrocknung unter einem Stereomikroskop kohlenstoffhalbseitiges Klebeband, um drei Beobachtungsflächen, dorsal, ventral und seitlich, getrennt auf Stubs zu fixieren.

Stellen Sie sicher, dass alle Sichtflächen sauber und frei von Verunreinigungen gehalten werden. Die Probenstufe 48 Stunden lang in eine Petrischale geben, die ein Kieselgel-Desiccant enthält. Anschließend drehen Sie auf einem Ionen-Sputtergerät das Hauptventil in die offene Position, entfernen Sie die Probenkammerabdeckung und legen Sie die Probe in die Kammer.

Schalten Sie den Netzschalter ein und stellen Sie sicher, dass das fertige Licht eingeschaltet ist. Stellen Sie die Sputterzeit auf 45 Sekunden und die Schichtdicke auf 70.875 angstrom. Sobald der mechanische Pumpen-Vakuum-Zifferblattindex unter sieben fällt, drücken Sie die Entladung und beginnen Platin zu sprühen.

Schalten Sie am Ende des Verfahrens das Netzteil aus und nehmen Sie die Probe aus der Kammer. Berechnen Sie die Sprühschichtdicke D in angstrom gleich K mal I mal V mal T.K ist eine Konstante, die durch das gesputterte Metall und Gas bestimmt wird. Ich bin der Plasmastrom in Milliampere, während V die in Kilovolt angelegte Spannung ist und T die Zeit in Sekunden.

Legen Sie den Stub, der die Probe enthält, auf die Bühne des SEM. Stellen Sie sicher, dass die Probenstufe mit dem Probenstub genügend Höhe hat, um ein gutes Bild zu ermöglichen. Öffnen Sie die SEM-Software und wählen Sie die gewünschte Betriebsspannung ab 20 Kilovolt aus.

Nach Erhalt der Anhänge von erwachsenen Chlorophorus caragana, waschen Sie die Proben in PBST in einem Ultraschallbad für drei Stunden und dann post-fix sie in 1% Volumen volumenmäßig Osmiumtetroxid in PBS für eine Stunde bei 25 Grad Celsius. Dehydrieren Sie die Proben mit 20-minütigen aufeinanderfolgenden Behandlungen in 50%60%70%80%85%90%95%100% und 100% Volumenvolumen Ethanol bei Raumtemperatur. Mit Zangen erhitztes Harz in eine flache Einbettform auftragen und die Proben in das Harz einbetten.

Stellen Sie sicher, dass sich die Probe an der Unterseite der Platte befindet und so nah wie möglich an den Rand der Einbaunut enden. Beschriften und bebrüten Sie dann die Platte, die die Probe bei 60 Grad Celsius enthält, 72 Stunden lang. Entfernen Sie nach der Inkubation die Platte aus dem Inkubator und überprüfen Sie, ob das Harz polymerisiert ist.

Sobald die Probe erstarrt ist, stellen Sie jeden Harzblock unter ein Fluoreszenzmikroskop, bewegen Sie die fluoreszierende Lichtquelle des Mikroskops, um die Probe mit blauem Licht von oben zu bestrahlen und zu fotografieren. Stellen Sie sicher, dass die Sensilla im Harzblock deutlich sichtbar ist. Messen Sie den Abstand zwischen der Kante des Harzblocks und dem Zielsensor, um die Sensilla zu zielen.

Beziehen Sie sich auf das SEM-Bild der Palps und schneiden Sie den Harzblock grob mit einer Rasierklinge in der Nähe des Zielrezeptors. Anschließend, unter einer blaulichten Fluoreszenzmikroskopie, stellen Sie die Lichtquelle von oben so ein, dass die Sensilla deutlich beobachtet wird. Fügen Sie das objektive Mikrometer der Fluoreszenzmikroskopstufe hinzu.

Fotografieren Sie den grob geschnittenen Harzblock und messen Sie dann mit ImageJ den Abstand zwischen dem Ziel und dem Rand des Harzes. Die Harzprobe auf ein Ultramikrotom legen und 50 bis 60 Nanometer dicke Abschnitte schneiden, bis die Zielposition erreicht ist. Montieren Sie die Abschnitte auf Formvar-beschichteten 100 Mesh-Kupfergittern in Petrischalen.

Färben Sie die Gitter mit einer gesättigten gefilterten Lösung von Uranylacetat bei Raumtemperatur. Bedecken Sie die Abschnitte während der Färbung, um lichtinduzierte Ausscheidungen zu blockieren. 10 Minuten lang färben.

In einer Dunstabzugshaube zweimal in 50% Methanol abspülen, dann zweimal in gefiltertem entgastem Wasser. Legen Sie Tropfen von vorbereiteten Blei Citrat Fleck auf den Quadraten der Kunststoff Petri-Gerichte und lassen Sie sie für acht Minuten sitzen. In entgastem gefiltertem Wasser abspülen und trocknen.

Montieren Sie die Gitter auf einer Probenstufe innerhalb der TEM-Maschine. Stellen Sie die Spannung auf 80 Kilovolt ein und untersuchen Sie die Abschnitte. In diesem Protokoll wurde mit Reinigungs- und Fixierlösung mit Tween-20 ein klares SEM-Bild beobachtet als das ohne Tween-20.

Mit der Tween-20 Befestigungslösung, die es der Glutaraldehyd-Fixierlösung ermöglichte, in das Gewebe einzudringen, waren Mikrotubulistrukturen im TEM-Bild deutlich zu sehen, während die innere Struktur der ohne Tween-20 hergestellten Probe verschwommen war. Kontinuierliche Querschnittsansichten des Pflocks des Typs ein sensilla twig basiconica auf den Kieferhöhlen zeigten, dass die dendritische Hülle die äußeren dendritischen Segmente umgab und bis zur Spitze pore ausdehnte. Sieben unverzweigte äußere dendritische Segmente existierten in der inneren Rezeptor-Lymphhöhle, die von einer äußeren Höhle umgeben war.

Der röhrenförmige Körper wurde durch eine dendritische Hülle von anderen äußeren dendritischen Segmenten an jeder sensillar Sockelbasis getrennt. In der Ziliarregion wurden acht Dendriten mit unterschiedlichen Durchmessern identifiziert, die auf das Vorhandensein von acht bipolaren Neuronen hindeuten. Die Technik kann verwendet werden, um die Funktion von Nerven wie Einzelzellaufzeichnung oder In-situ-Hybridisierung weiter zu untersuchen.