Induktion und Charakterisierung der pulmonalen Hypertonie bei Mäusen mit dem Hypoxia/SU5416-Modell
June 3rd, 2020
Dieses Protokoll beschreibt die Induktion von pulmonaler Hypertonie (PH) bei Mäusen basierend auf der Exposition gegenüber Hypoxie und der Injektion eines VEGF-Rezeptor-Antagonisten. Die Tiere entwickeln 3 Wochen nach Beginn des Protokolls eine PH- und rechtsventrikuläre (RV) Hypertrophie. Die funktionale und morphometrische Charakterisierung des Modells wird ebenfalls dargestellt.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um pulmonale Hypertonie zu induzieren und funktionelle Messungen der rechten Herzkammer durchzuführen. Das Sugen Hypoxia Modell ist einfach zu implementieren und kann einige der Merkmale der pulmonalen Hypertonie innerhalb von zwei bis drei Wochen nach der Induktion rekapitulieren. Mit diesem Modell können wir neue Wege identifizieren, die an der Entwicklung der Krankheit beteiligt sind.
Wir können neue Ziele identifizieren und ihr therapeutisches Potenzial testen. Vor Beginn des Induktionsverfahrens die Stickstofftanks in der Nähe der hypoxischen Kammer sichern und den Sauerstoffregler auf einen Punkt von 10% Sauerstoff einstellen. Als nächstes die frisch zubereitete SU5416-Lösung in eine Ein-Milliliter-Spritze mit 25-Spur-Nadel laden und das erste zu injizierende Tier manuell zurückhalten.
Greifen Sie die Haut, um ein Zelt parallel zur Wirbelsäule zu bilden, um sicherzustellen, dass sie den Hinterkopf fest greifen, um eine mögliche Bissverletzung durch die Maus zu vermeiden. Setzen Sie die Nadel subkutan über die Flanke an der lockeren Hautfalte parallel zur Haut und liefern Sie 100 Mikroliter des Spritzeninhalts. Nach 10 Sekunden ziehen Sie die Nadel aus und bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück.
Wenn alle Tiere injiziert wurden, legen Sie die Mäuse in eine belüftete Hypoxiekammer. Bestätigen Sie bei Hypoxie-Exposition, dass die Kammern mit einem Sauerstoffsensor ausgestattet sind, um den Sauerstoffgehalt zu messen, und öffnen Sie die Kammern für nicht mehr als 20 Minuten alle drei Tage für die Reinigung und Zugabe von Nahrung und Wasser. Untersuchen Sie Tiere täglich auf Anzeichen von Stress und wiederholen Sie die SU5416 Injektion wöchentlich für drei aufeinander folgende Wochen.
Bevor Sie das Druckmessverfahren einleiten, bereiten Sie den Y-Rohrstecker vor und verwenden Sie den manuellen Modus, um die Funktion des Beatmungsgeräts zu überprüfen. Stellen Sie den Inspiratordruck auf weniger als einen Zentimeter Wasser ein, um Barotrauma zu vermeiden und die Atemfrequenz auf 110 Atemzüge pro Minute einzustellen. Schneiden Sie einen 20 Gauge intravaskulären Katheter, um ein Endotrachealrohr zu erstellen und schalten Sie die Druckvolumenregelung ein.
Initiieren Sie die Datenerfassungssoftware und platzieren Sie den Druckvolumenkatheter in einem 15 Milliliter Zentrifugenrohr von PBS in einem 37 Grad Celsius Wasserbad. Kalibrieren Sie dann den Katheter entsprechend dem Herstellerprotokoll. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen und legen Sie eine rektale Sonde für die Überwachung der Körpertemperatur.
Als nächstes bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen in einer anästhesierten Maus und rasieren Sie den Hals und Brustbereich. Sichern Sie die Gliedmaßen der Maus mit chirurgischem Klebeband und machen Sie einen ein Zentimeter Schnitt in der medialen Zervixhaut. Mit einem Baumwolle gekippt Applikator, stumpf trennen die Ohrspeicheldrüsen und submandibulären Speicheldrüsen, um die Muskeln, die die Luftröhre zu belichten.
Schneiden Sie vorsichtig die Muskeln, um die Luftröhre vollständig freizulegen und verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Schnitt zwischen den Trachealknorpeln zu machen. Legen Sie das vorbereitete Endotrachealrohr ein und entfernen Sie die Metallführung des intravaskulären Katheters. Schließen Sie dann den Katheter an das Beatmungsgerät an und überprüfen Sie die Position des Trachealrohrs, indem Sie die Lunge manuell sanft aufblasen.
Sichern Sie die Position mit Klebeband. Für die rechte Ventrikeldruckmessung, machen Sie einen einen Zentimeter Hautschnitt über den xiphoiden Prozess und den Oberbauch und beginnend an der Mittellinie distal zum xiphoid und vorsichtig seitlich auf beiden Seiten bewegen, trennen Sie die Haut über die Brust und Bauchwand. Öffnen Sie die Bauchhöhle, schneiden Sie das Zwerchfell sorgfältig, wobei Darauf geachtet wird, das schlagende Herz oder die Lunge nicht zu verletzen.
Und verwenden Sie einen Baumwolle gekippt Applikator, um sanft das Perikard zu entfernen. Bringen Sie den Druckkatheter in die Nähe der Maus und verwenden Sie einen mit einer Nadel ausgestatteten Baumwollapplikator, um eine Stichwunde im atypischen distalen Teil des rechten Ventrikels zu machen. Ersetzen Sie die Nadel vorsichtig durch Druckkatheter, indem Sie den Druckkatheter parallel zur Richtung des rechten Ventrikels mit der Spitze zur Lungenarterie einsetzen.
Beobachten Sie die Druckwellenverfolgung, um eine korrekte Positionierung des Katheters zu gewährleisten. Sobald sich das Drucksignal stabilisiert hat, halten Sie die Atmungsgeräte an und erhalten Sie mindestens drei Messungen. Wenn alle Messungen aufgezeichnet wurden, geben Sie den Katheter vorsichtig an das PBS-gefüllte Zentrifugenrohr im Wasserbad zurück.
Hierwerden werden repräsentative Druckkurven und eine quantitative Analyse des rechten ventrikulären Drucks am Ende des Beobachtungszeitraums gezeigt. Die histologische Analyse der umgestalteten Lungenarterien nach Hypoxie plus SU5416-Behandlung zeigt eine Zunahme der medialen Wanddicke im Vergleich zu normoxischen Tieren. Weizenkeim Agglutinin Färbung zur Beurteilung der Kardiomyozytenhypertrophie zeigt, dass Hypoxie plus SU5416 Exposition führt zu einer deutlichen Zunahme der Kardiomyozytengröße und rechtsventrikuläre Hypertrophie.
Darüber hinaus bestätigt die morphometrische Auswertung der rechtsventrikulären Hypertrophie durch Messung des Fulton-Index einen Anstieg der rechtsventrikulären Hypertrophie bei hypoxischen Tieren. Die Durchführung der funktionellen Messungen ist wichtig, um Blutungen zu vermeiden, da dies die Ergebnisse der Studie negativ beeinflussen kann. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um pulmonale Hypertonie bei Ratten mit nur leichten Modifikationen zu induzieren.
Bemerkenswert ist, nur eine Sugen-Injektion bei Ratten ist ausreichend, um pulmonale Hypertonie zu induzieren.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt die Induktion von pulmonaler Hypertonie (PH) bei Mäusen durch Hypoxie-Exposition und Injektion von VEGF-Rezeptor-Antagonisten. Das Modell ermöglicht eine funktionelle und morphometrische Charakterisierung von PH und rechtsventrikulärer Hypertrophie innerhalb von drei Wochen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Herz-Kreislauf-Biologie
- Pathophysiologie
Hintergrund
- Pulmonale Hypertonie ist eine ernsthafte Erkrankung, die das Herz-Kreislauf-System betrifft.
- Das Verständnis der Mechanismen hinter PH kann zu neuen therapeutischen Zielen führen.
- Das Sugen Hypoxie-Modell ist eine weit verbreitete Methode zur Untersuchung von PH bei Mäusen.
- VEGF-Rezeptor-Antagonisten spielen eine Rolle bei der Entwicklung von PH.
Zweck der Studie
- Induktion von pulmonaler Hypertonie in einem kontrollierten Mausmodell.
- Durchführung funktioneller Messungen des rechten Ventrikels.
- Identifizierung neuer Wege und therapeutischer Ziele für PH.
Verwendete Methoden
- Induktion von Hypoxie durch Einstellen des Sauerstoffgehalts auf 10%.
- Injektion von SU5416 zur Blockierung von VEGF-Rezeptoren.
- Überwachung der rechtsventrikulären Funktion und Morphologie.
- Charakterisierung des Modells über einen Zeitraum von drei Wochen.
Hauptergebnisse
- Entwicklung von pulmonaler Hypertonie und rechtsventrikulärer Hypertrophie.
- Funktionelle Messungen zeigen signifikante Veränderungen in der rechtsventrikulären Leistung.
- Morphologische Veränderungen, die mit pulmonaler Hypertonie konsistent sind, wurden beobachtet.
- Identifizierung potenzieller neuer therapeutischer Ziele für die Behandlung.
Schlussfolgerungen
- Das Sugen Hypoxie-Modell ahmt effektiv pulmonale Hypertonie nach.
- Dieses Modell kann verwendet werden, um neue an PH beteiligte Wege zu erforschen.
- Zukünftige Studien können dieses Modell für therapeutische Tests nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
The hypoxia/SU5416 mouse model provides a rapid, cost-effective system for interrogating vascular remodeling and right ventricular dysfunction in pulmonary hypertension, enabling early-stage target validation and mechanistic de-risking. Its compatibility with wild-type and genetically modified mice supports pathway interrogation and therapeutic hypothesis testing within a three-week timeframe. This model bridges discovery biology and preclinical evaluation by delivering quantifiable hemodynamic and histological readouts that inform portfolio triage and risk-adjusted decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of VEGF signaling pathways and identification of novel therapeutic targets involved in pulmonary vascular remodeling.
- Operational Value: Supports rapid phenotypic screening of genetic or pharmacological interventions using standardized induction and measurement procedures.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by modeling key histopathological hallmarks of human Group 1 pulmonary hypertension, including medial wall thickening and right ventricular hypertrophy.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable outputs such as right ventricular pressure via catheterization and Fulton index for hypertrophy assessment.
- Operational Value: Delivers reproducible, low-variance measurements when combined with standardized hypoxia exposure and weekly SU5416 dosing.
- Scalability: Enables platform reuse across wild-type and knockout models without requiring surgical expertise, supporting high-throughput target validation campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system that mimics human pulmonary hypertension pathophysiology, allowing evaluation of target engagement and pathway modulation.
- Operational Value: Supports prevention and therapy studies through reversible phenotype upon normoxia return, enabling washout and rechallenge designs.
- Translational Continuity: Connects early discovery to preclinical validation by delivering functional (RV pressure) and structural (vascular remodeling, cardiomyocyte hypertrophy) endpoints aligned with clinical biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target identification, assay validation, and mechanistic de-risking before lead optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of VEGF-dependent and independent pathways in pulmonary hypertension through inducible, reversible vascular injury.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with standardized induction (10% oxygen, weekly SU5416) and quantifiable outputs (RV pressure, Fulton index, histological thickening).
- Analytics: Provides functional hemodynamics and morphometric readouts that allow cross-group comparison and effect size estimation for target prioritization.
- Translational Research: Offers mechanistic insight into right ventricular adaptation and pulmonary artery remodeling, supporting biomarker-aligned go/no-go decisions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable phenotypic platform for iterative testing of targets across multiple chemogenetic or pharmacological modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by modeling human-relevant vascular and cardiac pathophysiology.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized hypoxia control, injection schedule, and pressure/volume catheterization techniques.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by enabling early de-risking of targets based on functional and structural disease modification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by delivering multiparametric data (pressure, hypertrophy, fibrosis) for objective target ranking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hypoxic chamber management, SU5416 handling, and right ventricular catheterization techniques.
- Dependent on precise oxygen control (10%) and access to nitrogen tanks for chamber maintenance.
- Necessitates standardized animal handling and weekly dosing to ensure model consistency across cohorts.
- Limited to mild-to-moderate phenotype severity, which may restrict modeling of advanced disease stages.
- Reversibility upon normoxia return requires careful experimental design for chronic therapy studies.
