Visualisierung von der okulären Sulcus Superior in der Embryogenese Danio rerio
27. März 2019
Hier präsentieren wir eine standardisierte Reihe von Protokollen, die überlegene okuläre Sulcus zu beobachten eine kürzlich identifiziert, evolutionär konservierte Struktur in den Augen der Wirbeltiere. Verwendung von Zebrafischlarven zeigen wir Techniken notwendig, Faktoren zu identifizieren, die auf die Gründung und Schließung der überlegenen okuläre Sulcus beitragen.
Dieser Satz von standardisierten Protokollen kann verwendet werden, um neue Einblicke in den überlegenen Augensulkus (SOS), eine kürzlich entdeckte Struktur des sich entwickelnden Auges, zu bieten. Diese Protokolle ermöglichen es jedem Experimentator auf der ganzen Welt, das SOS während der Entwicklung von Zebrafischaugen klar zu visualisieren. Beginnen Sie, indem Sie heterozygote Wachstumsdifferenzierung Faktor sechs A männlichen und weiblichen Zebrafisch auf getrennten Seiten eines Teilers in einem Tank mit entchlorten Wasser am Abend vor ihrer Paarung.
Am nächsten Morgen entfernen Sie die Trennwand und lassen Sie die Fische für nicht mehr als 30 Minuten züchten. Am Ende der Brutzeit sammeln Sie die Embryonen in Petrischalen mit E3-Medium für ihre Inkubation in einem 28,5-Grad-Inkubator. Nach 20 Stunden nach der Befruchtung den Überstand durch das E3-Medium ersetzen, das 0,004%1-Phenyl-2-thiourea ergänzt, um die Pigmentproduktion zu verhindern, und die Embryonen durch Lichtmikroskopie untersuchen, um zu bestätigen, dass sie sich alle in einem geeigneten Entwicklungsstadium befinden.
Legen Sie die Proben unter ein Sezierendes Mikroskop. Entsorgen Sie alle entwicklungsunreifen Embryonen und verwenden Sie feine Zangen, um die Kränze sanft auseinander zu ziehen. Visualisieren Sie das SOS, das als Einzug oder Linie am dorsalen Rand des Auges erscheinen kann.
Sortieren Sie dann die Embryonen, die SOS-Verschlussverzögerung zeigen, von denen, die dies nicht tun. Um diese Embryonen mit einem Seziermikroskop zu fotografieren, bereiten Sie eine Petrischale mit 1%Agarose in E3-Medium vor und stechen Sie leicht in die Mitte der Agarose, um ein flaches Loch zu schaffen, in das das Eigelb des Embryos gelegt werden kann. Dann legen Sie einen anästhesierten Embryo seitlich auf die Agarose.
Um die Embryonen mit einem zusammengesetzten oder konfokalen Mikroskop abzubilden, übertragen Sie einen Embryo in eine 35-Millimeter-Petrischale, die einen kleinen Bolus aus nicht gegelter 1%niedriger Schmelzpunkt-Agarose enthält, in das E3-Medium und verwenden Sie eine feine Angelschnur, um den Embryo schnell in der seitlichen Position zu positionieren. Wenn die Agarose abgekühlt ist, gießen Sie genügend E3-Medium in die Schale, um die Agarose zu bedecken und verwenden Sie eine 20x Wasser-Immersion objektivLinse, um das SOS zu visualisieren. Ziehen Sie nach der Bildgebung die Agarose vorsichtig aus dem Embryo und fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd oder lassen Sie den Zebrafisch seine Entwicklung fortsetzen.
Um das SOS durch fluoreszierende mRNA-Expression zu visualisieren, verwenden Sie ein Mikroinjektionsgerät, um 300 Piktogramme verbesserter GFP-CAX mRNA in Embryonen im Einzellstadium zu injizieren. Verwenden Sie dann ein fluoreszierendes Stereoskop, um Embryonen mit heller, verbesserter GFP-Expression zu überprüfen und Bilder der Embryonen durch eines der gezeigten bildgebenden Verfahren zu erhalten. Für die immunfluoreszierende Färbung von embryonalen Zebrafischen laminin, dechorinatieren Sie die Embryonen wie nachgewiesen und fixieren Sie die Embryonen in einem Mikrozentrifugenrohr in frisch zubereitetem 4%Paraformaldehyd für zwei Stunden auf einem Raumtemperatur-Shaker.
Am Ende der Fixierung die Embryonen viermal in PBS plus Tween oder PBST waschen, fünf Minuten pro Wäsche, gefolgt von Einer Durchlässigkeit in 10 Mikrogramm pro Milliliter oder Proteinase K bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Waschen Sie die permeabilisierten Embryonen viermal in PBST, wie gezeigt, und blockieren Sie die Embryonen in 5%Ziegenserum und zwei Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin in PBST für ein bis zwei Stunden auf einem Raumtemperatur-Shaker. Am Ende der blockierenden Inkubation die Embryonen in den primären Antilaminin-Antikörper von Interesse bei vier Grad Celsius über Nacht auf einem Shaker inkubieren.
Am nächsten Morgen die Embryonen fünfmal in PBST für 15 Minuten pro Wäsche waschen und das Gewebe über Nacht bei vier Grad Celsius auf dem lichtgeschützten Shaker mit einem geeigneten Sekundärantikörper kennzeichnen. Am nächsten Morgen die Embryonen viermal in PBST für 15 Minuten pro Wäsche waschen und die Embryonen in eine kleine Petrischale mit frischem PBST legen. Mit feinen Zangen, sanft stören die Dotter und entfernen Sie die Eigelbzellen durch mildes Abkratzen der Dottersäcke.
Übertragen Sie die entyolkierten Embryonen in frisch zubereitetes 30%Glycerin in PBS, stellen Sie sicher, dass die Embryonen auf die Lösung gestellt werden, und übertragen Sie so wenig wie möglich von der vorherigen Lösung und warten Sie, bis die Embryonen auf den Boden des Rohres sinken. Wenn die Embryonen den Boden des Behälters erreicht haben, übertragen Sie sie in sequenzielle 50% und 70%Glycerin in PBS-Lösungen, wie gerade gezeigt. Nachdem die Embryonen auf den Boden des 70%-Glyzerinbehälters gesunken sind, übertragen Sie die Proben auf eine kleine Plastikschale für Sezieren und trennen Sie die Embryonen nach trägen zu den Hinterhirnen.
Mit feinen Sezierwerkzeugen bewegen Sie einen Kopf auf eine Glasrutsche mit so wenig Glyzerin wie möglich und legen Sie vorsichtig einen feinen Minutienstift in die Vorhirnkammer vom Inneren ein, wobei Sie nach unten drücken, um die rechte und linke Kopfhälfte voneinander zu trennen. Wenn der Kopf vollständig auf der Mittellinie verfüllbar ist, montieren Sie jede Seite der Kopflinie nach unten, Augenseite nach oben. Das SOS ist durch das Sezieren des Mikroskops bei 20 bis 23 Stunden nach der Befruchtung und durch Differentialinterferenzkontrast-Bildgebung als dünne Linie im dorsalen Auge zu beobachten, die die Nasen- und Diezeitliche Hälfte der sich entwickelnden Netzhaut trennt.
Darüber hinaus kann ein subtiler Einzug in der dorsalen Grenze des Auges sichtbar sein. Nach der immunfluoreszenten Färbung von Laminin kann die dünne Linie als Kellermembran bestätigt werden. Wenn sich der SOS-Verschluss verzögert, kann seine längere Anwesenheit als ausgeprägte Spalte in der rückenden Seite des Auges unter einem Sezierendes Mikroskop beobachtet werden.
Bei der Beobachtung unter einem zusammengesetzten Mikroskop mit Differentialinterferenzkontrast-Bildgebung ist dieses Merkmal noch stärker ausgeprägt, wenn die Nasen- und Zeitseiten des Auges durch das SOS getrennt sind, das als Linie im dorsalen Auge deutlich sichtbar ist. Durch die 28-stündige Nachdüngung bei Wildtyp-Zebrafischen zeigt die Lamininfärbung deutlich, dass das SOS vollständig geschlossen ist, was dies zur idealen Bühne für die Überwachung von Verzögerungen bei der Schließung von Spalt. Die Injektion von verbesserter GFP-CAX mRNA ermöglicht die Visualisierung der Zellmembranen von lebenden oder festen Embryonen zur Verfolgung von Veränderungen in der Morphologie der Zellen, die zu einem SOS-Verschluss führen.
Die Visualisierung des SOS kann schwierig sein, da es eng und vorübergehend ist. Es ist jedoch zwingend erforderlich, dass Sie bei der Bewertung von Schließungsverzögerungen zu späteren Zeitpunkten eine konsistente Bewertungsmethode beibehalten. Diese Techniken können mit experimentellen Manipulationen kombiniert werden, um genetische Faktoren oder pharmakologische Wirkstoffe zu identifizieren, die die richtige SOS-Bildung und -Schließung beeinflussen.
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Übersicht
In diesem Artikel werden standardisierte Protokolle zur Beobachtung des superior ocular sulcus (SOS), einer kürzlich identifizierten Struktur im Wirbeltiergehirn, vorgestellt. Mithilfe von Zebrafischlarven helfen die beschriebenen Techniken Forschern dabei, Faktoren zu identifizieren, die zur Bildung und Schließung des SOS während der Augenentwicklung beitragen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Zebrafisch-Modellorganismus
Hintergrund
- Die obere Augenfurche ist eine evolutionär konservierte Struktur.
- Das Verständnis ihrer Bildung ist entscheidend für Erkenntnisse zur Augenentwicklung bei Wirbeltieren.
- Zebrafische eignen sich als effektives Modell zur Untersuchung der embryonalen Entwicklung.
- Standardisierte Protokolle verbessern die Reproduzierbarkeit in der Forschung.
Zweck der Studie
- Eine klare Methodik zur Visualisierung des SOS bereitzustellen.
- Die Forschung zu den Faktoren, die die Entwicklung des SOS beeinflussen, zu erleichtern.
- Techniken zu standardisieren, um eine globale Zugänglichkeit in der Forschung zu gewährleisten.
Verwendete Methoden
- Züchtung heterozygoter Zebrafische in einer kontrollierten Umgebung.
- Bebrütung der Embryonen in E3-Medium zur Unterstützung der Entwicklung.
- Verwendung von 1-Phenyl-2-thiourea zur Hemmung der Pigmentproduktion.
- Anwendung der Lichtmikroskopie zur Bestätigung des Entwicklungsstadiums.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Sinus venosus bei der Zebrafischaugenentwicklung.
- Protokolle ermöglichen eine konsistente Beobachtung über verschiedene Studien hinweg.
- Gewonnene Erkenntnisse über die Entwicklungsprozesse des Sinus venosus.
- Standardisierte Methoden können an verschiedene Forschungsumgebungen angepasst werden.
Schlussfolgerungen
- Die etablierten Protokolle bieten eine Grundlage für zukünftige Studien zum SOS.
- Das Verständnis des SOS kann zu umfassenderen Erkenntnissen über die Evolution des Wirbeltiergehirns führen.
- Standardisierung fördert Zusammenarbeit und Reproduzierbarkeit in der Forschung.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Visualisierung vorübergehender Entwicklungsstrukturen wie des superior ocular sulcus (SOS) ermöglicht eine mechanistische Entlastung bei der frühen Target-Validierung, indem morphogenetische Signalwege geklärt werden. Standardisierte Bildgebungsprotokolle unterstützen eine reproduzierbare phänotypische Untersuchung in Zebrafisch-Modellen und verbessern so die Vorhersagekraft in Assays der Entwicklungsbiologie. Dieser Ansatz hilft dabei, genetische oder pharmakologische Faktoren zu identifizieren, die den Verschluss des okularen Spalts beeinflussen, und hat direkte Relevanz für die Modellierung angeborener Erkrankungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die mit der Bildung und Schließung der Augenfissur zusammenhängen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch funktionelle Zielvalidierung von Genen, die an der SOS-Dynamik beteiligt sind.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Portfolio-Priorisierung, indem Verzögerungen beim SOS-Schluss als phänotypische Messgrößen für die Störung von Signalwegen identifiziert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows durch konsistente SOS-Visualisierung bei 20–23 hpf vor.
- Operationaler Wert: Löst Herausforderungen bei der Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch definierte Stadienbestimmung und bildgebende Parameter.
- Skalierbarkeit: Unterstreicht die Eignung für Screenings und die Wiederverwendbarkeit der Plattform über verschiedene Mikroskopiemodalitäten hinweg, darunter Hellfeld-, Auflicht- und konfokale Mikroskopie.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erläutert die Krankheitsrelevanz durch Modellierung des kolobomatischen Defekts im oberen Augenabschnitt während der Wirbeltieraugenentwicklung.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Beschreibt den kontinuierlichen Übergang von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem der Zeitpunkt des Schlusses der Sehnenringöffnung (SOS) mit der Integrität der lamininreichen Basalmembran verknüpft wird.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht die Überwachung von Verzögerungen beim Spaltverschluss als Biomarker für die Integrität entwicklungsgenetischer Signalwege.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode ist in die Entdeckungskette von der frühen Entdeckung bis zur Leitstruktur-Identifizierung integriert und unterstützt die Hypothesenprüfung sowie die Aufklärung von Signalwegen in der Wirbeltier-Augenentwicklung.
- Entdeckungsbiologie: Erläutert, wie die Methode Hypothesenprüfungen durch die Visualisierung des SOS als dorsale Einkerbung der optischen Cupula unterstützt, die die nasale und temporale Hälfte der Netzhaut voneinander trennt.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays anhand reproduzierbarer Embryonalstadien und der SOS-Visualisierung mittels differentieller Interferenzkontrastmikroskopie oder fluoreszenzmarkierung.
- Analysen: Betont quantitative Ergebnisse wie das Fortbestehen des SOS nach 28 hpf als messbares Verzögerungsphänotyp für genetische oder pharmakologische Screenings.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit präklinischer Kontinuität, indem die Schließung des SOS über Laminin-Färbung bestätigt wird, einem konservierten Marker der Basalmembran.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbares Verfahren zur Untersuchung konservierter okularer Strukturen bei Wirbeltieren über Arten hinweg dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Unschärfen in der Augenmorphogenese.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der SOS-Visualisierung über verschiedene Mikroskopieplattformen hinweg.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen, Kapital-Effizienz und reduziertes biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen bei der Modellierung von Entwicklungsstörungen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Voranbringungsentscheidungen basierend auf der Kinetik des SOS-Schlusses als phänotypischem Biomarker.
Durchführungsaspekte
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in der Zebrafischembryologie und Mikromanipulationstechniken.
- Erforderliche Instrumentierung und analytische Infrastruktur, einschließlich Stereomikroskope und auflichtmikroskope mit Wasserimmersionsobjektiven.
- Anforderungen an die Standardisierung zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Embryonalstadieneinteilung, SOS-Bewertung und zeitlichen Abstimmung der Bildgebungssitzungen.
- Überlegungen zur Anpassung auf verschiedene Modellsysteme wie Maus, Huhn oder Mol zur Beobachtung konservierter SOS-Phänomene.
- Praktische Einschränkungen, wie die enge zeitliche Begrenzung und Transienz des SOS, die konsistente Bewertungsmethoden zur Beurteilung der Verzögerung des Verschlusses erfordern.
