Name: Halbleitersequenzierung für Präimplantationsgenetische Tests für Aneuploidie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Erfahren Sie die Halbleitersequenzierung für präimplantationsgenetische Tests auf Aneuploidie. Diese Methode ermöglicht schnelle, kostengünstige und zuverlässige Embryo-Screenings mit kurzer Durchlaufzeit.

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Diese Studie wurde vom General Research Fund (Ref. 14162417) aus Hongkong, der National Natural Science Foundation of China (Ref. 81860272), dem Major Research Plan der Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi (Ref. AB16380219) und den China Postdoctoral Science Foundation Grant (Ref. 2018M630993) aus China.

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<li>Harton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+PGD+Consortium%2FEmbryology+Special+Interest+Groupbest+practice+guidelines+for+polar+body+and+embryo+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis%2Fscreening+%28PGD%2FPGS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS).</a> Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Im Unterscheidet von anderen Sequenzierungschemikalien verwendet der hier beschriebene Sequenzer Halbleiter für die Detektion von Nukleotiden. Der Chip selbst ist ein elektronisches Gerät, das Wasserstoffionen durch polymerase-gesteuerte Basisinkorporation17erkennt, was eine 2-4 h-Sequenzierungszeit des Proton-Programms ermöglicht. Außerdem ist der Chip ein Microwell-Chip, der die Lokalisierung eines Zielmoleküls ermöglicht, das sich von der Durchflusszellsequenzierungschemie durch andere Sequenze...

Die Wahl von qualitativ hochwertigen lebensfähigen Embryonen mit normalen Chromosomenkopiennummern (Euploid) für den Transfer in der assistierten Reproduktion trägt zur Verbesserung der Schwangerschaftsergebnisse bei. Traditionell wird das etablierte morphologische Sortiersystem aufgrund seiner einfachen Verfügbarkeit und nicht-invasiven Natur häufig für die Embryonenbewertung verwendet. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die morphologische Bewertung nur begrenzte Informationen über embryonale Qualität1 und Implantationspotenzial2liefern kann. Ein wesentlicher Grund ist seine Unfähigkeit, die Chromosomenzusammensetzung der Embryonen zu bewerten.
Chromosomale Aneuploidie (abnorme Kopieanzahl von Chromosomen) ist eine der Hauptursachen, die zu embryonalen Entwicklungsstillstand, Implantationsversagen oder Schwangerschaftsverlust führen. Das Auftreten von Aneuploidie ist in menschlichen Embryonen gut dokumentiert, was 60 % bis 70 % bei Spalt-Embryonen3,4 und 50 % 60 % in Blastozysten5ausmacht. Dies hat in gewissem Maße zu dem Engpass bei der Verbesserung der Schwangerschaftsrate der In-vitro-Fertilisation (IVF) beigetragen, die bei etwa 35% bis 40%6,7gehalten wurde. Daher wird angenommen, dass die Auswahl von euploiden Embryonen für die Übertragung vorteilhaft für die Verbesserung der Schwangerschaftsergebnisse ist. Zu diesem Zweck wurden die genetischen Präimplantationstests für aneuploidierend (PGT-A) weiterentwickelt, um die Lebensfähigkeit von Embryonen mit genetischen Ansätzen zu untersuchen. Es gibt eine steigende Anzahl von randomisierten kontrollierten Studien und Kohortenstudien, die die entscheidende Rolle von PGT-A unterstützen. Es wurde nachgewiesen, dass die Anwendung von PGT-A die Fehlgeburtsrate senkt und die klinische Schwangerschaftsrate und Implantationsrate8, laufende Schwangerschaftsrate und Lebendgeburtsrate9erhöht.
Historisch gesehen wurden verschiedene Methoden in PGT-A angewendet, wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), vergleichende genomische Hybridisierung (CGH), Array-CGH und Single Nukleotide Polymorphism (SNP)-Mikroarray. Frühere Studien haben gezeigt, dass PGT-A für Embryos im Spaltstadium von FISH Ergebnisse liefert, die schlecht mit denen übereinstimmen, die durch umfassendes chromosomales Screening (CCS) entsprechender Blastozysten mit 59273Array-CGH oder SNP-Mikroarray5927310. Diese Diskrepanzen können auf chromosomalen Mosaikismus, technische FISCH-Artefakte oder embryonale Selbstkorrektur von Chromosomensegregationsfehlern während der Entwicklung11zurückgeführt werden. Es ist weithin anerkannt, dass die Verwendung von Blastozysten-Trophektomie (TE)-Biopsien für Array-basierte PGT-A wie Array-CGH oder SNP-Mikroarray wirksam ist, um das chromosomale Ungleichgewicht in Embryonen10,12zu identifizieren. Kürzlich bietet die single-cellnext-generation Sequencing (NGS) einen hochdurchsatz- und kostengünstigen Ansatz für die genetische Analyse und hat die klinische Anwendbarkeit in PGT-A13,14,15gezeigt, die es zu einem vielversprechende Alternative zu den derzeit verfügbaren Methoden.
Hier präsentieren wir eine schnelle, robuste und kostengünstige, auf Halbleitersequenzierung basierende NGS-Methode zum Screening von Aneuploidie nder menschlichen Embryonen. Der erste Schritt des Workflows ist die gesamte Genomverstärkung (WGA) der biopsied embryonalen Probe, mit einem einzelligen WGA-Kit, gefolgt von der Erstellung einer Sequenzierungsbibliothek und anschließender Sequenzierung des Halbleitersequenzierungssystems.
Durch die Detektion der H+ Ionen, die bei jeder Desoxyribonukleosidtriphosphat-Inkorporation während der DNA-Strangsynthese freigesetzt werden, überträgt das System die von den Halbleiterelementen erfassten chemischen Signale (pH-Änderung), um digitale Daten zu leiten. , die weiter in DNA-Sequenzinformationen interpretiert werden. Diese einfache Sequenzierungschemie entfällt die Anforderung an teure optische Detektion und komplexe Sequenzierungsreaktionen und reduziert die Gesamtkosten der Reagenzien insgesamt und verkürzt die Sequenzierungslaufzeit auf 2 bis 4 Stunden16. Noch wichtiger ist, dass die Halbleitersequenzierungsplattform auf der Grundlage der Leistungsspezifikationen des Herstellers bis zu 15 GB Sequenzierungsdaten (abhängig von der Qualität der Bibliothek) pro Durchlauf generieren kann, was deutlich höher ist als bei einigen anderen Sequenzern. nur etwa 3 x 4 GB Daten (mit 2 x 75 bp Leselänge)17. In klinischen Anwendungen von PGT-A kann diese Plattform 24 Proben pro Chip erreichen, der bis zu 80 Millionen Lesevorgänge17 und mindestens eine Million einzigartige Lesevorgänge jeder Probe generiert. Die Lesetiefe kann sicherstellen, dass jede Probe mindestens 0,05x gesamte Genomabdeckung hat. Die oben genannten Vorteile dieser Plattform machen sie zu einem idealen Screening-Verfahren und erleichtern so ihre breiten Anwendungen in PGT-A18.

<table><tbody><tr><td>PCR-Röhrchen, 0,2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02D-C</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, Ca2+ und Mg2+ frei</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M NaOH (1,0N) Lösung</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S2567</td><td>Für Melt-off-Lösung. </td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind Röhrchen in molekularer Qualität, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-698-791</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>ELGA PURELAB Flex 3 Wasseraufbereitungssystem oder gleichwertiges 18 M&Omega Wassersystem</td><td>ThermoFisher</td><td>4474524</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Amplifikationspuffer</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Dies kann ersetzt werden durch SurePlex DNA-Amplifikationssystem, Katalognummer: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Amplifikationsenzym</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Dies kann durch das SurePlex DNA-Amplifikationssystem ersetzt werden, Katalognummer: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Ion OneTouch Verstärkungsplatte</td><td></td><td></td><td>Im Bausatz: Ion OneTouch 2 Netzteile (Teile-Nr. A26367). Erweiterte Kit-Komponente in Blatt 5</td></tr><tr><td>Ion PI Annealing Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MyOne Beads Capture Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalysator</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch Breaking Solution (schwarze Kappe)</td><td></td><td></td><td>Im Kit: Ion PI Hi? Q OT2 Solutions 200 (Teile-Nr. A26429). Erweiterte Kit-Komponente in Blatt 5</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>ThermoFisher</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Zellextraktionspuffer</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Dies kann durch das SurePlex DNA-Amplifikationssystem ersetzt werden, Katalognummer: PR-40-415101-00.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Zellextraktionsenzym</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Dies kann durch das SurePlex DNA-Amplifikationssystem ersetzt werden, Katalognummer: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Ion PI Chip Kit v3</td><td>ThermoFisher</td><td>A26771</td><td></td></tr><tr><td>Ion Chip Minifuge, 230 V</td><td>ThermoFisher</td><td>4479673</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dATP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dCTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dGTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>ThermoQ&ndash; Temperatur Trockenbad</td><td>TAMAR</td><td>HB-T2-A</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA-Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA-Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dTTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch 2 Instrument</td><td>ThermoFisher</td><td>INS1005527</td><td>ThermoFisher Katalognummer: 4474778.</td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Ion One Touch ES</td><td>ThermoFisher</td><td>8441-22</td><td>ThermoFisher Katalognummer: 4469495. Erweiterte Kit-Komponente aus Blatt 5</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>51976</td><td>Dies kann durch absolutes Ethanol in molekularer Qualität jeder Marke ersetzt werden.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Extraktions-Enzymverdünnungspuffer</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Dieser kann durch das SurePlex DNA-Amplifikationssystem ersetzt werden, Katalognummer: PR-40-415101-01.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Extraktions-Enzymverdünnungspuffer</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Dieser kann durch das SurePlex DNA-Amplifikationssystem ersetzt werden, Katalognummer: PR-40-415101-02.</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td>Dieses Modell wurde durch Qubit 4 Fluorometer ersetzt, Katalognummer: Q33226.</td></tr><tr><td>Qubit ds DNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>M2002-02</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Foaming Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Index für das Barcode von Bibliotheken</td><td>BaseCare</td><td></td><td>Dies ist ein intern erstellter Index. Benutzer können kommerzielle Produkte von ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapter Kits (Kat. Nr. 4474517)</td></tr><tr><td>Ion PI Ladepuffer</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Solid(TM) Puffer Kit-1X Low TE Puffer</td><td>ThermoFisher</td><td>4389764</td><td></td></tr><tr><td>Agencour AMPure XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet (magnetisches Rack)</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Master Mix PCR Puffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 Mikrozentrifuge</td><td>Micro 17</td><td>75002430</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9922</td><td>Dies kann durch eine andere Marke ersetzt werden.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Nukleasefreies Wasser</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Dies kann durch das SurePlex DNA-Amplifikationssystem ersetzt werden, Katalognummer: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Ion OneTouch Ölflasche</td><td></td><td></td><td>Ion PI Hallo? Q OT2 Solutions 200 (Teile-Nr. A26429). Erweiterte Kit-Komponente in Blatt 5</td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>Erweiterte Kit-Komponente in Blatt 3</td></tr><tr><td>Doppelstrang-DNA-Standard</td><td></td><td></td><td>Hierbei handelt es sich um einen intern vorbereiteten DNA-Standard für die Kalibrierung von Qubit vor der Quantifizierung der Bibliothek.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Voramplifikationspuffer</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Dieser kann durch das SurePlex DNA-Amplifikationssystem ersetzt werden, Katalognummer: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Präamplifikationsenzym</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Dies kann durch das SurePlex DNA-Amplifikationssystem ersetzt werden, Katalognummer: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Library Amplification Primer Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>Erweiterte Kit-Komponente in Blatt 3</td></tr><tr><td>Ion OneTouch Reaktionsfilter</td><td></td><td></td><td>Erweiterte Kit-Komponente in Blatt 5</td></tr><tr><td>Recovery Router</td><td></td><td></td><td>Erweiterte Kit-Komponente in Blatt 5</td></tr><tr><td>Recovery Tubes</td><td></td><td></td><td>Erweiterte Kit-Komponente in Blatt 5</td></tr><tr><td>ISP Resuspension Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionenproton</td><td>ThermoFisher</td><td>DA8600</td><td>Dieses Modell wird von Da An Gene Co., LTD. der Sun Yat-Sen University von ThermoFisher importiert und wurde von der China Food and Drug Administration für die klinische Anwendung zertifiziert. Die Katalognummer in ThermoFisher lautet 4476610.</td></tr><tr><td>Ion PI Hallo? Q Sequenzierung Polymerase</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Sequenzierung Primer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Server für Sequenzer</td><td>Lenovo</td><td>T260</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Sphere Particles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 25mm Spritzenvorsatzfilter</td><td>ThermoFisher</td><td>724-2045</td><td>Porengröße: 0,45 μm. Speziell für wässrige Flüssigkeiten.</td></tr><tr><td>Ion PI Hallo? Q W2 Lösung</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI 1X W3 Lösung</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch Waschlösung C1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Das Ion PGM Hallo? Sequenzierungskit</td><td>ThermoFisher</td><td>A30044</td><td>Erweiterte Kit-Komponente in Blatt 2</td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>Erweiterte Kit-Komponente in Blatt 3</td></tr><tr><td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 Sequenzierungslauf pro Initialisierung)</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td>Erweiterte Kit-Komponente in Blatt 4</td></tr><tr><td>Ion PI Hi? Q OT2 200 Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>A26434</td><td>Erweitertes Kit Komponente in Blatt 5</td></tr></tbody></table>

halbleitersequenzierung für präimplantationsgenetische tests für aneuploidie

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Chromosomale Aneuploidie, eine der Hauptursachen für embryonalen Entwicklungsstillstand, Implantationsversagen oder Schwangerschaftsverlust, ist in menschlichen Embryonen gut dokumentiert. Präimplantationsgenetische Tests auf Aneuploidie (PGT-A) ist ein genetischer Test, der die Fortpflanzungsergebnisse signifikant verbessert, indem chromosomale Anomalien von Embryonen erkannt werden. Die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) bietet einen hochdurchsatz- und kostengünstigen Ansatz für die genetische Analyse und hat die klinische Anwendbarkeit in PGT-A gezeigt. Hier präsentieren wir eine schnelle und kostengünstige, auf Halbleitersequenzierung basierende NGS-Methode zum Screening von Aneuploidie n. K. an Embryonen. Der erste Schritt des Workflows ist die gesamte Genomverstärkung (WGA) der biopsied embryonalen Probe, gefolgt von der Erstellung einer Sequenzierungsbibliothek und der anschließenden Sequenzierung des Halbleitersequenzierungssystems. Im Allgemeinen können für eine PGT-A-Anwendung 24 Samples auf jedem Chip geladen und sequenziert werden, der 60 bis 80 Millionen Lesevorgänge bei einer durchschnittlichen Lesedauer von 150 Basispaaren erzeugt. Die Methode bietet ein verfeinertes Protokoll für die Durchführung der Vorlagenverstärkung und -anreicherung der Sequenzierungsbibliothek, wodurch die PGT-A-Erkennung reproduzierbar, hochdurchlässig, kosteneffizient und zeitsparend ist. Die Laufzeit dieses Halbleiter-Sequenzers beträgt nur 2 bis 4 Stunden, wodurch die Durchlaufzeit vom Empfang von Proben bis zur Ausgabe von Berichten auf 5 Tage verkürzt wird. All diese Vorteile machen diesen Assay zu einer idealen Methode, um chromosomale Aneuploidien von Embryonen zu erkennen und so seine breite Anwendung in PGT-A zu erleichtern.

Basierend auf diesem modifizierten Protokoll wurde die Halbleitersequenzierungsplattform zum ersten Mal für PGT-A eingesetzt. Wir testeten Biopsien aus Spalt-Blastomeren und Blastozysten-Embryon. Es wird vermutet, dass die biopsied Zellen WGA so schnell wie möglich unterzogen werden, um einen Abbau der DNA zu verhindern. Eine frühere Studie verglich die Leistung verschiedener WGA-Methoden und zeigte, dass die hier beschriebene Methode bei der Behältergröße von 100 KB20</...

Hier führen wir ein Halbleitersequenzierungsverfahren für Präimplantationsgentests für Aneuploidie (PGT-A) ein, mit den Vorteilen von kurzer Durchlaufzeit, niedrigen Kosten und hohem Durchsatz.

Halbleitersequenzierung für Präimplantationsgenetische Tests für Aneuploidie

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Das Protokoll, das wir hier vorstellen, ist ein schnelles und kostengünstiges Halbleiter-, Sequenzierungs-basierte Methoden zum Screening von Aneuploidie in Embryonen. Das verfeinerte Protokoll für die Durchführung der Vorlagenverstärkung und die Anordnung der Sequenzierungsbibliothek machen die PGTA-Erkennung reproduzierbar, hoher Durchsatz, kosteneffizient und zeitsparend. Die Laufzeit dieses Halbleiter-Sequenzers beträgt nur zwei bis vier Stunden.Verkürzung der Bearbeitungszeit vom Eingehen von Stichproben bis zur Ausgabe von Berichten auf fünf Tage. Diese Methode bietet Genomsequenzierung für Aneuploidie-Screening, Kopiernummernvariation und einzelne Nukleotid-Polymorphismus-Aufrufe. Aufgrund unterschiedlicher Sequenzierungschemie kann die durch dieses Protokoll erstellte Bibliothek nicht direkt auf anderen Sequenzierungssystemen sequenziert werden.Aber der gleiche Sequenzer, aber unterschiedliche Bibliothek Vorbereitung, ist es in der Lage, nicht-invasive pränatale Screening zu tun. Demonstriert wird das Verfahren von Xiangchun Guo, einem Techniker aus unserem Labor. Um mit der Sequenzierung zu beginnen, wirbeln Sie jede verdünnte Bibliothek und drehen Sie jeweils dreimal dreimal auf der Minizentrifuge für drei Sekunden.Nehmen Sie dann fünf Mikroliter jeder Bibliothek, um in den Kern frei, ein Punkt fünf Milliliter Rohr zu bündeln. Wirbeln Sie die gemischte Bibliothek und drehen Sie kurz auf einer Minizentrifuge für drei Sekunden. Fügen Sie 150 Mikroliter der Bruchlösung zu zwei neuen Rückgewinnungsrohren hinzu.Installieren Sie die neuen Bergungsrohre, den Recovery-Router und die Verstärkerplatte. Mischen Sie die Ölflasche dreimal. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Öl- als auch die Rückgewinnungslösung mindestens zwei Drittel voll sind.Den Master-Mix-PCR-Puffer für 30 Sekunden und kurz auf einer Minizentrifuge für drei Sekunden drehen. Wirbeln Sie die Kugelteilchen und die gemischte Bibliothek für eine Minute und drehen Sie kurz auf einer Minizentrifuge für drei Sekunden. Als nächstes bereiten Sie eine 2400 Mikroliter Ligationsmischung vor, indem Sie 172 Mikroliter Nuklease-freies Wasser, acht Mikroliter der gemischten Bibliothek, 120 Mikroliter des Enzymmixes und 100 Mikroliter der Kugelpartikel in die Röhre mit 2000 Mikroliter des Master-Mix-PCR-Puffers einfügen.Stellen Sie eine Pipette auf 800 Mikroliter ein und laden Sie die Ligationsmischung über den Probenanschluss in den Reaktionsfilter. Invertieren Sie die Ölflasche dreimal und verwenden Sie eine P1000 Pipette, um dem Reaktionsfilter 200 Mikroliter des Reaktionsöls hinzuzufügen. Wählen Sie das Programm Proton und dann die unterstützte Taste, um sicherzustellen, dass das Gerät richtig eingerichtet wurde, indem Sie den Anweisungen auf dem Monitor folgen.Klicken Sie dann auf Weiter, um das Programm zu starten. 100 Mikroliter der Emulsions-PCR-Produktprobe, 130 Mikroliter der gewaschenen Perlen, 300 Mikroliter der ES-Waschlösung und 300 Mikroliter der Schmelzlösung in den acht Rohrstreifen laden. Legen Sie den acht Rohrstreifen auf das Anreicherungssystem.Installieren Sie eine Pipette-Spitze und eine neue Nullpunkt-Zwei-Milliliter-Rohr und starten Sie das Programm. Zentrifugieren Sie den Nullpunkt zwei Milliliter Rohr bei 15, 500 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie zehn Mikroliter des Anreicherungsprodukts auf.200 Mikroliter Nukleasefreies Wasser in die Röhre geben und durch Wirbeln mischen. Zentrifugieren Sie den Nullpunkt zwei Milliliter Rohr wieder. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie 10 Mikroliter des Anreicherungsprodukts auf.90 Mikroliter Nukleasefreies Wasser in die Röhre geben und durch Wirbeln mischen. Um die Vorlage vorzubereiten, wirbeln Sie die positiv-steuerende Steuerung und drehen Sie kurz. Fügen Sie fünf Mikroliter der Positivkontrolle zu 100 Mikroliter des Anreicherungsprodukts hinzu.Wirbel und Zentrifuge bei 15, 500 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie 10 Mikroliter der Schablone auf. Fügen Sie als Nächstes 20 Mikroliter der Sequenzierungsgrundierung und 15 Mikroliter des Glühpuffers zum Schablonenrohr hinzu.Wirbeln Sie das Rohr und drehen Sie kurz auf einer Mini-Zentrifuge für drei Sekunden. Inkubieren Sie das Rohr in einem thermischen Cycler mit einem beheizten Deckel. Dann fügen Sie 10 Mikroliter des Ladepuffers in das Rohr.Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten. Mischen Sie die 55 Mikroliter der Probe, indem Sie nach oben und unten pfeifen und laden Sie die Probe auf die Ladebohrung des Chips. Bewahren Sie die verwendete Pipettenspitze und den Nullpunkt zwei Milliliter PCR-Rohr.Legen Sie den Chip auf die Chip-Minizentrifuge, wenn eine Probe in den Chip eindringt. Überprüfen Sie die Position und zentrifugieren Sie den Chip für 10 Minuten. Bereiten Sie 50% Glühpuffer vor, indem Sie 500 Mikroliter Glühpuffer und 500 Mikroliter Nuklease-freies Wasser in ein ein Punkt-Fünf-Milliliter-Rohr geben.Bereiten Sie die Spüllösung vor, indem Sie 500 Mikroliter Glühpuffer und 500 Mikroliter 100%2-Propanol in ein ein Punkt fünf Milliliter Rohr. Dann bereiten Sie die Schaummischung vor, indem Sie 49 Mikroliter des 50%glühenden Puffers und einen Mikroliter der Schäumlösung zu zwei neuen ein Punkt-Fünf-Milliliter-Röhren hinzufügen. Rohrluft in eine der schäumenden Mischungen und 120 Mikroliter der Blasen in den Ladebrunnen laden.Übertragen Sie die übermäßig ausgestoßene Flüssigkeit aus dem Ausgang gut auf den Ladebrunnen, und zentrifugieren Sie den Chip für 30 Sekunden auf dem Chip Mini Zentrifuge. Wiederholen Sie den Vorgang für die zweite Schaummischung. Fügen Sie 55 Mikroliter des 50%glühenden Puffers in die am Nullpunkt gehaltene Zwei-Milliliter-Röhre.Verwenden Sie die gehaltene Pipettenspitze, um Pipette nach oben und unten zu pipette. Laden Sie alle 55 Mikroliter des Glühpuffers auf den Ladebrunnen. Zentrifugieren Sie den Chip für 30 Sekunden auf der dafür vorgesehenen Chip-Minizentrifuge.100 Mikroliter der Spüllösung in den Spanladebrunnen laden und die ausgestoßene Flüssigkeit aus dem Austrittsbrunnen entsorgen. Wiederholen Sie diesen Ladeschritt einmal. 100 Mikroliter des 50%glühenden Puffers in den Spanladebrunnen laden.Wiederholen Sie diesen Ladeschritt insgesamt dreimal. Fügen Sie 60 Mikroliter des 50%glühenden Puffers und sechs Mikroliter des Sequenzierungsenzyms in eine neue fünf Milliliter-Röhre ein. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten.Langsam Pipette 65 Mikroliter dieser gemischten Lösung in den Chip-Ladegut, Vermeidung von Blasen. Halten Sie den Chip von Licht fern und brüten Bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Schließlich, nach der Inkubation, laden Sie den Chip sofort auf den Sequenzer und klicken Sie auf die Sequenzierung auf dem Bildschirm starten, um die Sequenzierung zu starten.Eine retrospektive statistische Analyse von 186 Spaltstadium und 1135 Blastozysten-Stadium-Embryonen ergab über 95% WGA-Erfolgsraten in beiden Probentypen. Die Fehlerquote der Sequenzierung der Qualitätskontrolle betrug 3,4 % in der Spaltungsphase und nur 1,9 % in der Blastozysten-Stufengruppe. Neben der Aneuploidie können die Sequenzierungsdaten für andere Analysen verwendet werden.Kopieren Sie z. B. Zahlenvariationen mit einer Größe von weniger als fünf Megabasen oder mykondriale DNA-Analysen, abhängig von der Sequenzierungstiefe und -qualität. Mit der Verbesserung der Copy Number Calling können Forscher die Zukunft des chromosomalen Mosaikismus in menschlichen Embryos im Frühstadium weiter untersuchen.

semiconductor-sequencing-for-preimplantation-genetic-testing-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dieser Artikel beschreibt die Auswahl von geeigneten Sonden für Single-Cell-FISH, Verbreitung Techniken für Blastomere Kerne und in-situ-Hybridisierung und Signal-Scoring, angewandt auf Präimplantations-Diagnostik (PGD) in einer klinischen Umgebung.

FISH für Präimplantations-Diagnostik

Bisulfit-Mutagenese ist der Goldstandard für die Analyse von DNA-Methylierung. Unsere modifizierte Protokoll ermöglicht DNA-Methylierungs-Analyse auf der Ebene einzelner Zellen und wurde speziell für die einzelnen Eizellen entwickelt. Es kann auch für die Spaltung-Embryonen verwendet werden.

Einzel Oocyte Bisulfit-Mutagenese

Periventrikulären noduläre Heterotopie (PNH) ist die häufigste Form der Fehlbildung der kortikalen Entwicklung (MCD) im Erwachsenenalter, aber seine genetische Basis bleibt bei den sporadischen Fällen unbekannt. Vor kurzem haben wir eine Strategie, um neue Kandidatengene für MCDs zu identifizieren und direkt ihre ursächliche Rolle in Vivobestätigen.

Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren

Next Generation Sequencing (NGS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genomische Charakterisierung, die durch die hohe Fehlerquote der Plattform (~0.5–2.0%) begrenzt ist. Wir beschreiben unsere Methoden zur Sequenzierung Fehler korrigiert, mit denen wir umgehen die NGS Fehlerquote und erkennen Mutationen bei Variante Allel Brüche so selten wie 0,0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Meeresanemone Nematostella vectensis während der Gastrulation zu genotypisieren, ohne den Embryo zu opfern.

Genotypisierung von Sea Anemone während der frühen Entwicklung

Die vorliegende Studie berichtet über ein Protokoll für das Chromosomen-Screening menschlicher Embryonen, das verbrauchtes Kulturmedium verwendet, das eine Embryonenbiopsie vermeidet und die Identifizierung der Chromosomenploidie mittels NGS ermöglicht. Der vorliegende Artikel stellt das detaillierte Verfahren vor, einschließlich der Herstellung des Nährmediums, der Amplifikation des gesamten Genoms (WGA), der Vorbereitung der Next-Generation-Sequencing-Bibliothek (NGS) und der Datenanalyse.

Chromosomen-Screening von humanen Präimplantationsembryonen unter Verwendung von verbrauchtem Kulturmedium: Probenentnahme und Chromosomenploidie-Analyse

Das Protokoll stellt die gesamten Laborverfahren dar, die für Präimplantations-Gentests auf Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Next-Generation-Sequenzierungsplattform erforderlich sind. Hier präsentieren wir die detaillierten Schritte der Amplifikation des gesamten Genoms, der DNA-Fragmentauswahl, des Bibliotheksaufbaus, der Template-Vorbereitung und des Sequenzierungs-Arbeitsablaufs mit repräsentativen Ergebnissen.

Präimplantations-Gentests für Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Next-Generation-Sequenzierungsplattform

Dieses Protokoll schlägt ganzheitliche Laborverfahren vor, die zum Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen in Magenkrebsproben auf der Grundlage einer Ionen-Halbleiter-Sequenzierungsplattform erforderlich sind. Die Zielsequenzen, Ligationsadapter, Bibliotheksamplifikation und -reinigung sowie die Kriterien für die Qualitätskontrolle werden ebenfalls detailliert beschrieben.

Nachweis von Multi-Gen-Einzelnukleotid-Polymorphismen bei Magenkrebs basierend auf einer Ionen-Halbleiter-Sequenzierungsplattform

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu untersuchen, genomweite DNA-Methylierung in großem Maßstab klinischen Patienten-Screening-Studien unter Verwendung des Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq oder MBD-seq) Technologie und die anschließende bioinformatische Analyse-Pipeline.

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Wir berichten hier über Methoden zur molekulargenetischen Manipulation des Yarrowia lipolytica Po1g-Stammes zur Verbesserung der Gendeletionseffizienz. Die daraus resultierenden gentechnisch veränderten Y. lipolytica-Stämme haben potenzielle Anwendungen in der Biokraftstoff- und biochemischen Produktion.

Genetic Engineering eines Unconventional Hefe für Erneuerbare Biokraftstoff- und Biochemie Produktion

Erfahren Sie die Halbleitersequenzierung für präimplantationsgenetische Tests auf Aneuploidie. Diese Methode ermöglicht schnelle, kostengünstige und zuverlässige Embryo-Screenings mit kurzer Durchlaufzeit.

Halbleitersequenzierung für Präimplantationsgenetische Tests für Aneuploidie

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