Name: Rasche Lipid Droplet Isolation Protokoll verwendet eine gut etablierte Organell-Isolierungskit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Erfahren Sie eine modifizierte Methode zur Lipid-Droplet-Isolation aus Mäuselebern mittels kommerziellen ER-Isolierungskits. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Aufreinigung mehrerer Organellen und erleichtert die Erforschung von Lipidstoffwechsel und Lebererkrankungen.

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Wir danken der Abramson Familie Cancer Research Institute. Diese Arbeit wird unterstützt durch folgende Zuschüsse: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos Medical Faculty Development Award, 7158, IDOM DRK Pilot Award P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH P30-DK050306 unterstützt und seine Kern-Einrichtungen (Molekularpathologie und Imaging Core, Molekularbiologie/Gene Expression Kern und Kultur Zellkern) und der Pilot Programm gewähren. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Alle Experimente wurden auf einem Labortisch mit persönlicher Schutzausrüstung geeignet für Biosafety Niveau 1, einschließlich einen Kittel, Handschuhe und Schutzbrille. Versuche wurden nach der Genehmigung durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Pennsylvania Protokollen durchgeführt. Wurden alle Anstrengungen unternommen, um tierische Beschwerden zu minimieren, und die Tiere wurden humane pfleglich behandelt.
(1) LD-Isolierung mit einer ER-Isolierungskit
<ol><li>
Vorbereitung Hinweis: Die aufgeführten Beträge eignen sich für eine einzelne 1 g-Maus-Leber.<ol>
<li>Bereiten Sie 10 mL 1 X isotonische Extraktionspuffer (IE Puffer, aus dem ER Isolierungskit vor) durch Verdünnung 2 mL 5 X IE Puffer mit 8 mL Reinstwasser. Kühlen Sie den Puffer ab, indem es auf Eis.</li>
		<li>Bereiten Sie 100 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS vor) durch Verdünnung 10 mL 10 X PBS in 90 mL Reinstwasser. Indem es auf Eis abkühlen.</li>
		<li>10 mL 5 %-Polyethylenglykol- p--(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-Phenyl-Äther (PGPE) durch Verdünnung 500 µL PGPE in 9,5 mL Reinstwasser vorbereiten. Verwenden Sie eine 1 mL Spritze, um PGPE zu messen, wie es dickflüssig ist. Indem es auf Eis abkühlen.</li>
		<li>Cool alle Röhren auf Eis gelegt: 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen, 15 mL Zentrifuge Rohre, 50 mL High-Speed-Zentrifuge Röhren und 13 mL Ultrazentrifugen Röhren.</li>
		<li>Cool alle benötigten Zentrifugen auf 4 ° C: ein Microcentrifuge eine Hochleistungs-Zentrifuge für 15 mL Tuben, eine High-Speed-Zentrifuge für 50 mL Röhrchen und einer Ultrazentrifuge.</li>
		<li>Zange und Dissektion Schere durch Autoklavieren zu sterilisieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gewebe-Vorbereitung
	<ol>
<li>Einschläfern der Maus, indem man sie in eine Kammer gefüllt mit 100 % CO2 für 10 min. bestätigen Euthanasie durch zervikale Dislokation durchführen.</li>
		<li>Verwendung von sterilen Pinzette und Dissektion Schere, schneiden Sie die Haut und Muskel Schichten des Bauches auf der vorderen/hinteren Achse, die Leber verfügbar zu machen.</li>
		<li>Schneiden Sie die Bänder verbinden die Leber mit dem Zwerchfell und Darm. Verwenden Sie Zange um den Darm Weg von der Leber, in Richtung der hinteren Bänder verfügbar machen zu ziehen.</li>
		<li>Zwischen der Leber und der dorsalen Rippen geschnitten, ist befreit von anterior Posterior bewegen, bis die Leber.</li>
		<li>Übertragen Sie die Leber auf einem kalten 5 cm Petrischale mit 10 mL kalten 1 X PBS.</li>
		<li>Waschen Sie die Leber 2 X auf einer rockigen Plattform in 10 mL kalten 1 X PBS für 5 min bei 4 ° C in den 5 cm Petrischale. 1 X PBS nach dem letzten Waschen abgießen.</li>
		<li>Eine Größe-10 sterile chirurgische Messer verwenden (siehe Tabelle der Materialien), um die Leber in 3 – 5 mm Stücke in den 5 cm Petrischale (Abbildung 1A) Würfeln.</li>
		<li>Waschen Sie die gewürfelte Leber 2 X mit 10 mL kalten 1 X PBS für 5 min bei 4 ° C in den 5 cm Petrischale. Hinweis: Für Lysosomen Isolierung, 0,5 g Leber auf eine saubere 45 mL Homogenisator übertragen und folgen Sie den Anweisungen geliefert durch den Lysosomen Extraktion kit (siehe die Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Dekantieren Sie 1 X PBS und übertragen Sie die gewürfelte Leber Stücke auf der kalten 45 mL Dounce-Homogenisator. Stellen Sie sicher, dass alle Teile am unteren Rand der Homogenisator gehen.</li>
		<li>7 mL kalten 1 X IE Puffer (aus dem ER Isolierungskit) hinzugeben und auf Eis durch Verschieben der Stößel nach oben und unten 20 X homogenisieren. Sicherstellen Sie, dass der Stößel am unteren Rand der Homogenisator bei jedem Schlag geht.</li>
		<li>Übertragen Sie das Homogenat (Abbildung 1 b) auf eine kalte 15 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Spülen Sie den Homogenisator mit 1 mL kalten 1 x IE Puffer (aus dem ER Isolierungskit) und fügen Sie diese mit dem Rest der Homogenat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LD-Isolierung
	<ol>
<li>Entfernen Sie Kerne durch Zentrifugieren das Homogenat in einer Hochleistungs-Zentrifuge bei 1.000 X g für 10 min bei 4 ° C (Abbildung 1).</li>
		<li>Übertragen Sie die postnukleare überstand (PNS) auf eine neue, kalte 50 mL Zentrifugenröhrchen. Um LD Verlust zu vermeiden, sicherstellen Sie, dass Lipid versammelten sich am oberen Rand der 15 mL Tube Nukleinsäuretablette ist, vor der Übertragung der PNS.</li>
		<li>Nehmen Sie 100 µL aliquoten der PNS für Reinheitsanalyse und legen Sie sie in einen kalten 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch. Legen Sie es beiseite auf Eis.</li>
		<li>Entfernen Sie Mitochondrien, Zentrifugieren der PNS Probe, nicht den Aliquoten in einer gekühlten High-Speed-Zentrifuge bei 12.000 X g für 15 min bei 4 ° C.<ol>
<li>Optional: für Rohöl LD (CLD) Isolate (mit Zellflüssigkeit und Zellmembran Kontamination), die obere Lipidschicht mit einer Glaspipette zu sammeln und zu einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen werden. 1.4 Abschnitt weiter.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Übertragen Sie den postmitochondrial überstand (PMS) auf einer Ultrazentrifuge Rohr. Um LD Verlust zu vermeiden, sicherstellen Sie, dass Lipid versammelten sich am oberen Nukleinsäuretablette ist, vor der Übertragung der PMS.</li>
		<li>Nehmen Sie 100 µL aliquoten von PMS für Reinheitsanalyse und legen Sie sie in einen kalten 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch. Legen Sie es beiseite auf Eis.</li>
		<li>Kälte 1 x IE Puffer gegen das Rohr zusammenbricht während Ultrazentrifugation füllen Sie einer Ultrazentrifuge Rohr bis zum Rand ein.</li>
		<li>Balancieren Sie die Proben zu und Zentrifugieren sie in einer Ultrazentrifuge bei 100.000 X g für 60 min bei 4 ° C (Abbildung 1).</li>
		<li>Um die LD-Schicht entfernen, kippen Sie das Rohr in einem Winkel von 45° und mit einer Glaspipette Aspirieren. Übertragen Sie das Pellet auf einen kalten 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch. Hinweis: Die Tablette enthält isolierte ER. Verwenden Sie diese Fraktion flussabwärts ER isoliert.</li>
		<li>Sammeln Sie 100 µL des Überstands Post-ER (PER) unter die Lipidschicht für Reinheitsanalyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LD-waschen
	<ol>
<li>Die LD-Fraktion gesammelt in einem 1,7 Microcentrifuge Schlauch auf ein Gesamtvolumen von 1,3 mL fügen Sie 1 X PBS hinzu.</li>
		<li>Wirbel der Probe.</li>
		<li>Zentrifuge in einem Microcentrifuge Höchstgeschwindigkeit für 5 min bei 4 ° C zu jeder Zellenrückstand Pellets. Erwärmen Sie das Rohr sanft mit den Händen zu helfen, die LD-Schicht aufzuwirbeln. Übertragen Sie den Überstand, einschließlich die Lipidschicht, zu einem neuen 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1–1.4.3 2 X, x-3, bis die Kugel nicht mehr sichtbar ist.</li>
		<li>Die Pellet-freie LD überstand zu einem Endvolumen von 1,5 mL 1 X PBS hinzufügen. Waschen Sie die Lipid-Anteil durch Zentrifugieren in einem Microcentrifuge Höchstgeschwindigkeit für 5 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Entfernen Sie 1 mL 1 X PBS (unterhalb der Lipidschicht) mit einer Glaspipette ohne Störung der Lipidschicht.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.4.5 und 1.4.6 x-5 4-Fach, bis 1 X PBS mit keine Trübung visuell transparent ist.</li>
		<li>Entfernen Sie alle 1 X PBS unterhalb der Lipidschicht mit einer Glaspipette (Abb. 1E).</li>
		<li>Verwenden Sie das Ergebnis, eine reine LD Bruchteil für nachgelagerte Analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LD Protein Quantifizierung von Bicinchoninic Acid Test Hinweis: Verwenden Sie eine Bicinchoninic Säure-Assay (BCA) nicht, wenn LD Morphologie soll beurteilt werden.<ol>
<li>Die LD in 500 μl 5 % PGPE aufzuwirbeln.</li>
		<li>Kochen Sie die Proben 5 min bei 95 ° C, Wirbel, und inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 5 min abkühlen lassen.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 1.5.2 eine zusätzliche 2 X.</li>
		<li>Beschallen Sie die Proben 5 min mit einem 30 s ein-/aus-Zyklus, bei mittlerer Intensität.</li>
		<li>Normalisieren Sie die Proben durch die Messung der Konzentration des Proteins in aller Reinheit Analyse Proben und in der LD-Fraktion von BCA-Assay.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) LD-Isolierung mit Saccharose Dichtegradient
<ol><li>
Vorbereitung
	<ol>
<li>200 mL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8.0]) zu machen. Indem es auf Eis abkühlen.</li>
		<li>Machen Sie 100 mL 60 % (w/V) Saccharoselösung in TE-Puffer durch Auflösen von 60 g Saccharose in TE-Puffer, bringen das Endvolumen bis 100 mL. Indem es auf Eis abkühlen.</li>
		<li>6 mL Zuckerlösung 40 % (w/V) durch Zugabe von 4 mL 60 % Saccharose, 2 mL TE-Puffer zu machen. Indem es auf Eis abkühlen.</li>
		<li>6 mL Zuckerlösung 25 % (w/V) durch Zugabe von 2,5 mL 60 % Saccharose zu 3,5 mL TE-Puffer zu machen. Indem es auf Eis abkühlen.</li>
		<li>4 mL 10 % (w/V) Saccharose-Lösung durch Zugabe von 60 % Saccharose 0,7 mL bis 3,3 mL von TE-Puffer zu machen. Indem es auf Eis abkühlen.</li>
		<li>Machen Sie 10 mL Protease und Phosphatase-Inhibitor-Lösung, indem Sie eine Tablette von Protease und Phosphatase-Inhibitoren, 10 mL von TE-Puffer.</li>
		<li>Bereiten Sie Gewebe Homogenat Puffer, indem Sie 50 mL 60 % Saccharose Stammlösung 4 mL Protease und Phosphatase-Inhibitor-Lösung hinzufügen. Indem es auf Eis abkühlen.</li>
		<li>Bereiten Sie Overlay Puffer durch Zugabe von 2 mL der Protease und Phosphatase-Inhibitor-Lösung, 50 mL von TE-Puffer. Indem es auf Eis abkühlen.</li>
		<li>Bereiten Sie 100 mL 1 X PBS verdünnen 10 mL 10 X PBS in 90 mL Reinstwasser vor. Indem es auf Eis abkühlen.</li>
		<li>Vorbereitung 10 mL 5 % PGPE durch Verdünnung 500 µL PGPE in 9,5 mL Reinstwasser. Verwenden Sie eine 1 mL Spritze, um PGPE zu messen, wie es dickflüssig ist. Indem es auf Eis abkühlen.</li>
		<li>Die folgenden Zentrifuge Rohre, indem sie auf Eis abkühlen: 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen, 15 mL Zentrifuge Rohre, 50 mL High-Speed-Zentrifuge Röhren und 13 mL Ultrazentrifugen Röhren.</li>
		<li>Cool die benötigten Zentrifugen auf 4 ° C: a Microcentrifuge, eine Hochleistungs-Zentrifuge (für 15 mL Röhrchen), eine High-Speed-Zentrifuge (für 50 mL Röhrchen) und einer Ultrazentrifuge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gewebe-Vorbereitung
	<ol>
<li>Verwenden Sie Schritte 1.2.1–1.2.9 zur Homogenisierung des Gewebes Vorbereitung.</li>
		<li>7 mL kalte Gewebe Homogenat Puffer hinzugeben und durch Verschieben der Stößel nach oben und unten 20 X auf dem Eis zu homogenisieren. Während die ersten fünf Striche sicherzustellen Sie, dass die Stößel am unteren Rand der Homogenisator geht.</li>
		<li>Übertragen Sie das Homogenat auf eine kalte 15 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Spülen Sie den Homogenisator mit 1 mL kalte Gewebe Homogenat Puffer und überträgt es auf die bisher verwendeten 15 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Bringen Sie das Volumen der Homogenat bis zu 10 mL mit Gewebe Homogenat Puffer.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe in einer Hochleistungs-Zentrifuge bei 1.000 X g für 10 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Übertragen Sie 8 mL Überstand auf eine 50 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Übertragen Sie 100 µL der restlichen Überstand als PNS Probe zur Reinheitsanalyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Saccharose Farbverlauf
	<ol>
<li>Kippen Sie die 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 8 mL PNS in einem Winkel von 45°. Hinzugeben Sie 6 mL 40 % Saccharoselösung, sicherzustellen, dass die beiden Phasen getrennt bleiben vorsichtig.</li>
		<li>Fügen Sie in ähnlicher Weise langsam 6 mL 25 % Saccharose-Lösung hinzu; Fügen Sie 4 mL 10 % Saccharose-Lösung; Schließlich fügen Sie 8 mL Overlay-Puffer.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe in einer High-Speed-Zentrifuge bei 30.000 X g bei 4 ° C für 30 min.</li>
		<li>Übertragen Sie die oberste Schicht mit der Kirche Jesu Christi zu einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Führen Sie für LD waschen die Schritte in Abschnitt 1.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Lipid+Droplets+from+Cells+by+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lipid+droplets+from+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating lipid droplets from multiple species.</a> Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).</li>
<li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49(2015).</li>
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<li>Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+ceramide+synthase+6+in+mouse+and+human+alcoholic+steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis.</a> FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).</li>
<li>Carr, R. M., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+lipid+droplet+proteins+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipin+Staining+Distinguishes+Between+Steatosis+and+Nonalcoholic%5BTitle%5D)+AND+%22Steatohepatitis+in+Adults+and+Children.+Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic.</a> Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+TIP47+improves+hepatic+steatosis+and+glucose+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).</li>
<li>Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+perilipin+2+prevents+hepatic+steatosis%2C+glucose+intolerance+and+ceramide+accumulation+in+alcohol-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice.</a> PLoS One. 9 (5), e97118(2014).</li>
<li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+constitutive+lipid+droplet+protein+PLIN2+regulates+autophagy+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver.</a> Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).</li>
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<li>Liu, K., Czaja, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid+stores+and+metabolism+by+lipophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).</li>
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<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologically+and+Functionally+Distinct+Lipid+Droplet+Subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations.</a> Scientific Reports. 6, 29539(2016).</li>
</ol>

Dr. Carr wird vom Abfangen Pharma Forschung unterstützt.

Hepatische LD Biologie werden zunehmend als kritische Regulator des hepatozellulären Physiologie in Gesundheit und Krankheit erkannt. Als bona fide Organellen LDs sind dynamisch, interagieren mit anderen Zellstrukturen und enthalten innerhalb Sie bioaktive Komponenten Lipid- und Glukose Homöostase beteiligt. Die Saccharose Steigung wird routinemäßig für LD Isolierung eingesetzt und ermöglicht Ermittler LD Struktur untersuchen, aber es zwingt sie zu zahlreichen Puffer zu machen. Wir haben gezeigt, dass die Verwendung eine...

Kirche Jesu Christi sind bioaktive Organellen in der Zellflüssigkeit der meisten eukaryotischen Zellen und einige prokaryotische Zellen1,2,3gefunden. Der LD-Kern besteht aus neutralen Lipiden wie Triglyceride (TG) und Cholesterin-Ester. Sie enthalten auch Ceramide, bioaktiver Lipide zellulären Signal-Wege4,5beteiligt. LDs sind umgeben von einem Phospholipid Monolage und beschichtet mit Proteinen, einschließlich der Perilipin Proteine Perilipin 2 (PLIN2) und 3 (PLIN3)1,5,6. Anwesend sind auch Lipogenic Enzyme Lipasen und Menschenhandel Membranproteine, die mehrere hepatischen steatotic Krankheiten, einschließlich Nichtalkoholische Fettleber, alkoholische Leberkrankheit und Hepatitis C3,5 verbunden ,6,7,8,9,10.
Hlt werden gedacht, um von der äußeren Membran von der Notaufnahme bilden und enthalten neugebildete TG von freien Fettsäuren ER abgeleitet11bezogen. Es bleibt jedoch unbekannt, ob die gepoolten Lipide Knospe, verbunden bleiben, oder werden herausgeschnitten, aus der ER6,11, so dass die Isolierung des LDs befreit ER technisch anspruchsvoll. Freie Fettsäuren können durch die Wirkung der Oberfläche Lipasen vorzusehen, Energieerzeugung oder Membran-Synthese von LDs befreit werden. Darüber hinaus können LDs über Lipophagy als Regelmechanismus und freie Fettsäuren12produzieren abgebaut werden.
Neben der ER und Lysosomen, gibt es andere Organellen – z. B. Endosomen, Mitochondrien, Peroxisomen und die Plasmamembran – in enger Zusammenarbeit von LDs11enthalten sind. Diese engen Polygamie macht es schwierig, eine reine LD-Extraktion durchführen. Jedoch kann neutrale Lipide angeborenen geringer Dichte durch Zentrifugation5genutzt werden.
Traditionell wurden LDs isoliert mit einer Saccharose Dichte Gradienten1,5,13. Jedoch wurden diese Methoden nicht so andere Organellen zu isolieren. Darüber hinaus benötigen sie die zeitraubende Vorbereitung der Reagenzien. Dieses Protokoll passt eine handelsübliche ER Isolation kit (siehe die Tabelle der Materialien), um LD Isolierung zu ermöglichen. Wir verwenden die Extraktionspuffer zur Verfügung gestellt durch das Kit einen LD Isolierung Schritt hinzugefügt. Darüber hinaus kann das Protokoll auch für ER und lysosomale Isolation unter Verwendung der gleichen Proben, damit ein umfassenderes Bild des Lebenszyklus von LDs verwendet werden. Um diese neue Methode zu überprüfen, überprüfen wir LD Ertrag, Morphologie, Größe und Reinheit. Wir vergleichen die Ergebnisse, die hier zu denen, die mit einem weit verbreiteten Protokoll unter Verwendung einer Saccharose Steigung für LD-Isolierung.
Wir verwendeten eine 10 bis 12-Wochen alten, 20 g weiblichen C57BL/6 Maus fastete für 16 h (Essen Entfernung um 17:00 09:00 LD Isolierung Zeit) mit freiem Zugang zu Wasser. Die typische Ausbeute für TG beträgt 0,6 mg/g Leber, und es ist für LD Protein, 0,25 mg/g Leber. Dies bietet genügend Material für ~ 10 Immunoblots von SDS-PAGE. Das Protokoll unten Details der verwendeten Reagenzien und ein Protokoll für eine einzelne 1 g Leber geeignet. Die Saccharose gradient Isolierung Protokoll ist Sato14 und Wu15angepasst.

<table><tbody><tr><td>BioExpress Vortex Mixer</td><td>GeneMate</td><td>S-3200-1</td><td>Vortex Mixer</td></tr><tr><td>Zentrifuge 54242 R</td><td>Eppendorf</td><td>54242 R</td><td>Kühlzähler Mikrozentrifuge Rotor: FA-45-24-11</td></tr><tr><td>Zentrifuge Sorvall RC6 +</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC6+</td><td>Gekühlte Hochgeschwindigkeitszentrifuge Rotor: F21S-8x50y</td></tr><tr><td>Zentrifuge Sorvall Legend RT+</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend RT+</td><td>Gekühlte Zentrifuge mit hoher Kapazität Rotor: 75006445 Eimer: 75006441</td></tr><tr><td>cOmplete Proteaseinhibitor Cocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 693 116 001</td><td>Proteasehemmer Tabletten</td></tr><tr><td>Diagenode Bioruptur UCD-200</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td>Beschallungssystem</td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder (45 mL)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td>Verwendung von losem Stößel</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x)</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Endoplasmatisches Retikulum-Isolationskit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ER0100</td><td>Für die ER-Kit-Extraktion: Enthält: Isotonischer Extraktionspuffer 5X 100 mL hypotonischer Extraktionspuffer 10 mL Calciumchlorid, 2,5 M Lösung 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nose Needle 1 Stk.</td></tr><tr><td>Externe Lichtquelle für die Fluoreszenzanregung</td><td>Leica</td><td>Leica EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758</td><td>Salzsäure</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Bildanalysesoftware</td></tr><tr><td>Invertiertes modulierendes Kontrastmikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>Lysosomenanreicherungskit für Gewebe und kultivierte Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89839</td><td>Für Lysosomen-Isolationsmikroskop</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Qimaging</td><td>QICAM fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>Optima XL-100K Ultrazentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>XL-100K</td><td>Ultrazentrifuge Rotor: SW41Ti</td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-042817</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 5 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 906 845 001</td><td>Phosphatase-Inhibior Tabletten</td></tr><tr><td>Sterile Chirurgische Klinge #10</td><td>Pioneer</td><td>S2646</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td>Kristallin/Zertifiziertes ACS</td></tr><tr><td>Triglycerid Liquicolor Kit</td><td>Stanbio&nbsp;</td><td>2200-225</td><td>Kolorimetrisches Triglycerid-Kit</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Für TE-Puffer</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151-100</td><td>5%, Polyethylenglykol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenylether, Proteinlysereagenz</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA (0,5M, pH 8,0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td>Für TE-Puffer</td></tr></tbody></table>

rasche lipid droplet isolation protokoll verwendet eine gut etablierte organell-isolierungskit

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid-Tröpfchen (LDs) sind bioaktive Organellen innerhalb der Zellflüssigkeit der meisten eukaryotischen und einige prokaryotischen Zellen gefunden. Kirche Jesu Christi bestehen aus neutralen Lipiden, umhüllt von einer Monoschicht von Phospholipiden und Proteinen. Hepatische LD Lipide, wie Ceramide und Proteine sind in mehrere Krankheiten verwickelt, die hepatische Steatose verursachen. Obwohl die bisherige Methoden für LD isoliert aufgestellt wurden, sie erfordern eine aufwändige Vorbereitung der Reagenzien und eignen sich nicht für die Isolierung von mehreren subzelluläre Kompartimente. Wir wollten ein neues Protokoll zu ermöglichen, die Isolation der LDs, endoplasmatische Retikulum (ER) und Lysosomen aus einem einzigen Mausklick Leber zu etablieren.
Weitere, alle Reagenzien im hier vorgestellten Protokoll sind im Handel erhältlich und erfordern minimale Reagenz Vorbereitung ohne Einbußen bei der LD Reinheit. Hier stellen wir Vergleiche dieses neue Protokoll zu einem standard Saccharose-gradient-Protokoll zeigen vergleichbare Reinheit, Morphologie und Ertrag. Darüber hinaus können wir ER Lysosomen mit der gleichen Probe isolieren und detaillierte Einblicke in die Entstehung und intrazellulären Flux von Lipiden und ihre assoziierten Proteinen.

Wir haben die LD-Isolierung mit dem ER Kit auf ca. 30 Mäusen durchgeführt und verglichen die Ergebnisse mit denen nach der Saccharose-Isolierung-Protokolls auf ca. 40 Mäuse. Die berichteten Ergebnisse sind typisch für beide Protokolle. Mäusen wurden über Nacht mit freiem Zugang zu Wasser, zu den LD-Ertrag steigern gefastet. LD-Isolierung mit einem Farbverlauf von Saccharose lief parallel mit dem ER Kit LD Isolierung Protokoll. Proben von PNS, PMS, v., Markierungen und LDs während ER Kit L...

Dieses Protokoll stellt eine neuartige Methode der Lipid Droplet Isolation und Reinigung von Maus Lebern, mit einem etablierten endoplasmatische Retikulum Isolierung-Kit.

Rasche Lipid Droplet Isolation Protokoll verwendet eine gut etablierte Organell-Isolierungskit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Die Erforschung der Lipidtropfenbiologie wurde durch Reinigungsschwierigkeiten behindert. Darüber hinaus erfordert das Studium des zellulären Lipidflusses die gleichzeitige Reinigung mehrerer Organellen, und es waren derzeit keine einfachen Protokolle verfügbar. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, die Fetttropfenreinigung zugänglicher zu machen.Wir modifizierten ein kommerziell erhältliches Kit, um gleichzeitig Lipidtröpfchen, endoplasmatisches Retikulum und Lysosomen aus einer einzigen Probe zu isolieren. Leberlipid Tröpfchen Akkumulation prädisponiert adipöse und alkoholische Patienten zu progressiven Lebererkrankungen. Dies hat den Blick auf Lipidtröpfchen von inerten Staufächern auf dynamische biologisch wichtige Organellen verlagert.Verwenden Sie zunächst sterile Zangen und Sezierscheren, um die Haut- und Muskelschichten des Bauches der eingeschläferten Maus auf der hinteren vorderen Achse zu schneiden und die Leber freizulegen. Schneiden Sie die Bänder, die die Leber mit dem Darm verbinden. Mit Zangen, ziehen Sie den Darm weg von der Leber, in Richtung der hinteren.Schneiden Sie das Band, das die Leber mit dem Zwerchfell verbindet. Dann zwischen der Leber und dem rückenden Brustkorb schneiden, von vorn zu hinter, bis die Leber befreit ist. Die Leber auf eine kalte Fünf-Zentimeter-Petrischale mit 10 Millilitern kalten 1x PBS übertragen und die Leber zweimal auf einer Schaukelplattform in 10 Milliliter kaltem 1x PBS für fünf Minuten bei vier Grad Celsius waschen.Nach der letzten Wäsche, gießen Sie die 1x PBS, und verwenden Sie eine Größe-10 sterile chirurgische Klinge, um die Leber in drei bis fünf Millimeter Stücke innerhalb der Schale zu würfeln. Dann waschen Sie die gewürfelte Leber zweimal mit 10 Milliliter kalte 1x PBS für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie die 1x PBS, und übertragen Sie die gewürfelten Leberstücke auf einen kalten 45-Milliliter Dounce Homogenisator, um sicherzustellen, dass sich alle Teile am Boden befinden.Fügen Sie sieben Milliliter kalten 1x IE Puffer hinzu. Homogenisieren Sie auf Eis, indem Sie den Stößel 20 Mal nach oben und unten bewegen, um sicherzustellen, dass der Stößel bei jedem Schlag auf den Boden des Homogenisators geht. Das Homogenat in ein kaltes 15-Milliliter-Zentrifugenrohr geben.Spülen Sie den Homogenisator mit einem Milliliter kalten 1x IE Puffer, und fügen Sie ihn dem Rest des Homogenats hinzu. Um Die Kerne zu entfernen, zentrieren Sie das Homogenat in einer Hochleistungszentrifuge bei 1 000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass alle Lipide, die oben in der 15-Milliliter-Röhre gesammelt werden, resuspendiert werden, um LD-Verlust zu verhindern.Um sicherzustellen, dass das Kernpellet an der Unterseite des Rohres ungestört ist, übertragen Sie den lipidhaltigen postnuklearen Überstand in ein frisches kaltes 50-Milliliter-Zentrifugenrohr. Übertragen Sie ein 100-Mikroliter-Aliquot des postnuklearen Überstandes auf ein kaltes 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr auf Eis für eine spätere Reinheitsanalyse. Um Mitochondrien zu entfernen, zentrifugieren Sie die post-nukleare Überstandprobe in einer gekühlten Hochgeschwindigkeitszentrifuge bei 12.000 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.Stellen Sie sicher, dass alle lipide, die an der Oberseite des Rohres gesammelt werden, resuspendiert wird, um LD-Verlust zu verhindern, und übertragen Sie dann den post-mitochondrialen Überstand auf ein 13-Milliliter-Ultrazentrifugenrohr. Übertragen Sie einen 100-Mikroliter-Aliquot des post-mitochondrialen Überstandes auf ein kaltes 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr auf Eis zur späteren Reinheitsanalyse. Füllen Sie das Ultrazentrifugenrohr mit post-mitochondrialem Überstand bis zum Rand mit kaltem 1x IE Puffer, um zu verhindern, dass es während der Ultrazentrifugation zusammenbricht.Die Proben ausbalancieren und dann in einer Ultrazentrifuge bei 100.000 mal g 60 Minuten bei vier Grad Celsius zentrieren. Um die LD-Schicht zu entfernen, neigen Sie das Rohr in einem 45-Grad-Winkel, und aspirieren Sie mit einer Glaspipette. Nach der Übertragung des Pellets in ein kaltes 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, sammeln Sie 100 Mikroliter des Post-ER-Überstandes unter der Lipidschicht für die Reinheitsanalyse.Um Zellablagerungen zu pellet, Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Dann wärmen Sie das Rohr sanft mit den Händen, um die LD-Schicht wieder aufzuhängen, und übertragen Sie den Überstand, einschließlich der Lipidschicht, auf ein neues 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Wiederholen Sie diese Waschschritte, wärmen Sie das Rohr zwei- bis dreimal, bis das Pellet nicht mehr sichtbar ist.Um dann den pelletfreien LD-Überstand zu waschen, fügen Sie 1x PBS zu einem Endvolumen von 1,5 Millilitern hinzu und zentrifugieren Sie in einer Mikrozentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine Glaspipette, um einen Milliliter 1x PBS zu entfernen, der sich unter der Lipidschicht befindet, ohne die Lipidschicht zu stören. Wiederholen Sie das WASCHEN von LD vier- bis fünfmal, bis die 1x PBS optisch transparent und ohne Trübung ist.Verwenden Sie dann eine Glaspipette, um alle 1x PBS unterhalb der Lipidschicht zu entfernen, und verwenden Sie die resultierende reine LD-Fraktion für die nachgeschaltete Analyse. Als repräsentative 20x fluoreszierende und hellfeldfarbene LD-Bilder sowohl aus der ER-Kit-LD-Isolierung als auch aus den Sukzessa-LD-Isolationsmethoden aufgenommen wurden, zeigten sie ähnliche Feinstaubwerte auf, was auf ähnliche Reinheitsgrade mit zwei verschiedenen Protokollen hindeutet. Nach der Reinigung wurden LD-Triglycerid- und Proteinspiegel mit kolorimetrischen Assays gemessen, und die Daten wurden auf das Lebergewicht normalisiert, was zeigt, dass bei normalisiertem Ausgangsmaterial die LD-Triglycerid- und Proteinerträge mit dem ER-Kit und der Saccharosemethode ähnlich waren.LD-Durchmesser wurden mit Hilfe einer Bildanalyse-Software quantifiziert, was zeigt, dass die ER-Kit-LD-Isolierung und die Saccharose-LD-Isolierung LDs ähnlicher Größen ergaben. Zur Beurteilung der LD-Reinheit wurden Proben durch Immunoblotting untersucht, was zeigte, dass die lDs, die aus der ER-Kit-LD-Isolierung und dem Saccharosegradientenprotokoll abgeleitet wurden, beide die gleiche Reinheit hatten. PLIN2, ein LD-Marker, wurde in allen Proben mit Ausnahme des ER-Kits LD-Isolationper und des PNS der Saccharose nachgewiesen.Die Reinheitsanalyse einer ER-Fraktion mit Immunoblots zeigt, dass sie frei von LD-Marker PLIN2 waren, aber signifikante Konzentrationen des ER SEC61A-Proteins hatten. Die Reinheit einer lysosomalen Fraktion nach weiterer Reinigung von Lysosomen mit dem Lysosomenanreicherungskit wurde ebenfalls bewertet. Discovery ist derzeit die nützlichste Anwendung unseres Protokolls.Wir führen Lipidomik in gereinigten Organellen durch und zeigten, dass Lipotoxine speziell bei Lipidtröpfchen bei alkoholischen Lebererkrankungen erhöht werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Visualisierung der Bildung der immunologischen Synapse in natürlichen Killerzellen (NK) auf einer gestützten Lipiddoppelschicht (SLB). Der SLB wird zunächst mit einem Fluorophor-markierten NK-Zell-aktivierenden Rezeptorliganden markiert, gefolgt von der Inkubation mit NK-Zellen. Anschließend werden die Zellen mit polymerisiertem Aktin und Perforin-positiven lytischen Granulaten angefärbt. Dieser Ansatz ermöglicht die Visualisierung der Synapsenbildung...

Super-Resolution-Bildgebung der immunologischen Synapsenbildung von NK-Zellen auf einer gestützten Lipiddoppelschicht

Reconstituting funktionellen Membranproteinen in riesige Liposomen definierter Zusammensetzung ist ein leistungsfähiges Konzept, wenn es mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie kombiniert. Dagegen dürfen herkömmliche Riese Liposomen Produktion unvereinbar mit Proteinstabilität. Wir beschreiben Protokolle zur Herstellung Riese Liposomen aus reinem Lipide oder kleine Liposomen, die Ionenkanäle.

Riesen-Liposomen-Herstellung für Imaging und Patch-Clamp-Elektrophysiologie

Zwei Techniken zur Isolierung zellulärer Lipidtröpfchen von 1) Hefe-Zellen und 2) menschlichen Plazenten werden vorgestellt. Das Herzstück der beiden Verfahren ist die Dichte-Zentrifugation, wobei die resultierende Schwimmschicht, die die Tröpfchen leicht mit dem Auge sichtbar gemacht werden, extrahiert und mittels Western-Blot-Analyse für Reinheit quantifiziert.

Isolierung von Cellular Lipid Droplets: Zwei Reinigungstechniken Ausgehend von Hefezellen und menschlichen Plazenten

MicroRNAs spielen eine wichtige regulatorische Rolle und werden als neue therapeutische Targets für verschiedene menschliche Krankheiten entstehen. Es hat sich gezeigt, dass miRNAs in Lipoproteinen hoher Dichte durchgeführt werden. Wir haben ein vereinfachtes Verfahren entwickelt, um schnell gereinigter HDL für miRNA-Analyse von Humanplasma geeignet isolieren.

Schnelle und vereinfachte Verfahren für Hochdurchsatz-Isolierung von miRNA aus Highly Purified High Density Lipoprotein

Hier präsentieren wir ein Protokoll Single, SNARE-vermittelte Fusion Ereignisse zwischen Liposomen und unterstützt Bilayer in mikrofluidischen Kanälen unter Verwendung von polarisierten TIRFM, mit Einzelmolekülempfindlichkeit und ~ 15 ms Zeitauflösung zu erfassen. Lipid und lösliche Ladung Freisetzung können gleichzeitig erfasst werden. Liposomgröße, Lipid-Diffusität und Fusion Poreneigenschaften gemessen werden.

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Quantifizierung von kleinen RNAs mit hohem Dichtheits-Lipoprotein.

Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

Lipidtröpfchen sind wichtige Organellen für die Replikation von mehreren Erregern, einschließlich der Hepatitis C-Virus (HCV). Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Lipidtröpfchen-Massenspektrometrie assoziierter Proteine ​​zu isolieren; es kann unter einer Vielzahl von Bedingungen, wie zum Beispiel Virusinfektion, Umweltstress, oder medikamentöse Behandlung verwendet werden.

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Es wird ein schnelles und effizientes Protokoll für die Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen vorgestellt, die mit verschiedenen photosynthetischen Organismen assoziiert sind. Die erfolgreiche Herstellung isolierter Plastoglobuli ist ein entscheidender erster Schritt, der detaillierten molekularen Untersuchungen wie proteomischen und lipidomischen Analysen vorausgeht.

Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen aus pflanzlichem Blattgewebe und Cyanobakterien

Wir stellen ein Protokoll zur Rekonstitution von Membranproteinen und zur Verkapselung von Enzymen und anderen wasserlöslichen Komponenten in Lipidvesikeln von Submikrometer- und Mikrometergröße vor.

Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln

Lipophagie ist eine selektive Form der Autophagie, bei der Lipidtröpfchen abgebaut werden. Funktionsstörungen in diesem Prozess werden mit der Entstehung von Krebs in Verbindung gebracht. Die genauen Mechanismen sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Dieses Protokoll beschreibt quantitative Bildgebungsansätze, um das Zusammenspiel zwischen Autophagie, Fettstoffwechsel und Krebsprogression besser zu verstehen.

Erforschung der Regulation des Lipidtröpfchen-Katabolismus durch Lipophagie

Erfahren Sie eine modifizierte Methode zur Lipid-Droplet-Isolation aus Mäuselebern mittels kommerziellen ER-Isolierungskits. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Aufreinigung mehrerer Organellen und erleichtert die Erforschung von Lipidstoffwechsel und Lebererkrankungen.

Rasche Lipid Droplet Isolation Protokoll verwendet eine gut etablierte Organell-Isolierungskit

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