Name: Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen Fraktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Reinigung dendritischer Filopodien-reicher Fraktionen aus hippocampalen Neuronen mittels TLCN-Vitronectin-Affinität. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von Proteinen unreifer Synapsen für die Neurobiologie.

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Wir danken Shigeo Okabe und Hitomi Matsuno für die Low-Density-Kultur der Hippocampus-Neuronen, Masayoshi Mishina für TLCN-mäuse, Sachiko Mitsui und Momoko Shiozaki für technische Hilfe und Mitglieder des Yoshihara-Labors für hilfreiche Diskussionen . Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant Nos unterstützt. JP20700307, JP22700354 und JP24500392 und MEXT KAKENHI Grant Nos. JP23123525 auf YF und JP20022046, JP18H04683 und JP18H05146 zu YY.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee von RIKEN Wako genehmigt.
1. Kultur der Hippocampus-Neuronen
<ol><li>Vorbereitung des Kulturmediums
	<ol>
<li>Zubereitung von 200x Vitaminmischung. Lösen Sie 100 mg D-Pantothensäure-Hemicalciumsalz, 100 mg Cholinchlorid, 100 mg Folsäure, 180 mg I-Inositol, 100 mg Niacinamid, 100 mg Pyridoxal HCl und 100 mg Thiamin HCl in 500 ml Reinstwasser mit einem magnetischen Rührer. Die Lösung ist nicht vollständig aufgelöst. Sorgfältig mischen, in 50 ml-Rohren aliquotieren und bei -20 °C lagern.</li>
		<li>Vorbereitung der Riboflavin-Lösung. 100 mg Riboflavin in 500 ml Reinstwasser mit einem Magnetrührer auflösen. Die Lösung ist nicht vollständig aufgelöst. Sorgfältig mischen, in 50 ml-Rohren aliquotieren und bei -20 °C lagern.</li>
		<li>Zubereitung von 1 M CaCl2. 7,35 g CaCl22H2 O in 50 ml Reinstwasser mit einem Magnetrührer auflösen.</li>
		<li>Vorbereitung des minimalen grundnotwendigen Mediums (MEM). 400 mg KCl, 6800 mg NaCl, 2.200 mg NaHCO3, 158 mg NaH2PO42 H2O, 7000 mg D-Glucose und 200 mg MgSO4-7H2O in 950 ml reinem Wasser mit einem magnetischen Rührer auflösen.</li>
		<li>1,8 ml von 1 M CaCl2 tropfenweise mit einer 1 ml Pipette mit konstanter Rührung an einem Magnetrührer zum MEM titerieren. Stellen Sie den pH-Wert des MEM auf pH 7,25 mit 1 mol/L HCl ein.</li>
		<li>Fügen Sie dem MEM 5 ml 200x Vitaminmischung und 200 l Riboflavin-Lösung hinzu. Stellen Sie das Volumen der Lösung mit Reinstwasser auf 1.000 ml ein. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 m Filtersystem und lagern Sie sie bei 4 °C.</li>
		<li>Vorbereitung von 10x DNase-I Lagerlösungen. 100 mg DNase-I in 12,5 ml von Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) auflösen, durch einen 0,22 m Filter filtern, in 1,5 ml-Rohren aliquoten, und die Rohre bei -20 °C lagern.</li>
		<li>Herstellung der Cytosin-Lagerlösung -D-Arabinofuranosid (Ara-C). 25 mg Ara-C in 8,93 ml Reinstwasser (Endkonzentration von 10 mM) auflösen, durch einen 0,22 m Filter filtern, in 1,5 ml-Rohren aliquotenfrei machen und bei -20 °C lagern</li>
		<li>Vorbereitung des Platting-Mediums. Mischen Sie 1 ml MEM-Aminosäurelösung, 750 l von 1 M HEPES, 1 ml B27, 125 l von 200 ml Glutamin, 250 l Penicillin/Streptomycin, 2,5 ml fetales Rinderserum (FBS) und 44,375 ml MEM in einem 50 ml-Rohr.</li>
		<li>Vorbereitung des Stop-Mediums. Mischen Sie 1 ml MEM-Aminosäurelösung, 750 l 1 M HEPES, 5 ml FBS (endend 10%) und 43,25 ml MEM in einem 50 ml-Rohr.</li>
	</ol></li>
	<li>Zubereitung von poly-L-Lysin-beschichteten Gerichten
	<ol>
<li>35 mm Kunststoffzellkulturschalen mit 0,2 mg/ml Poly-L-Lysinhydrobromid für 1 Tag bei 25 °C anschichten. HINWEIS: Poly-L-Lysin sollte nicht anstelle von Poly-L-Lysin-Hydrobromid verwendet werden.</li>
		<li>Waschen Sie das Geschirr mit 2 ml Reinstwasser 3 mal. Inkubieren Sie die Gerichte mit 1,5 ml Stop Medium bei 25 °C bis zum Gebrauch.</li>
	</ol></li>
	<li>Zerlegung von Hippocampus-Neuronen aus Maus-Embryon
	<ol>
<li>Gewebequelle von Hippocampus-Neuronen. Sezieren Sie den Hippocampus von Wildtyp- und TLCN-defizienten C57BL6/J-Mäusen an den embryonalen Tagen 16-17 nach der Methode von Lu et al.19.</li>
		<li>Inkubieren Sie seziertes Hippocampi in 0,25% Trypsin und 1x DNaseI in HBSS mit 15 mM HEPES, pH 7,2 für 15 min bei 37 °C mit Rührung alle 3 min. Entfernen Sie die Lösung. Inkubieren Sie das Hippocampi in 10 ml STOP-Medium, um Trypsin bei 4 °C für 5 min zu inaktivieren.</li>
		<li>Das Hippocampi in 10 ml frisches STOP-Medium bewegen und bei 4 °C 5 min inkubieren. Das Hippocampi in 10 ml frisches STOP-Medium bewegen und bei 4 °C weitere 5 min inkubieren. mL-Rohr. Dissoziieren Sie die Hippocampi in isolierte Neuronen durch Pipettieren 20 Mal mit einer 1 ml Pipette. HINWEIS: Die Spitze der 1 ml Pipette berührt leicht den Boden des 15 ml Rohres während der Dissoziation des Hippocampi.</li>
		<li>Fügen Sie 9 ml Beschichtungsmedium hinzu und filtern Sie durch ein 70 m Zellsieb in ein 50 ml Rohr. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer und passen Sie sich in einem Beschichtungsmedium auf 3,5 x 104 Zellen/ml an.</li>
		<li>Aspirieren STOP Medium aus Poly-L-Lysin-beschichteten Gerichten. Die Zellen auf poly-L-Lysin-beschichteten Schalen mit 7 x 104 Zellen/Schale (2 ml/Schale) aufteilen.</li>
		<li>Nach 60-64 h Inkubation unter 5% CO2 bei 37 °C 2 L Ara-C-Stammlösung (endgültige 10 M) in die Neuronen geben und die Schale langsam schütteln. Bewahren Sie die Kulturgerichte in einer befeuchteten Box auf, ohne das Kulturmedium bei 37 °C unter 5% CO2 zu senken.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen Fraktion
<ol><li>Nach 13 Tagen in vitro (DIV) fügen Sie magnetische Polystyrol-Mikroperlen (3 x 106 Partikel/Schale) zu 20 Gerichten hinzu, die die kultivierten Neuronen enthalten. Nach 1 Tag, waschen Sie die Neuronen in 1 ml PBS mit Agitation 3 mal, um die mittelgroßen und ungebundenen Mikroperlen zu entfernen. Nach dem Entfernen von PBS lysieren Sie die Neuronen mit 500 L/Schale Lysepuffer (PBS mit 0,01% Triton X-100, EDTA-freier Protease-Hemmer-Cocktail und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail).</li>
	<li>Das Lysat mit einem Zellschaber sammeln und das Lysat in eiweißbindende Mikroröhren (10 Tuben) bewegen. Stellen Sie die Rohre auf einen Magnetabscheider und warten Sie 1 min. Sammeln Sie den Überstand und verwenden Sie ihn als ungebundenen Bruch für Silberfärbung und Western Blot-Analyse.</li>
	<li>Übertragen Sie die Perlen auf ein neues proteinarmes Mikrorohr, das auf einen magnetischen Separator gesetzt ist, und entfernen Sie den Überstand vollständig. Fügen Sie 500 l Lysepuffer hinzu und waschen Sie die Perlen mit einem Wirbelmischer für 15 s. Stellen Sie das Rohr auf einen Magnetabscheider, warten Sie 1 min, entfernen Sie den Überstand, und fügen Sie 500 L Lysepuffer hinzu. Wiederholen Sie das Waschen der Perlen 10 Mal und entfernen Sie den Überstand.</li>
	<li>Elute-Proteine, die durch Zugabe von 50 l 1x SDS-Probenpuffer (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS und 10% Glycerin) an die Perlen gebunden sind, und das Rohr bei 98 °C für 5 min kochen. Zentrieren Sie das Rohr bei 860 x g für 10 s und stellen Sie das Rohr auf auf einem magnetischen Separator für 1 min. Sammeln Sie den Überstand und verwenden Sie ihn als gebundenen Bruch. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
	<li>Messen Sie die Proteinkonzentrationen der ungebundenen und gebundenen Fraktionen durch den BCA-Proteintest. Visualisieren Sie Proteinlösungen mit Bromphenolblau und passen Sie die Konzentration für SDS-PAGE auf 5 ng/L an.</li>
</ol>3. Silberfärbung und Western Blot Analyse
<ol><li>Trennen Sie die gebundenen und ungebundenen Brüche (50 ng) durch SDS-PAGE mit einem 5-20% Gradientengel. Silber-Färbung das Gel.</li>
	<li>Westlicher Blot mit Anti-TLCN-C (1/3.000), Anti-Rinder-vitronectin (1/5.000), Anti-Actin (1/1.000) und Anti-A-Tubulin (1/1.000) als primäre Antikörper und HRP-konjugiertes Ziegenanti-Kaninchen-IgG (1/5.000) als sekundärer Antikörper. Visualisieren Sie die Antigene mit chemiluminescent Western Blotting Detection Reagenz und einem Chemilumineszenz-Imager.</li>
</ol>

<ol><li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions%3A+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li>
<li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li>
<li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li>
<li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+formation+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li>
<li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683(2012).</li>
<li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+proteome%2C+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li>
<li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li>
<li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li>
<li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin+slows+spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li>
<li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li>
<li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li>
<li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin%3A+a+neuronal+area+code+molecule%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Telencephalin: a neuronal area code molecule?</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li>
<li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li>
<li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin%2Fradixin%2Fmoesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li>
<li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li>
<li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li>
<li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27(2018).</li>
<li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density%2C+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li>
<li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li>
<li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Wir entwickelten eine Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion unter Verwendung einer Affinität zwischen dem Zelladhäsionsmolekül TLCN und dem extrazellulären Matrixprotein vitronectin. Im Vergleich zur PSD-Fraktion könnte es möglich sein, die synaptischen Proteine, die auf die unreife Synapse wirken, aus der dendritischen filopodiareichen Fraktion zu identifizieren. So unterscheiden sich die Bestandteile der dendritischen filopodiareichen Fraktion um 74% von denen der PSD-Fraktion. Anders als die ...

Dendritische Filopodia werden als Vorläufer von Stacheln angenommen. Actin Filamente in der dendritischen Filopodia regulieren ihre Ausdehnung und Rückzug1,2,3. Nach Kontakt mit einem Axon beginnen ausgewählte dendritische Filopodien ihre Reifung in Stacheln, und eine Synapse wirdgebildet 4,5. Komponenten der Stacheln wurden aus einer umfassenden Analyse der postsynaptischen Dichtefraktionen6,7bestimmt, während Komponenten der dendritischen Filopodia weitgehend unbekannt bleiben. Es hat sich gezeigt, dass Telencephalin (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 Kinase, Akt, mTOR, Polo-ähnliche Kinase 2, CaMKII, Syndecan-2, Paralemin-1, ARF6 und EphB die dendritische Filopodiabildung regulieren5,8,9 ,10,11, während eine Methode für die umfassende Analyse von Molekülen in der dendritischen Filopodia nicht entwickelt wurde.
TLCN (ICAM-5) wird speziell durch stachelige Neuronen im rostralsten Hirnsegment, dem Telencephalon12,exprimiert. TLCN hat 9 Ig-ähnliche Domänen in seiner extrazellulären Region, eine Transmembranregion und einen zytoplasmatischen Schwanz13. TLCN bindet in seiner extrazellulären Region an Vitronectin (VN) und LFA-1-Integrin, an Presenilin in seiner Transmembranregion und an Phospho-ERM und -Actinin in seiner zytoplasmatischen Region5,8,14,15 ,16. TLCN bindet an das Aktin-Zytoskelett durch Phospho-ERM an den Spitzen der dendritischen Filopodia und des Actinins in Stacheln und dendritischen Wellen8,16.
Wir zeigten, dass die Überexpression der TLCN-verstärkten dendritischen Filopodia-Bildung und die Umkehrung der Wirbelsäule zu Filopodia10induzierte. Die konstitutive aktive Form von Ezrin, die an die tLCN-Zytoplasma-Region gebunden ist, und verbesserte dendritische Filopodia-Bildung8. So reguliert TLCN die dendritische Filopodiabildung durch aktinbindende Proteine. Esselens et al. zeigten, dass Mikroperlen die TLCN-Akkumulation an kultivierten Neuronen17induzierten. Wir zeigten, dass phagozytische Becherstrukturen auf neuronalen Dendriten um VN-beschichtete Mikroperlen in einer TLCN-abhängigen Weise gebildet wurden15. Bestandteile der dendritischen Filopodia ähneln denen der phagozytischen Tasse. Es ist schwierig, dendritische Filopodia zu sammeln, aber es ist relativ einfacher, die phagozytische Tasse mit magnetischen Mikroperlen zu sammeln. So haben wir eine Methode entwickelt, um den phagozytischen Becher anstelle der dendritischen Filopodia18zu reinigen. Hier beschreiben wir die Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mLl Low Binding MCT</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39640T</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>2530149</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Kunststoff-Zellkulturschalen</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Aktin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Alpha-Actinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5044</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Alpha-Tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ezrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Klon 3C12, SAB4200806</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Galphaq</td><td>Santacruz</td><td>sc-393</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2</td><td>Chemicon</td><td>Klon AP20, MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Moesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Klon 38/87, M7060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PLCbeta1</td><td>Santacuz</td><td>sc-5291</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSD95</td><td>MA2</td><td>ABR</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Spectrin beta</td><td>Chemicon</td><td>MAB1622</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol blau</td><td>Merck</td><td>1.08122.0005</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchrolid, wässrig</td><td>Wako</td><td>038-19735</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Cholinchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>Vollständiger EDTA-freier Proteaseinhibitor-Cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Cytosin Beta-D-Arabinofuranosid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-6645</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>D-Pantothensäure Hemicalciumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagenz</td><td>GE</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE Gradientengel</td><td>ATTO</td><td>E-T520L</td><td></td></tr><tr><td>Folsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HRP-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>i-Inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td></td></tr><tr><td>LAS-1000 mini</td><td>Fuji Film</td><td>LAS-1000 mini</td><td>Zum Nachweis von Lumineszenz aus WB-Membran</td></tr><tr><td>Magnetische Polystyrol-Mikrokügelchen</td><td>Sperotech</td><td>PM-20-10</td><td></td></tr><tr><td>MEM-Aminosäurelösung</td><td>Gibco</td><td>11130-051</td><td>30 mM L-Argininhydrochlorid, 5 mM L-Cystin, 10 mM L-Histidinhydrochlorid-H2O, 20 mM L-Isoleucin, 20 mM L-Leucin, 19,8 mM L-Lysinhydrochlorid, 5,1 mM L-Methionin, 10 mM L-Phenylalanin, 20 mM L-Threonin, 2,5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosin und 20 mM L-Valin</td></tr><tr><td>Mini-Elektrophoresesystem</td><td>ATTO</td><td>AE-6530</td><td></td></tr><tr><td>Niacinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin / Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP Phosphatasehemmer Cocktail</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysinhydrobromid</td><td>Nacali</td><td>28360-14</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6155</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9504</td><td></td></tr><tr><td>Silberfleck 2 Kit wako</td><td>Wako</td><td>291-5031</td><td></td></tr><tr><td>Thiamin HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td><td>Bio-rad</td><td>1703940JA</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td>MilliQ</td><td></td><td>Zur Herstellung von Reinstwasser</td></tr></tbody></table>

reinigung der dendritischen filopodia-reichen fraktion

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritische Filopodia sind dünne und lange Vorsprünge, die auf dem Actin-Filament basieren, und sie dehnen sich aus und ziehen sich zurück, als ob sie nach einem Zielaxon suchen. Wenn die dendritischen Filopodia Kontakt mit einem Zielaxon herstellen, beginnen sie, zu Stacheln zu reifen, was zur Bildung einer Synapse führt. Telencephalin (TLCN) ist reichlich in dendritischen Filopodien lokalisiert und wird nach und nach von Stacheln ausgeschlossen. Die Überexpression von TLCN in kultivierten Hippocampus-Neuronen induziert die dendritische Filopodia-Bildung. Wir zeigten, dass Telencephalin stark an ein extrazelluläres Matrixmolekül, vitronectin, bindet. Vitronectin-beschichtete Mikroperlen induzierten phagozytische Tasse Bildung auf neuronalen Dendriten. In der phagozytischen Tasse, TLCN, TLCN-bindende Proteine wie phosphorylierte Sezrin/Radixin/Moesin (Phospho-ERM), und F-Actin sind angesammelt, was darauf hindeutet, dass Komponenten der phagozytischen Tasse denen der dendritischen Filopodia ähneln. So entwickelten wir eine Methode zur Reinigung der phagozytischen Tasse anstelle der dendritischen Filopodia. Magnetische Polystyrolperlen wurden mit Vitronectin beschichtet, das im Kulturmedium der Hippocampus-Neuronen reichlich vorhanden ist und phagozytische Becherbildung bei neuronalen Dendriten induziert. Nach 24 h Inkubation wurden die phagozytischen Becher leicht mit Waschmittel verwoben und mit einem Magnetabscheider gesammelt. Nach dem Waschen der Perlen wurden die Bindungsproteine eluiert und durch Silberfärbung und Western-Blotting analysiert. In der Bindungsfraktion waren TLCN und Actin reichlich vorhanden. Darüber hinaus wurden viele Proteine, die aus der Fraktion identifiziert wurden, auf die dendritische Filopodia lokalisiert; Daher nannten wir die Bindungsfraktion die dendritische filopodiareiche Fraktion. Dieser Artikel beschreibt Details über die Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion.

In kultivierten Hippocampus-Neuronen wurde TLCN reichlich auf die dendritische Filopodia, Welle und Soma lokalisiert und mit F-Actin kolokalisiert (Abbildung 1A, B). Wenn Polystyrol-Mikroperlen kultivierten Hippocampus-Neuronen zugesetzt wurden, wurden die Perlen automatisch mit Vitronectin (VN) beschichtet, das aus fetalem Rinderserum (FBS) im Kulturmedium gewonnen wurde; sie waren hauptsächlich an Dendriten gebunden, und sie induzierten die...

In diesem Protokoll führen wir eine Methode zur Reinigung der dendritischen filopodiareichen Fraktion aus der phagozytischen Cup-ähnlichen Vorsprungstruktur auf kultivierten Hippocampus-Neuronen ein, indem wir die spezifische und starke Affinität zwischen einem dendritischen Filopodialen Adhäsionsmolekül, TLCN, und ein extrazelluläres Matrixmolekül, vitronectin.

Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen Fraktion

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Im Vergleich zur PSD-Fraktion kann es möglich sein, das synaptische Protein zu identifizieren, das auf die unreife Synapse um die dendritische filopodiareiche Fraktion wirkt. Wir verwendeten lebende Neuron, um phagozytische Kappenbildung zu induzieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass aktives Protein in künstlicher Genese aus der dendritischen filopodiareichen Fraktion identifiziert werden konnte.Zu Beginn bereiten Sie 200x Vitamin Mix vor, indem Sie 100 mg Vitamin B5, 100 mg Cholinchlorid, 100 mg Folsäure, 180 mg I-Inositol, 100 mg Vitamin B3, 100 mg Vitamin B6-Hydrochlorid und 100 mg Thiaminhydrochlorid in 500 ml Reinstwasser mit einem magnetischen Rührmittel auflösen. Aliquot in 50 ml Tuben sorgfältig mischen und bei 20 Grad Celsius lagern. Um Riboflavin-Lösung vorzubereiten, lösen Sie 100 mg Riboflavin in 500 mg Reinstwasser mit einem magnetischen Rührer auf.Aliquot in 50 ml Tuben sorgfältig mischen und bei 20 Grad Celsius lagern. Um ein molares Calciumdichlorid zuzubereiten, lösen Sie 7,35 Gramm Calciumchloriddihydrat in 50 ml Reinstwasser mit einem magnetischen Rührer auf. Für die Minimale Essential Medium Zubereitung 400 mg Kaliumchlorid 6, 800 mg Sodumchlorid, 2, 2

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Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen Fraktion

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