Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

Cordblut mononukleäre Zellen, oder CBMC, haben sich als potenzielle Zellquelle für regenerative Medizin, weil menschliche Leukozyten-Antigen-Typisierung ist wesentlich für das Zellbanking-System. CBMC-induzierte pluripotente Stammzellen oder CMBC-iPSCs können in Keratinozyten und Fibroblasten unterschieden werden. Um 3D-Hautorganoid zu erzeugen, verwenden wir dermatologische Forschung.

Beginnen Sie mit der Kultivierung von CBMC-iPSC auf vitronectinbeschichteten 100-Milliliter-Platten bei 37 Grad Celsius und 10% Kohlendioxid. Wenn die Zellen 80% Konfluenz erreicht haben, waschen Sie die Kulturen mit PBS und behandeln Sie sie mit einem Milliliter einMillimolar EDTA pro Platte für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Wenn sich die Zellen gelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit drei Millilitern E8 Medium pro Platte und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Die Pellets in fünf MilliliterE8-Medium zum Zählen wieder aufhängen und ein-mal-10-zu-die-sechste Zellen in ein 15-Milliliter-Konikonrohr zur Zentrifugation übertragen. Setzen Sie die übertragenen Zellen mit 2,5 Milliliterembryonalen Körperbildungsmedium, ergänzt mit 10-Mikromolar-Rho-assoziierten Kinase, oder ROCK-Hemmer. Verwenden Sie eine Pipette, um 125-Mikroliter-Zelltröpfchen auf einen unbeschichteten Kulturplattendeckel zu übertragen.

Wenn alle Tröpfchen platziert sind, drehen Sie die Schale um, damit die Tröpfchen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid vom Deckel hängen können. Am nächsten Tag den Deckel mit frischem E8-Medium waschen und die embryonale Körperlösung in ein 50-Milliliter-Konusrohr übertragen. Lassen Sie die embryonalen Körper für eine Minute bei Raumtemperatur zu begleichen, bevor Sie den Überstand ansischmachen und die embryonalen Körper mit frischem E8-Medium für ihre Kultur in einer 90-Millimeter-Petrischale bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bis zu ihrer Differenzierung wieder aussetzen.

Für CBMC-iPSC Keratinozytendifferenzierung ersetzen Sie das E8-Medium aus der embryonalen Körperkultur durch frisches E8-Medium, ergänzt durch ein Nanogramm pro Milliliter Knochenmorphogenetisches Protein 4 für eine 24-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Am nächsten Tag ernten Sie die embryonalen Körper in einem 50-Milliliter-Konusrohr, wie gezeigt, und lassen Sie die Körper für eine Minute bei Raumtemperatur zu begleichen. Als nächstes ersetzen Sie den Überstand durch sechs Milliliter Keratinozytendifferenzierungsmedium 1 oder KDM1, ergänzt durch 10 mikromolaren ROCK-Hemmer, und übertragen Sie die embryonalen Körper auf eine mit Typ IV kollagenbeschichtete 100-Millimeter-Schale.

Ersetzen Sie an den Tagen null bis acht der Kultur das Medium jeden zweiten Tag durch frisches KDM1, ergänzt durch Dreimikromolare Retinsäure und 25 Nanogramm pro Milliliter knochenmorphogenetisches Protein 4 und epidermalen Wachstumsfaktor. Ersetzen Sie das Medium zwischen den Tagen neun bis zwölf jeden zweiten Tag durch KDM2, ergänzt durch Dreimikromolare Retinsäure, 25 Nanogramm pro Milliliter Knochenmorphogenetisches Protein 4 und 20 Nanogramm pro Milliliter epidermalen Wachstumsfaktors. Zwischen den Tagen 13 bis 30, ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag auf KDM3, ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter Knochen morphogenetischem Protein 4, und 20 Nanogramm pro Milliliter epidermalen Wachstumsfaktor.

Zur CBMC-iPSC-Fibroblastendifferenzierung die embryonale Körperkultur in sechs Milliliter Fibroblasten-Differenzierungsmedium 1, ergänzt durch 10-Mikromolar-ROCK-Inhibitor, wieder aufsetzen und die embryonale Körpersuspension auf eine mit Einer Kellermembran matrixbeschichtete 100-Millimeter-Schale übertragen. Nach drei Tagen Inkubation die Kultur mit 0,5-Nanomolar-Knochenmorphogenetischem Protein 4 vier Tage lang behandeln, bevor das Medium-Fibroblasten-Differenzierungsmedium 2 geändert wird. Wechseln Sie am siebten Tag der Kultur das Medium für eine Woche jeden zweiten Tag auf FDM2.

Am 14. Tag der Kultur, lösen Sie die Zellen mit einem Millimolar EDTA wie gezeigt, und sammeln Sie die Zellen in drei Milliliter Fibroblast Differenzierung Mittel 2 für Zentrifugation. Die Zellen in fünf Milliliter Fibroblasten differenzierungsmittel 1 zum Zählen wieder aufhängen und zweimal-10-zu-die-sechste Zellen auf eine unbeschichtete Schale übertragen. Übertragen Sie am 21. Tag der Kultur zweimal-10-zu-die-sechste Zellen von der Kultur auf eine 100-Millimeter-Schale vom Typ I, die mit Kollagen beschichtet ist, in frischem Fibroblasten-Differenzierungsmedium 1.

Übertragen Sie am 28. Tag der Kultur zweimal 10 bis sechs der iPSC-abgeleiteten Fibroblasten auf eine neue, nicht beschichtete Schale. Für die dreidimensionale Hautorganoid-Generierung, ernten Sie die iPSC-abgeleiteten Fibroblasten aus der Kultur, und übertragen Sie zwei-mal-10-zu-die-fünfte Zellen auf eine 15-Milliliter-Konikonröhre für zentrifugation. Das Fibroblastenpellet in 1,5 Milliliter Fibroblastendifferenzierungsmedium 1 und 1,5 Milliliter neutralisierter Typ-I-Kollagenlösung wieder aufhängen.

Inkubieren Sie die Zellen auf einem Einsatz in einer Sechs-Well-Mikroplatte für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Wenn die Lösung verfestigt ist, fügen Sie zwei Milliliter Medium an der Oberseite des Einsatzes und drei Milliliter an der Unterseite des Brunnens hinzu. Legen Sie dann die Fibroblastenmatrix für fünf bis sieben Tage in den Inkubator, bis die Gelation abgeschlossen ist und die Matrix nicht mehr zusammenzieht.

Am Ende der Inkubation die iPSC-abgeleiteten Keratinozyten ernten und ein-mal-10-zu-die-sechste-Zellen in ein 15-Milliliter-Konizerfürpfchen für die Zentrifugation übertragen. Setzen Sie das Pellet in 50 bis 100 Mikroliter n.F. niedrigem Calciumepithelmedium 1 wieder auf und ersetzen Sie das Medium über die Fibroblastenmatrix durch die Keratinozytenzelllösung. Nach 15 Minuten bei 37 Grad Celsius das Medium an der Oberseite des Einsatzes durch zwei Milliliter Epithelmedium 1 und das Medium im unteren Brunnen mit drei Millilitern desselben ersetzen und die Platte an den Inkubator zurückgeben.

Nach zwei Tagen das Medium im Einsatz und den Brunnen durch das normale Calciumepithelmedium 2 für zwei weitere Kulturtage ersetzen. Entfernen Sie am vierten Tag der Kultur das gesamte Medium und fügen Sie drei Milliliter Verhornungsmedium nur zum Boden hinzu, um eine luft-flüssige Schnittstelle zu erzeugen. Dann geben Sie die Platte für bis zu 14 Tage an den Inkubator zurück, bevor Sie das 3D-Hautorganoid für die nachgelagerte Analyse ernten.

CBMC-iPSC-abgeleitete Keratinozyten haben eine Morphologie ähnlich wie primäre Keratinozyten, und die Expression von Keratinozytenmarkern wird in diesen Zellen erhöht. CBMC-iPSC-abgeleitete Fibroblasten haben eine Morphologie, die primären Fibroblasten ähnelt, und die Expression des pluripotenten Stammzellmarkers Oct-4 ist down-reguliert, während Fibroblastenmarker hochreguliert sind. Die Dicke des 3D-Hautorganoids nimmt während der 3D-Kultur zu, was bestätigt, dass das 3D-Hautorganoid aus iPSC-abgeleiteten Keratinozyten und Fibroblasten erzeugt wird.

Nach zwei Wochen wird ein transplantiertes 3D-Hautorganoidtransplantat effizient in eine Empfängermaushaut integriert, wie die HNE-Analyse bestätigt. Darüber hinaus werden Keratinozytenreifung und epidermale Differenzierungsmarker in den CBMC-iPSC-abgeleiteten 3D-Hautorganoiden exprimiert, was eine funktionelle Differenzierung, effiziente Transplantation und effektive Heilung der Hautdefekte der Maus demonstriert. Wir verwenden in der Vergangenheit mit dem hohen Kalziummedium, das geschichtete Schichten von 3D-Hautorganoid induziert, um in der Nähe der Haut zu imitieren.

Analyse zeigt, dass die Haut geschichtet ist. CBMC-iPSCs sind eine potenzielle Zellquelle für Hauttransplantate, und CBMC-iPSC-abgeleitete 3D-Hautorganoide können in Studien im Zusammenhang mit Dermatologie, kosmetischem Screening und regenerativer Medizin verwendet werden.