Name: Dissektion der Drosophila Pupal Netzhaut Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Isolation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Lernen Sie die Präparation der Drosophila-Puppennetzhaut für Immunhistochemie, Western Blot und RNA-Isolation. Diese effiziente Methode ermöglicht die schnelle Präparation mehrerer Augen ohne Gewebeschädigung.

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Wir danken Zack Trommel und unsere Rezensenten für hilfreiche Kommentare auf das Manuskript. Diese Arbeit wurde durch R15GM114729 unterstützt.

(1) Gewebe-Vorbereitung
<ol><li>Einrichten von Drosophila kreuzt (wie zuvor beschrieben20) oder Kultur spezifische Drosophila Stämme um Puppen des gewünschten Genotyps zu erhalten. Um sicherzustellen, dass eine große Anzahl von Puppen zusammentreffend entstehen, schaffen diese Fliege Kulturen in zweifacher Ausfertigung auf nährstoffreiche Lebensmittel oder standard-Food Medien großzügig mit Hefe-Paste ergänzt.</li>
	<li>Pflegen von Drosophila Kulturen bei 25 ° C. Für Kreuze unter Verwendung der UAS-GAL4-System ist GMR-GAL4 eine ideale Treiber ausgedrückt in Larven Auge Bandscheibenzellen posterior der morphogenetischen Furche und während pupal Entwicklung21,22,23, 24. das Kreuz UAS-LacZ X GMR-GAL4 dient als ideale Kontrolle zu überqueren, wie es die Expression des Proteins nicht endogene und inerte β-Galaktosidase fährt.</li>
	<li>Verwendung der Spitze eine 6" Bambus-Schiene, die mit destilliertem Wasser zu heben weiß Pre-Puppen (Abbildung 1 b) von der Seite des gesunden Kultur Fläschchen (Abbildung 1A) und legen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch (Abbildung 1) nass wurde.</li>
	<li>Legen Sie die Rohre in einer Kunststoff-Pipette-Tipp-Box zusammen mit ein kleines Stück Gewebe, getränkt in destilliertem Wasser weiterhin die Kammer bei ausreichender Luftfeuchtigkeit um die Puppen vor Austrocknung (Abbildung 1) zu schützen. Inkubieren Sie die Puppen bei 25 ° C bis zu sezieren.</li>
	<li>Verwenden Sie eine trockene 6" Bambus-Schiene, um sanft die Puppen aus den Microcentrifuge Schlauch und auf einem schwarzen sezieren Gericht heraus zu drücken. Legen Sie ein frisches Stück doppelseitigem Klebeband auf der sezierenden Schale weg von den Puppen.</li>
	<li>Legen Sie die Puppen dorsalen Seite nach oben (d. h. Operculums nach oben, Abbildung 1 b) mit einer Zange, vorsichtig auf das Band (Abbildung 2A). Sicherzustellen Sie, dass die Puppen auch das Band einhalten. Hinweis: Feuchtigkeit auf der pupal Fall wird sichere Haftung in diesem Fall auf das Band zu hemmen, die Puppen vor dem Inverkehrbringen auf das doppelseitige Klebeband an der Luft trocknen lassen.</li>
</ol>2. Präparation des Auge-Gehirn-komplexe
<ol><li>Verwenden Sie Zange um die Kiemendeckel jede Puppe (Abbildung 2) zu entfernen.</li>
	<li>Verwenden Sie Mikrodissektion Schere zu schneiden oder aufschneiden den pupal Fall jede Puppe. Klappe öffnen den pupal Fall, der Kopf, Thorax und vorderen Abdominalsegment, sichern die Kanten der pupal Fall, doppelseitiges Klebeband (Abbildung 2) zu offenbaren. Hinweis: Es ist nicht notwendig, die Puppen ganz zu offenbaren.</li>
	<li>Stechen Sie den Bauch jede Puppe mit scharfen Zange, das Tier zu erfassen und entfernen Sie sie aus ihrer pupal Fall (Abbildung 2).</li>
	<li>Legen Sie die Puppen auf die schwarzen Dissektion Gericht, Weg von der Band und mit etwa 400 µL eiskalte Phosphat-gepuffert-Lösung (PBS, pH 7.4).</li>
	<li>Jede Puppe durch den Bauch zu erfassen, mit Zange und Schere Mikrodissektion, machen Sie einen sauber quer-Schnitt durch die gesamte Thorax, die Puppe in Hälfte schneiden (Abb. 2D).</li>
	<li>Entfernen der hinteren Überrest jede Karkasse aus der PBS und auf dem sezierenden Teller beiseite stellen (nicht verwerfen, siehe Punkt 3.2.1).</li>
	<li>Öffnen Sie mit zwei Paaren von feinen Pinzette Thorax und Kopf jeder Puppe, die Auge-Gehirn-Komplex (Abb. 2E) zu offenbaren. Um dies zu tun, greifen Sie die Schnitt-Kanten des Thorax Epithel und reißen Sie allmählich zu, um den Brustkorb zu öffnen und dann den Kopf Kapsel, Freilegung der Auge-Gehirn komplexe und umliegende Fettgewebe.</li>
	<li>Ohne das Gewebe zu erfassen, verwenden Sie Zange zu führen den Auge-Gehirn-Komplex entfernt die Überreste der Kopfkapsel oder Schaufel den Auge-Gehirn-Komplex aus der Kopfkapsel zerrissen offen. Hinweis: Der Auge-Gehirn-Komplex ist Hantel-förmige, Wollweiß und lichtdurchlässiger als die umliegenden cremefarbenen Fett (Abb. 2 b, E).</li>
	<li>Entfernen Sie mit der Pinzette vorsichtig die meisten Fett die Auge-Gehirn-komplexe ohne Berührung der Augengewebe zugeordnet.</li>
</ol>3. Bearbeitung von Gewebe für die Immunfluoreszenz
<ol><li>Sezieren Sie mindestens 6-10 Puppen als beschrieben (Schritte 2.1-2,9). Hinweis: Drei bis vier unabhängige Wiederholungen von einzelnen Dissektion tendenziell liefern genügend Daten, um eine Hypothese zu testen.</li>
	<li>
Wasch- und Fixierung
	<ol>
<li>Schneiden Sie Tipp von einem P20 oder P100 Pipettenspitze mit einer sauberen Rasierklinge, erhöhen die Tipp-Eröffnung bis ~ 1 mm im Radius und schmieren von Pipettieren eine Mischung von PBS und Fett oben und unten. Dieses Fett kann die Kadaver Reste entfernt im Schritt 2.6 entnommen werden.</li>
		<li>Übertragen Sie die Auge-Gehirn-komplexe in ~ 400 µL PBS in einer 9-Brunnen Glasschale auf Eis. Mithilfe der geschmierten Spitze und ein P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette übertragen. Hinweis: Auge-Gehirn-komplexe werden beim Pipettieren ungeschmierten Tipps befolgen und beschädigt oder verloren.</li>
		<li>Entfernen Sie das restliche Fett verbunden mit dem Augengewebe durch Pipettieren der PBS rauf und runter, um sanft schwenken, die Auge-Gehirn-komplexe. In diesem und allen weiteren Waschschritten nicht direkt pipette Auge-Gehirn-komplexe rauf und runter da die empfindliche Augengewebe dadurch beschädigt wird.</li>
		<li>Das Auge-Gehirn-komplexe in einem minimalen Volumen zu übertragen (< 20 µL) von PBS in mindestens 250 µL Fixativ. Mischen Sie, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie für 35 min auf Eis. Hinweis: Die gleichen geschmierte Spitze im Schritt 3.1.1 vorbereitet für diesen Transfer einsetzbar.</li>
		<li>Übertragen Sie mit der gleichen Pipettenspitze die Auge-Gehirn-komplexe in einem gut mit ~ 400 µL PBS. Mischen Sie, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren und inkubieren Sie für 5-10 min auf Eis, um zu waschen. Wiederholen Sie waschen mindestens zweimal. Hinweis: Auge-Gehirn-komplexe können für mehrere Stunden in das endgültige PBS waschen, auf Eis oder bei 4 ° C, bevor Sie mit Schritt 3.3.1 gepflegt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antikörper Färbung
	<ol>
<li>Um das Gewebe vor der Belichtung auf Antikörper Lösungen zu blockieren, übertragen Sie die Auge-Gehirn-komplexe auf ~ 400 µL PBT. Verwenden Sie die geschmierten Spitze und ein P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette für die Übertragung. Inkubieren Sie für 10 bis 60 min auf Eis.</li>
		<li>Bereiten Sie die primären Antikörper-Lösung durch Verdünnung entsprechenden Antikörper in PBT. Da Auge-Gehirn-komplexe in 10 µL-Aliquots der Antikörperlösung ausgebrütet werden, wird das Volume erstellt eine Replikation der 10 sein.</li>
		<li>Aliquoten 10 µL Antikörper-Lösung in eine saubere Schale eines 72-Brunnen Microwell-Tabletts (siehe Diskussion).</li>
		<li>Schneiden Sie die Spitze eine P10 Pipettenspitze mit einer sauberen Rasierklinge zu erhöhen die Tipp-Eröffnung bis ~0.5 mm im Radius und schmieren von Pipettieren PBT rauf und runter.</li>
		<li>Transfer von nicht mehr als 5 Auge-Gehirn-komplexe in einem Volumen von < 3 µL PBS, in jeweils 10 µL gut Antikörperlösung mit einem P10 Luft Hubraum Mikropipette und geschmierten Tipp.</li>
		<li>Die Antikörperlösung durch pipettieren die Lösung oben und unten zu homogenisieren. Das Auge-Gehirn-komplexe oben und unten nicht pipette, da sonst das Gewebe beschädigt wird.</li>
		<li>Zur Minimierung von Verdampfung der Antikörper-Lösung legen Sie ein kleines Stück Gewebe, getränkt in destilliertem Wasser in der Microwell-Fach und verschließen Sie das Fach (z. B. mit dem Deckel zur Verfügung gestellt). Über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
		<li>Übertragen Sie die Auge-Gehirn-komplexe aus dem Microwell-Fach in ~ 400 µL PBT in 9 quoll Glasschale zu waschen. Verwenden Sie eine P10 Luft Hubraum Mikropipette und PBT-geschmierten Tipp (bereiten Sie wie in Schritt 3.3.4 beschrieben). Mischen Sie, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie für 5-10 min auf Eis.</li>
		<li>Wiederholen Sie waschen mindestens zweimal. Verwenden Sie ein P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette und PBT-geschmierten Tipp um die Auge-Gehirn-komplexe zwischen Waschlösungen übertragen.</li>
		<li>Bereiten Sie Sekundärantikörper Lösung durch Verdünnung entsprechenden Fluorophor-markierten Sekundärantikörper in PBT nach Bedarf zu. 100 µL der Sekundärantikörper Lösung reicht pro Charge von 6-10 Puppen. Aliquoten Sekundärantikörper Lösung in einer 9 quoll Dissektion Glasschale.</li>
		<li>Übertragen Sie das Auge-Gehirn-komplexe in Sekundärantikörper Lösung. Verwenden Sie ein P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette und PBT-geschmierten Tipp für den Transfer.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Auge-Gehirn-komplexe in Sekundärantikörper Lösung für 1-2 h bei Raumtemperatur oder 3-5 h bei 4 ° c Um zu verhindern, durch das Licht des Fluorophore Bleichen, decken Sie die Vorbereitung mit Folie. Hinweis: Optimale Dauer der Inkubation in Sekundärantikörper Lösung unterscheiden sich nach der primären und sekundären Antikörper verwendet.</li>
		<li>Übertragen Sie die Auge-Gehirn-komplexe in ~ 400 µL PBT in eine Glasschale 9-gut zu waschen. Mischen Sie, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie für 5-10 min auf Eis. Diese Waschschritt sollte mindestens zweimal wiederholt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sekundäre Fixierung
	<ol>
<li>Für eine sekundäre Fixierung die Auge-Gehirn-komplexe auf mindestens 200 µL Fixativ übertragen und 20 min bei Raumtemperatur oder 35 min bei 4 ° c inkubieren Hinweis: Sekundäre Fixierung versteift das Augengewebe, die aids-Montage (Schritt 3.5).</li>
		<li>Verwenden Sie ein P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette und PBT-geschmierten Tipp zum Auge-Gehirn-komplexe in ~ 400 µL PBT in eine Glasschale auf Eis, 9-gut für 5 min waschen übertragen.</li>
		<li>Wiederholen Sie waschen mindestens einmal.</li>
		<li>Verwendung einer P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette und PBT-geschmierten Tipp zur Übertragung der Auge-Gehirn-komplexe in ~ 400 µL PBS in einer Glasschale auf Eis, 9-gut für 1-2 min. Spülen halten das Gewebe in Bewegung durch Pipettieren PBS, aber nicht das Gewebe , oben und unten, Auge-Gehirn-komplexe von Abrechnung und die Einhaltung der Glasschale während PBS-spülen zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage
	<ol>
<li>Übertragen Sie das Auge-Gehirn-komplexe in ~ 200 µL Montage Medien. Verwenden Sie ein P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette und PBT-geschmierten Tipp um die Auge-Gehirn-komplexe übertragen. Lassen Sie das Gewebe zu equilibrate bei der Montage von Medien für 1-2 h.</li>
		<li>Geben Sie einen 5-8 µL Tropfen frisch Montage Medien auf einen sauberen Objektträger.</li>
		<li>Schneiden Sie eine P10-Spitze mit einer sauberen Rasierklinge zu erhöhen die Tipp-Eröffnung bis ~0.5 mm im Radius und nutzen dies und eine P10 Luft Hubraum Mikropipette, um die Auge-Gehirn-komplexe in 5-8 µL der Medien in den Tropfen der Medien auf der Folie Montage Montage zu übertragen.</li>
		<li>Verwenden Sie zwei Wolfram-Nadeln, um die Augen von Sehlappen zu trennen. PIN einen Auge-Gehirn-Komplex zur Folie mit einer robusten Wolfram-Nadel und in Scheiben schneiden jedes Auge Weg von seiner zugehörigen Optik-Lappen mit einer feinen Wolfram-Nadel (Abb. 2F).</li>
		<li>Benutzen Sie die feinen Wolfram-Nadel, um jedes Auge auf die Oberfläche der Objektträger mit der basalen Fläche jedes Auges angrenzend an der Folie zu manövrieren. Sanft über das Gewebe sauber Deckglas senken und sichern mit Nagellack. Hinweis: Die Augen auf der Folie anordnen, so dass sie nebeneinander oder in einer Linie sind erleichtert spätere Mikroskopie.</li>
		<li>Bild der Netzhaut mit Leuchtstofflampen oder konfokalen Mikroskopie. Hinweis: Dias sollte bei 4 ° C gelagert Falls nicht sofort ein Image erstellt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Vorbereitung der Augengewebe für Western Blotting:
<ol><li>Sezieren von 10-16 Puppen (Schritte 2.1-2,9) mit folgenden Änderungen: (a) sammeln und sezieren die Puppen in zwei Durchgängen, 10-15 min auseinander und (b) sezieren in PBS mit Protease und Phosphatase-Inhibitoren (PBS + Pi) ergänzt.</li>
	<li>Das Auge-Gehirn-komplexe mit einer P20 übertragen oder P100 Luft Hubraum Mikropipette und geschmiert Tipp (zubereitet wie in Schritt 3.2.1) in ~ 400 µL PBS + Pi in eine Glasschale von 9-gut, auf Eis, kurz abspülen. Hinweis: Dieser geschmierten Tipp für Folgeschritte 4.3 und 4.4 einsetzbar.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Spülung Schritt zweimal.</li>
	<li>Übertragen Sie alle Auge-Gehirn-komplexe in ~ 400 µL Eis kaltem PBS + Pi auf ein sauberes schwarz sezierenden Gericht dekantiert.</li>
	<li>Entfernen Sie jedes Auge aus der Sehlappen mit einer stabilen Wolfram-Nadel (um das Auge-Gehirn-Komplexes zu stabilisieren) und einer feinen Rasierklinge oder Mikrodissektion Schere sauber schneiden jedes Auge aus der Optik-Lappen. Hinweis: Augen sind in diesem Stadium "klebrig" und können leicht in die sezierenden Schale anhaften. Dies ist vorteilhaft, da es helfen kann, die Entfernung von den Augen aus dem Sehlappen zu erleichtern (siehe Diskussion).</li>
	<li>"Fegen Sie" alle Augen auf einen "Haufen" in der PBS + Pi auf dem sezierenden Gericht mit einer Klinge von einem feinen paar Zangen.</li>
	<li>Schneiden Sie eine P10-Spitze mit einer sauberen Rasierklinge zu erweitern die Tipp-Eröffnung bis ~0.5 mm im Radius und den Tipp-Innenraum durch Pipettieren Western Gewebe Lysis Puffer (WTLB) rauf und runter zu schmieren.</li>
	<li>Übertragen Sie das Auge-Gehirn-komplexe in 5 µL PBS + Pi zu einem 500 µL Microcentrifuge Schlauch. Verwenden Sie diesen geschmierten Tipp und eine P10 Luft Hubraum Mikropipette zum Abschließen der Übertragung.</li>
	<li>Legen Sie den Microcentrifuge Schlauch auf Eis. Volumen Sie 1 (5 µL) WTLB auf die Probe und 10 µL 2 X konzentriertes Protein Probenpuffer (oder 2,5 µL 5 X konzentriertes Protein Probenpuffer). Mischen Sie durch Antippen.</li>
	<li>Wirbel der Microcentrifuge Schlauch kurz und spin-down Probe mit einer Desktop-Mini-Zentrifuge.</li>
	<li>Speichern Sie das Sample bei-20 ° C bis zur Analyse. Verwendung von standard-Protokolle analysieren.</li>
</ol>5. Vorbereitung des Augengewebe für RNA-Extraktion:
<ol><li>Tragen von Handschuhen, saubere Benchtop, Mikroskop, Dissektion Werkzeuge und schwarz sezieren Gericht zuerst mit 70 % Ethanol und dann RNase Dekontamination Reagenz. Trocknen lassen.</li>
	<li>Sezieren von 30-40 Puppen als beschrieben (Schritte 2.1-2,9) mit folgenden Änderungen: ein) zu sammeln und zu zergliedern, 6 bis 8 Puppen in den Reihen, 15-20 min auseinander; (b) sezieren Nuklease-freie PBS und c) jeder Charge der Augen einzeln zu isolieren, sondern sammeln alle Netzhautgewebe in den gleichen Microcentrifuge Schlauch (Schritt 5.5). Hinweis: Nachdem zwei Personen gleichzeitig sezieren wird effiziente Isolierung der gute Augengewebe beschleunigen.</li>
	<li>Für jede Charge isolieren der Auge-Gehirn-komplexe (Schritte 2.1-2,9) und Transfer in ~ 400 µL Nuklease-freie PBS in einer Glasschale 9-Brunnen zu kurz, auf Eis, Spülen mit einem P20 oder P100 Luft Hubraum Mikropipette und geschmierten Tipp (zubereitet wie in Schritt 3.1.2 beschrieben). Hinweis: Dieser geschmierten Tipp für nachfolgende Schritte 5.4 und 5.5 5.8 einsetzbar.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Spülung Schritt zweimal.</li>
	<li>Übertragen Sie die Auge-Gehirn-komplexe zu einem frischen 400 µL Tropfen des eiskalten Nuklease-freie PBS auf eine saubere schwarz sezieren Gericht.</li>
	<li>Entfernen Sie jedes Auge aus der Sehlappen mit einer stabilen Wolfram-Nadel (um das Auge-Gehirn-Komplex zu stabilisieren) und einer feinen Rasierklinge oder Mikrodissektion Schere sauber schneiden jedes Auge aus der Optik-Lappen. Hinweis: Augen sind in diesem Stadium "klebrig" und können leicht in die sezierenden Schale anhaften. Dies ist vorteilhaft, da es helfen kann, die Entfernung von den Augen aus dem Sehlappen zu erleichtern (siehe Diskussion).</li>
	<li>"Fegen Sie" alle Augen auf einen "Haufen" in der Nuklease-freie PBS auf dem sezierenden Gericht mit einer Klinge von einem feinen paar Zangen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Augen zu einem sterilen RNase-freie Microcentrifuge Schlauch und Schockfrosten in flüssigem Stickstoff.</li>
	<li>Dissektion (Schritte 5,3-5,8) von jeder Charge eines Puppen zu wiederholen. Übertragen Sie jede Charge der Augen in der gleichen Microcentrifuge Schlauch, der in flüssigem Stickstoff (Schritt 5.5), alle Augen in einem Gefäß sammeln gewartet wurde.</li>
	<li>Speichern Sie die Proben bei-80 ° C bis RNA-Extraktion.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Methode der Drosophila pupal Auge Dissektion hier beschriebenen ermöglicht für die Isolierung von 6 bis 10-Auge-Gehirn-komplexe innerhalb von 10 bis 15 Minuten. Geduld und Übung sind jedoch notwendig, um die Dissektion Technik beherrschen und Verbesserung der Qualität und Geschwindigkeit der Sektionen. Diesmal kurz Dissektion sorgt dafür, dass jedes Auge ungefähr gleichen Entwicklungsstadium, Reduzierung der Variabilität in der Phänotyp oder gen Ausdruck der Netzhaut in einem Dataset. Während alternative Pro...

Die Drosophila Netzhaut besteht aus ca. 750 Ommatidien umgeben von Pigmentzellen in einer Bienenwabe Gitter1,2,3,4angeordnet. Jedes Ommatidium enthält acht Photorezeptor Neuronen, vier Objektiv-sezernierenden Zapfen und zwei primäre Pigmentzellen. Rund um jedes Ommatidium sind pigmentbildenden Gitter Zellen und sensorischen Borsten Gruppen. Aufgrund seiner Post-mitotische Natur und Stereotype hexagonalen Anordnung bietet die Drosophila pupal Netzhaut eine hervorragendes Modell-System für das Studium der morphogenetischen Prozesse einschließlich Zelle Adhäsion5,6, 7,8,9,10 und Apoptose11,12,13,14,15.
Mehrere veröffentlichte Protokolle nutzen Luftdruck, Auge-Gehirn-komplexe von Drosophila Puppen16,17,18zu extrahieren. Das Protokoll beschrieben hier stattdessen nutzt Mikrodissektion Werkzeuge, um sorgfältig und genau Auge-Gehirn-komplexe mit dem Ziel der Erlangung unbeschädigt Netzhautgewebe zu isolieren. Dies ist entscheidend, wenn die Netzhaut für genutzt werden morphologische, Protein und Genexpression analysiert, da Schäden an der Netzhaut führen kann, in zellulären Stresses oder Tod, der die zellulären Phänotyp oder gen-Ausdruck ändern könnte. Darüber hinaus können nach dem Training, 6 bis 10-Auge-Gehirn-komplexe in 10 bis 15 min, erleichtern das Ziel der Minimierung Variabilität in den Alter und Entwicklungsstadium der seziert Augengewebe isoliert werden.
Die Fixierung, Immunostaining und vollständig-hängen Protokoll beschrieben ist geeignet für die Zubereitung von Drosophila Augen für Fluoreszenz-Mikroskopie. Netzhaut können mit Antikörpern interessierender Proteine gezielt inkubiert werden. Zum Beispiel können Antikörper gegen Adherens Junction Komponenten genutzt werden, um die apikale Umfänge von Zellen zu visualisieren, so dass Eigenschaften einschließlich Zelle Art, Form und Anordnung bewerteten19sein können. Vor der Fixierung können Augen stattdessen aus dem Gehirn zum Zweck der Gewinnung von Protein für die westlichen Analyse oder RNA für den Einsatz in qRT-PCR oder RNA-Sequenzierung abgespalten werden.

<table><tbody><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>Bildbearbeitungssoftware</td></tr><tr><td>Bambusschienen, 6" &nbsp;</td><td>Ted Pella Inc</td><td>116</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Glycerinphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>Schwarze Präparierschale</td><td></td><td></td><td>Petrischale aus Glas, die bis zum Rand mit SYLG170 oder SYLG184 gefüllt ist (schwarz gefärbt mit fein gemahlenem Holzkohlepulver). 24-48 h bei Raumtemperatur polymerisieren lassen.</td></tr><tr><td>Klingenhalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-freier Proteasehemmer Cocktailtabletten</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop (Zeiss LSM 501)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>oder ähnliches Mikroskop</td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonat (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40718</td><td></td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Lebensmittelmedien, nährstoffreich&nbsp;</td><td></td><td></td><td>7,5 % Saccharose, 15 % Glukose, 2,5 % Agar, 20 % Bierhefe, 5 % Pepton, 0,125 % MgSO4.7H2O, 0,125 % CaCl2.2H20</td></tr><tr><td>Drosophila Lebensmittelmedien, Standard</td><td></td><td></td><td>Bloomington Drosophila Stock Center Maismehl Rezept.&nbsp; (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Fixierlösung</td><td></td><td></td><td>4% Formadehyd in PBS, pH 7,4.</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop (TCS SP5 DM Mikroskop)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>oder ähnliches Mikroskop</td></tr><tr><td>Pinzetten&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Pinzetten sollten häufig geschärft werden.</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Glas 9-Well-Schalen&nbsp;</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td>Auch bekannt als 9-Well-Geschirr&nbsp;</td></tr><tr><td>Deckgläser aus Glas (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger aus Glas (25 x 75 x 1 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale aus Glas</td><td>Corning</td><td>3160-100BO</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio Softwareversion 5.2.5</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Bildverarbeitungssoftware zur Quantifizierung von Western Blots.</td></tr><tr><td>Laemmli Probenpuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>2X konzentrierter Protein-Probenpuffer, Ergänzung mit Beta-Mercaptoethanol gemäß Herstellerangaben.</td></tr><tr><td>Spurmarkierung zur Reduzierung des Probenpuffers</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>39000</td><td>5X konzentrierter Proteinprobenpuffer.</td></tr><tr><td>Mikrozentritur-Röhrchen&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodissektionsschere&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiter-Trays (72 x 10 & Mikro; L-Wells)</td><td>Nunc</td><td>438733</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedien</td><td></td><td></td><td>0,5 % N-Propylgallat und 80 % Glycerin in PBS</td></tr><tr><td>N-Propylgallat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies PBS (PBS in 0,1 % DEPC, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>PBS mit einer entsprechenden Menge DEPC zugeben, gut mischen und über Nacht bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren inkubieren. Mindestens 20 Minuten lang autoklavieren. Bei 4° lagern; C</td></tr><tr><td>PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>Herstellen gemäß Herstellerangaben</td></tr><tr><td>PBS+pi (PBS plus Protease- und Phoshatase-Hemmer)</td><td></td><td></td><td>10 mM NaF, 1 mM Beta-Glycerinphosphat und 1 mM Na3VO4 in PBS, pH 7,4. &nbsp;</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>0,15 % TritonX und 0,5 % Rinderserumalbumin in PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Pin-Halter</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Primärer Antikörper: Ziegen-Anti-GAPDH</td><td>Imgenex</td><td>IMG-3073</td><td>Für Western Blotting. Verwendet bei 1:3000</td></tr><tr><td>Primärer Antikörper: Kaninchen anti-gespaltene Dcp-1-Zellsignalisierung</td><td></td><td>9578S</td><td>Für Immunfluoreszenz. Verwendet bei 1:100</td></tr><tr><td>Primärer Antikörper: Ratte anti-DEcad</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>DCAD2</td><td>Für Immunfluoreszenz. Verwendet bei 1:20</td></tr><tr><td>Primärer Antikörper: Ratte anti-DEcad</td><td>DOI: 10.1006/dbio.1994.1287</td><td>DCAD1</td><td>&nbsp; Geschenk von Tadashi Uemura. Verwendet bei 1:100.</td></tr><tr><td>RNA-Extraktionskit: Relia Prep Miniprep-Kit für RNA-Gewebe</td><td>Promega</td><td>Z6110</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-Dekontaminationsreagenz (RNase Away)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklingen</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050</td><td>Brechen Sie ein kleines Stück der Scapel-Klinge ab und befestigen Sie es im Klingenhalter.</td></tr><tr><td>Sekundärer Antikörper: 488-konjugiert&nbsp; Esel Anti-Ratte IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-545-153</td><td>Für Immunfluoreszenz. Verwendet bei 1:200</td></tr><tr><td>Sekundärer Antikörper: cy3-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-165-144</td><td>Für Immunfluoreszenz. Verwendet bei 1:100</td></tr><tr><td>Sekundärer Antikörper: HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Ratten-IgG (H+L)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7077</td><td>Für Western Blotting. Verwendet bei 1:3000</td></tr><tr><td>Sekundärer Antikörper: HRP-konjugiertes Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>305-035-003</td><td>Für Western Blotting. Verwendet bei 1:3000</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215309</td><td></td></tr><tr><td>Natriumvanadat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50860</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer (NanoDrop)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2000c&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Stereo-Präpariermikroskop (M60 oder M80)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>oder ähnliches</td></tr><tr><td>Mikroskop Sylgard (schwarz)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG170</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (transparent)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>Farbe schwarz mit fein gemahlenem Charcol-Pulver</td></tr><tr><td>Taschentuch: Kimwipes</td><td>KIMTECH</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>TritonX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-Hydrochlorid pH7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Wolframnadel, fein</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>Einsatz in Stifthalter</td></tr><tr><td>Wolframnadel, robust</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>Einsatz in Stifthalter</td></tr><tr><td>WTLB (Western Tissue Lysis Buffer)</td><td></td><td></td><td>150 mM NaCl, 1,5 % Triton X-100, 1 mM EDTA, 20 % Glycerin, 10 mM NaF, 1 mM Beta-Glycerinphosphat und 1 mM Na3VO4 in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5). Ergänzen Sie mit einem cOmplete Protease-Cocktailtisch pro 10 ml Lösung.</td></tr><tr><td>Hefepaste</td> <td>(lokaler Supermarkt)</td><td></td><td>Ca. 2 Esslöffel Fleischmann's ActiveDry Hefe (oder ähnliches) aufgelöst in ~20 mL destilliertem H2O</td></tr></tbody></table>

dissektion der drosophila pupal netzhaut immunohistochemistry, westlichen analyse und rna-isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Die Drosophila pupal Netzhaut bietet ein hervorragendes Modellsystem für das Studium der morphogenetischen Prozesse während der Entwicklung. In diesem Beitrag präsentieren wir Ihnen ein zuverlässiges Protokoll für die Zerlegung der zarten Drosophila pupal Netzhaut. Unsere chirurgische Ansatz nutzt verfügbar Mikrodissektion Werkzeuge um Puppen zu öffnen und extrahieren Sie genau Auge-Gehirn-komplexe. Diese feste, Immunohistochemistry und Netzhaut ausgesetzt dann montiert auf Objektträger und abgebildet, wenn das Ziel, zelluläre und subzelluläre Strukturen zu erkennen. Alternativ können Sie fixierten Netzhaut von Gehirngewebe isoliert, in entsprechende Puffer lysiert und für Gel-Elektrophorese oder mRNA Proteingewinnung (, Protein oder gen-Expression, bzw. bewerten) genutzt. Bedeutende Übung und Geduld können erforderlich sein, das beschriebenen Mikrodissektion Protokoll beherrschen, aber einmal gemeistert, das Protokoll ermöglicht relativ schnelle Isolation vor allem unbeschädigt Netzhaut.

Das pupal Auge ist eine leicht zugängliche Gewebe, das das Laufwerk Morphogenese als ein hervorragendes Modell dient, Entwicklungsprozesse zu untersuchen. Hier haben wir die Netzhaut seziert und Immunfluoreszenz zur Erkennung der apikalen Adherens Junctions (Abb. 3A, C) oder die Dcp-1 Caspase (Abbildung 3D), die während der Apoptose (Abbildung 3)25aktiviert wird verwendet. Diese Ansätze lasse...

Dieses Papier stellt eine Operationsmethode für sezieren Drosophila pupal Netzhaut zusammen mit Protokolle für die Verarbeitung von Gewebe für Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Extraktion.

Dissektion der Drosophila Pupal Netzhaut Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Dieses Protokoll ist wichtig, da dies eine effiziente Methode zur Isolierung von Drosophila Pupal Augengewebe für mehrere nachgeschaltete Anwendungen ist. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es die schnelle Zerlegung einer großen Anzahl von Pupalaugen ermöglicht, ohne das Gewebe zu beschädigen. Die Zerlegung der Drosophila Pupal Netzhaut wird für Anfänger eine Herausforderung sein.Das Üben der Technik ist der beste Weg, um die Geschwindigkeit der Sezierungen und die Qualität der Ergebnisse zu verbessern. Nachdem Sie die Drosophila-Pupae auf eine schwarze Sezschale gelegt haben, legen Sie ein frisches Stück doppelseitiges Klebeband auf das Trenngericht, weg von der Pupae, und verwenden Sie ein Paar Zangen, um die dorsale Seite der Welpen vorsichtig auf das Band zu legen. Legen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop und verwenden Sie Zangen, um das Operculum jeder Pupa zu entfernen.Verwenden Sie Mikrodissektionsscheren, um jedes Pupalgehäuse zu schneiden, so dass es geöffnet werden kann, um den Kopf, Thorax und das vordere Bauchsegment zu offenbaren, und die Ränder des Pupalgehäuses auf dem doppelseitigen Band zu sichern. Pierce den Bauch jeder Pupa mit scharfen Zangen, und e

dissection-drosophila-pupal-retina-for-immunohistochemistry-western

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

Der limitierende Faktor in der Verwendung der...

Single Drosophila Ommatidium Dissection und Imaging

Vorbereitung von Adult Drosophila Augen für Thin Schnitte und mikroskopische Untersuchung

Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

Dissektion und Immunhistochemie von Larven, Puppen und Erwachsenenbildung<em&gt; Drosophila</em&gt; Netzhäute

Dieses Video beschreibt, wie man den Auge-Hirn-Komplex aus Drosophila-Puppen präpariert und isoliert. Das vorgestellte Protokoll zeigt, dass das Verfahren qualitativ hochwertiges Gewebe liefert, das beispielsweise mit Immunfärbung und anderen Genexpressionsexperimenten kompatibel ist.

Dissektion des Auge-Hirn-Komplexes aus Fliegenpuppen: Eine Methode zur Isolierung von Netzhautgewebe

Die adulten Strukturen von Drosophila stammen von sackartigen Strukturen ab, die imaginale Scheiben genannt werden. Die Analyse dieser Scheiben bietet Einblicke in viele Entwicklungsprozesse, einschließlich der Gewebebestimmung, der Etablierung von Kompartimentgrenzen, der Zellproliferation, der Spezifikation des Zellschicksals und der planaren Zellpolarität. Dieses Protokoll wird verwendet, um imaginale Scheiben für die Licht-/Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten.

Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus Drosophila melanogaster

Das Ziel dieser Technik ist es, Forschern die Möglichkeit zu geben, Puppenaugenscheiben jeden Alters zu dissektionieren, Immunfärbung  und Montage von Puppenaugenscheiben durchzuführen.

Dissection und Montage<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye Discs

Die Fähigkeit, präzise Abschriften oder Proteine in Drosophila Gewebe erkennen ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Fülle und Lokalisierung, die im Zusammenhang mit den Entwicklungsprozess. Hier ist die Beschreibung eines einfachen Verfahrens pupal Flügel zu sezieren. Diese Flügel können als Muster in verschiedenen Techniken (PCR-Assay, Immunohistochemistry, etc.) verwendet werden.

Eine schnelle und effiziente Methode, um Pupal Flügel von Drosophila geeignet für Immunodetections oder PCR-Assays sezieren

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Bühne und sezieren, olfaktorische Gewebe von Drosophila -Arten zu entwickeln. Das sezierte Gewebe kann später für Molekulare Analysen, wie quantitative RT-PCR (Reverse Transkription-Polymerase Chain Reaction) oder RNA Sequenzierung (RNAseq), sowie in-Vivo -Analysen wie Immunohistochemistry oder in Situ verwendet werden Hybridisierung.

Vorbereitung, Entwicklung von peripheren olfaktorische Gewebe für Molekulare und immunhistochemische Analysen in Drosophila

Lernen Sie die Präparation der Drosophila-Puppennetzhaut für Immunhistochemie, Western Blot und RNA-Isolation. Diese effiziente Methode ermöglicht die schnelle Präparation mehrerer Augen ohne Gewebeschädigung.

Dissektion der Drosophila Pupal Netzhaut Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Isolation

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