Studie über den Stoffwechsel von sechs systemischen Insektiziden in einer neu etablierten Zellsuspensionskultur abgeleitet aus Tee (Camellia Sinensis L.) Blätter

Tee ist eines der beliebtesten Getränke auf der ganzen Welt. Pestizide werden manchmal verwendet, um Teepflanzen vor Schädlingen zu schützen. Einige systemische Pestizide können dafür durch Enzyme in Teebaum gemacht werden.

Und dann durch Oxidation, Hydrolyse oder Reduktionsreaktionen integriert. Pflanzenzellsuspensionskulturen können als eine verwendet werden, leicht, um das Pflanzenstoffwechselverhalten von Pestiziden zu untersuchen. Diese Methode hat mehrere Vorteile.

Erstens kann es unter Bedingungen freier Mikroorganismen betrieben werden, wodurch eine Störung des Pestizidabbaus durch Mikroben vermieden wird. Zweitens kann es uns jederzeit konstantes Material liefern. Schließlich kann es auch leicht verwendet werden, um Theorien des Pestizidverhaltens in einem einzigen Experiment zu vergleichen.

In dieser Studie stellen wir Teezellensuspensionskulturen aus variablen Farben von Teeblättern her. Der optimale Kulturstatus von Zellsuspensionen wurde dann verwendet, um das Ableitungsverhalten von sechs Pestiziden zu vergleichen. Dieses Experiment wird von Jiao Weiting und Ge Guoqin durchgeführt.

Dies ist unsere Tee sterile Pflanzen, die als Quelle der Explantation funktioniert. Schneiden Sie entlang des mittleren Flügels eines sterilen Blattes mit einer Schere. Und dann unterteilen Sie jede Hälfte in kleine Stücke von etwa 0,3 mal 0,3 Zentimetern in einer Petrischale.

Legen Sie die sterilen Explants auf ms visuelles Medium mit 2, 4-D und KT. Sechs Explanten können in einem 300-Milliliter-Kolben platziert werden. Kultur das Blatt explantiert bei einer konstanten Temperatur von 25 Grad Celsius im Dunkeln. Nach 28 Tagen wählen Sie die erste Generation des induzierten Callus und übertragen Sie dann auf frischen Kolben.

Erwerben Sie den lockeren und variablen Callus nach drei bis vier Subkulturen. Schneiden Sie die großen, variablen und lockeren Callusen aus dem festen Medium in kleine Stücke mit einer sterilen chirurgischen Klinge unter sterilen Bedingungen. Wir sind etwa drei Gramm der kleinen Stücke eines Callus.

Legen Sie den Callus in B5 mit 2, 4D und dem KT. Kultur die Flüssigzellsuspension bei konstanter Temperatur im Schüttelinkubator im Dunkeln. Nach sieben bis zehn Tagen Kultivierung, entfernen Sie den Kulturkolben und lassen Sie sie für ein paar Minuten stehen. Nehmen Sie den Überstand als Sediment hier wird die Kultur zu frischem Medium zwingen.

Entfernen Sie die gefällten großen Calluses. Erhalten Sie die letzte gepflegte Zellsuspensionskultur nach vier bis drei Subkulturzyklen von jeweils 28 Tagen. Halten Sie eine Probe von lebenden Zellen bei hundert Grad Celsius für zehn Minuten als Kontrollzelle, bevor Sie die Lebensfähigkeit samtfärbung.

Zentrifuge alle Zellsuspensionskultur für acht Minuten bei 6.000 G.Entfernen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen in 5 Milliliter PBS-Puffer aufhängen und schütteln Sie ihn für eine Minute von Hand. 2,5 Milliliter der TTC-Lösung hinzufügen und wieder von Hand schütteln. Inkubieren Sie die Mischung für eine Stunde in einem stehenden Inkubator bei 13 Grad Celsius.

Fügen Sie ein Aliquot von vierhundert Mikroliter n-Sicht hinzu, um die Stammlösung aller Neonicotinoide Thiamethoxam, Acetimoprid, Imidacloprid und Imideproxase zu sterilisieren. Alles bis zur organischen ersten Phase. Dimethoat und Omethoat in die Zellsuspensionskulturen.

Kulturproben von Zellsuspensionen mit Insektiziden bei konstanter Temperatur und Schütteln der Brutzeit. Nehmen Sie die Proben an verschiedenen Tagen. Um die Probe zu testen, die ein Neonicotinoid enthält, entfernen Sie einen 1 Milliliter Aliquot der homogenen Zellkultur.

Legen Sie es in ein 1,5 Milliliter Kunststoffzentrifugenrohr, und zentrifugieren Sie es bei 4 000 G für zwei Minuten. Übergeben Sie den Überstand vor der Analyse durch HPLC-UV und UPLC QTOF durch eine 0,22 Mikrometer-Filtermembran. Um die Probe zu testen, fahren Sie in der organischen ersten Phase fort.

Entfernen Sie einen 500 Mikroliter Aliquot der Zellkultur und legen Sie es in ein 35-Milliliter-Zentrifugenrohr oder ein 1,5-Milliliter-Kunststoffzentrifugenrohr. Fügen Sie 0,1 Gramm Natriumchlorid und fünf Milliliter Lösungsmittel in das 35 Milliliter Zentrifugenrohr der 500-Mikroliter-Proben. Wirbel die Mischung für eine Minute.

Und dann lassen Sie sie für 10 Minuten ruhen. Nehmen Sie 2,5 Milliliter Überstand in ein 10 Milliliter Glasrohr und verdampfen Sie mit einem Stickstoffverdampfer bei 14 Grad Celsius bis zur Trockenheit. Lösen Sie den Rückstand mit einem Milliliter Aceton auf.

Vortex für eine Minute, passieren Sie es durch eine 0,22 Mikrometer Filtermembran vor der Analyse durch GC-FPD. Legen Sie fünf Pflanzen in vier Liter Plastiktöpfe für fünfzehn Tage. Fügen Sie null Mikrogramm pro Milliliter bzw. 100 Mikrogramm pro Milliliter Thiamethoxam bzw. Dimethoaxe in Plastiktöpfe ein.

Bereiten Sie die intakte Pflanzenprobe nach der vorherigen Methode vor, mit Ausnahme der Voreinweichung und anschließender Analyse durch Orbitrap-Massenspektrometrie. Verwenden Sie ein HPLCUV, um den Inhalt und die Stoffwechselprodukte von Thiamethoxam und Acetimoprid bei Wellenlängen von 254 Nanometern sowie von Imidacloprid und Imideproxase bei 270 Nanometern zu detektieren. Erkennen Sie den Inhalt von Dimethoat und Omethoat durch GC-FPD mithilfe einer röhrenförmigen Säule.

Nachweis der Metaboliten von Insektiziden in der Zellkultur mit der UPRC QTOF mit einer Carbon-18-Säule. Detektieren Sie die Metaboliten von Insektiziden im Testpflanzenextrakt mit der UPLC Orbitrap Massenspektrometrie. Der Callus einer sterilen Pflanze hat eine geringere KontaminationBräunung, aber höhere Induktivität als die von Callus aus gepflückten Teeblättern.

Der von sterilen Blättern abgeleitete Kalus war immer hellgelb, während der von gepflückten Blättern abgeleitete Callus weiß mit braunen Flecken war. Wenn die KT-Konzentration 0,1 Milligramm pro Liter betrug, war der Callus gelblich in der Farbe und locker in der Textur. Die Wachstumsrate des Callus war die höchste, bis zu 61,5%, wenn die Konzentration von 2, 4-D war ein Milligramm pro Liter mit der Konzentration von KT war 0,5 Milligramm pro Liter.

Die Wachstumsdaten von callus war die beste und die Wachstumsrate von Callus war die höchste erreicht 46.9%Daher war die beste Kombination von Pflanze Homent war ein Milligramm pro Liter von 2, 4-D und 0,1 Milligramm pro Liter KT für den Tee Callus Wachstum. Der Kalus bedeckte die Blätter vollständig durch die vierte Subkultur, und wenn der Subkulturzyklus 28 Tage betrug. Der Callus war kräftig mit gelblicher Farbe und lockerer Textur und ohne Bräunung gewachsen.

Nach dem Vergleich der Bruttodaten von Callus und der Farbe der Zellsuspension eignete sich das flüssige Medium B5 besser für die Zellsuspensionskultur. Der OD-Wert der Zellsuspensionskultur wurde verwendet, um die Menge des Zellwachstums darzustellen. Während der 75 Tage des Anbaus hatte das Verhältnis von 15 Gramm pro 40 Milliliter einen od-Wert, der deutlich höher war als der der beiden anderen Verhältnisse.

Die Zelllebensfähigkeit innerhalb der Suspensionskultur der Teezellen wurde durch TTC-Färbung getestet. Die farblose TTC-Verbindung kann durch Dehydrogenase in Mitochondrien lebender Zellen in rotes Formadin umgewandelt werden, aber die Farbe kann in abgestorbenen Zellen nicht verändert werden. Und das ist der ganze Prozess der Etablierung einer Teezellensuspensionskultur.

Dies ist die erste vergleichende Studie über den Stoffwechsel verschiedener Pestizide im Tee mit einer Zellsuspensionskulturtechnik. Mehrere Pestizidmetaboliten wurden identifiziert, und einige von ihnen wurden in gehaltenen Teepflanzen weiter untersucht. Diese neue Methode könnte als Modell für Pestizid-Stoffwechselstudien in Tee oder anderen Pflanzen dienen.