Name: Reinigung und Transplantation von myogen Progenitor Cell abgeleitet Exosomen zur Verbesserung der Herzfunktion bei Duchenne muskulöse dystrophischen Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Erfahren Sie die Reinigung und Transplantation von Exosomen myogener Vorläuferzellen zur Verbesserung der Herzfunktion bei Mäusen mit Duchenne-Muskeldystrophie. Diese Methode demonstriert echokardiographische Überwachung.

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Tang waren teilweise unterstützt von der American Heart Association: NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, NIH-HL134354.

Tiere wurden entsprechend zugelassene Protokolle und Tierschutzvorschriften der institutionellen Animal Care and Use Committee des Medical College of Georgia Augusta Universität behandelt.
1. Isolierung und Reinigung der MPC-abgeleitete Exosomen
<ol><li>Samen 5 x 106 C2C12 Zellen in der Kulturschale 15 cm Zelle mit 20 mL komplette Dulbecco geändert Adlers Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 U/mL Penicillin G und 100 μg/mL Streptomycin. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
	<li>18 h bei 4 ° C mit einem schwingenden Eimer Rotor bereiten Sie Exosom erschöpft Medium durch Ultrazentrifugation der FBS bei 100.000 X g vor . Entsorgen Sie das Pellet.</li>
	<li>Ersetzen Sie die komplette DMEM mit Exosom erschöpft Medium, wenn Monolage Zellen 80 % Zusammenfluss in der Kulturschale zu erreichen.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Transferpipette, um den Überstand von der Zelle Kulturschale alle 48 h für insgesamt drei Mal zu sammeln. Sammeln des Überstands in 50 mL Zentrifuge Tuben und Zentrifuge bei 150 X g für 10 min in die restlichen Zellen zu entfernen.</li>
	<li>Filtern des Überstands durch einen 0,22-μm-Filter Zelle Trümmer zu beseitigen. Ultrazentrifugen der gefilterten Medium in ultra-klare Röhrchen mit der schwingenden Eimer-Rotor bei 100.000 X g 120 min bei 4 ° C, Exosomen auszufällen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Exosom-haltigen Pellet in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und füllen Sie das gesamte ultra-klare Rohr mit PBS. Führen Sie Ultrazentrifugation dieser Suspension bei 100.000 X g für 120 min bei 4 ° C, kontaminierende Proteine zu beseitigen.</li>
	<li>Den Überstand verwerfen und das Exosom Pellet in 100 µL PBS Aufschwemmen. Bei-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.</li>
	<li>3 µL Exosomal Suspension Platz für Elektronenmikroskopie Analyse auf einem 200 Mesh Formvar beschichteten Kupfer Elektronenmikroskop Raster für 5 min bei Raumtemperatur. Fahren Sie mit standard Uranyl Acetat Färbung23. Untersuchen Sie die halbtrockene Raster, indem Transmissions-Elektronenmikroskopie.</li>
</ol>2. Intramyocardial Exosom Lieferung
Hinweis: Wir haben sechs Mäuse in jeder Gruppe.
<ol><li>Betäuben Sie DBA/2J-DMDMDX -Mäuse (männlich, > 10 Monate Alter, Körpergewicht (BW) > 18 g) mit intraperitoneal (i.p.) Injektion von 100 mg/kg BW von Ketamin in Kombination mit 10 mg/kg BW Xylazin zu, und bestätigen Sie die Tiefe der Narkose durch Zeh kneifen.</li>
	<li>Jede Maus in Rückenlage auf einer chirurgische Plattform zu beheben, mit Klebeband sichern jede Extremität und legen Sie eine 3: 0-Naht horizontal unterhalb der oberen Zähne Oberkiefer in Position gehalten.</li>
	<li>Wenden Sie die Enthaarungscreme auf der linken Seite der Maus Brust, das Fell von der Haut zu entfernen.</li>
	<li>Endotracheale Intubation über Mundhöhle mit einem 24 G Katheter durchführen, und lüften Sie die Maus mit Raumluft mit einer Rate von 195 Atemzüge/min mit einem Nagetier Ventilator (siehe die Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Haut mit 75 % Alkohol und 10 % Povidon-Jod.</li>
	<li>Machen Sie einen 10\u201215 mm schrägen Schnitt vom linken sternale Rand um die linke Achselhöhle, schneiden Sie großen Pectoralis und Pectoralis minor mit einer Schere, dann eine linke Thorakotomie durch den vierten Intercostalneuralgie Raum. Fügen Sie sanft die Aufrollvorrichtung Bands um die Brusthöhle auf eine breite von 10 mm zu verbreiten. Achten Sie darauf, um die linke Lunge Schaden zu vermeiden.</li>
	<li>Verwenden Sie zwei gerade Pinzette entfernen das Perikard, auseinander ziehen und legen Sie sie hinter die Aufrollvorrichtung Tipps, um das Herz aussetzen. MPC-Exo zu injizieren (50 μg in 30 µL PBS) oder 30 μl PBS (als Kontrolle) Intramyocardially in der vorderen Wand des linken Ventrikels mit einer 31 G-Insulin-Nadel an einem Standort.</li>
	<li>Verwenden Sie 6-0-Nylon-Fäden um die Brusthöhle, Pectoralis Muskeln und Haut in Reihenfolge zu schließen.</li>
	<li>Mäuse zu erholen. Nachdem rhythmische, spontane Atmung vorhanden ist, entfernen Sie die Mäuse aus den Ventilator und Extubate. Beobachten Sie und notieren Sie die Mäuse Zustand nach der Operation.</li>
</ol>(3) Echokardiographie
Hinweis: Ein einzelner Beobachter zu den Versuchsgruppen geblendet führt Echokardiographie und Datenanalyse.
<ol><li>Betäuben Sie zwei Tage nach der Transplantation PBS/Exosom, die Mäuse mit 1\u20122% Isoflurane.</li>
	<li>Fixieren Sie eine Maus in Rückenlage mit Klebeband, und tragen Sie das vorgewärmte akustische Gel auf den linken Brustbereich.</li>
	<li>
Bewerten Sie linken ventricular Funktion durch Echokardiographie, wie zuvor beschrieben16,24.
	<ol>
<li>Die Parasternal lange Achse Übersicht über dem linken Ventrikel (LV) in zwei Dimensionen (B-Modus), und dann die Ultraschallsonde 90° drehen, um eine LV kurze Achse papillären Muskel Ebene zu erhalten.</li>
		<li>M-Modus echokardiographischen Bilder und links ventrikulären End-diastolischen Durchmesser messen (LVEDD), linken ventricular Ende systolischen Volumen (LVESD) linken ventricular End-diastolischen Volumen (LVEDV) und linken ventricular Ende systolischen Volumen (LVESV). Hinweis: Gebrochene Verkürzung (FS %) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] X 100 und linken linksventrikulären Auswurffraktion (LVEF %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] X 100.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Immunhistochemie
<ol><li>Zwei Tage nach der Transplantation PBS/Exosom, betäuben Sie Mäuse (siehe Punkt 2.1) zu und geschnitten Sie das Brustbein auf, der Brusthöhle verfügbar zu machen. Sezieren Sie der minderwertigen Vena Cava, und Durchspülen Sie das Herz durch den linken Ventrikel Apex mit 3 mL PBS, gefolgt von 3 mL 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur mit einem Schmetterling-Katheter mit einem 25 G Nadel eine 5 mL Spritze.</li>
	<li>Feste Herzen in Paraffin einbetten, und 5 μm dicke Abschnitte geschnitten.</li>
	<li>Deparaffinize Folien in Xylol und rehydrieren in Ethanol Lösungen in folgender Reihenfolge: 100 % Xylol (3 min), 100 % Xylol (3 min), 100 % igem Ethanol (1 min), 100 % igem Ethanol (1 min), 95 % igem Ethanol (1 min), 80 % Ethanol (1 min), H2O (1 min).</li>
	<li>Gewebeschnitte mit 4 % Paraformaldehyd für 8 min bei Raumtemperatur zu beheben.</li>
	<li>Folien in Natriumcitrat (0,01 M, pH 6.0) Tauchen und Antigen-Retrieval mit einem Antigen-Retriever durchführen.</li>
	<li>Permeabilize Abschnitte für 1 h bei Raumtemperatur mit 1 % Polyethylenglykol Tert-Octylphenyl Äther mit PBS-Puffer.</li>
	<li>Abschnitte mit 5 % Ziegenserum mit PBS-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur zu blockieren.</li>
	<li>Abschnitte mit verdünnter primären Antikörper (Anti-Dystrophin Antikörper) mit PBS-Puffer (1: 100) über Nacht bei 4 ° C inkubieren, dann 5 min dreimal mit PBS waschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Abschnitte mit verdünnter Sekundärantikörper (Alexa Fluor 488 konjugiert Ziege Anti-Kaninchen IgG) mit PBS-Puffer (1: 400) für 45 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Autofluoreszenz mit einem Autofluoreszenz abschrecken kit (siehe die Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Verwendung Eindeckmittel mit DAPI (siehe die Tabelle der Materialien), die Folien zu montieren.</li>
	<li>Folien unter einem confocal Mikroskop zu beobachten.</li>
</ol>

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</ol>

Alle Autoren erklärt, dass sie keine Interessenkonflikte.

Die Methode der reinen Exosomen zu isolieren ist essentiell für die Funktion der Exosomen zu studieren. Eines der gemeinsamen Techniken für die Exosom Isolierung ist Polyethylen Glykole (PEGs) vermittelte Niederschlag17,18,25. Exosomen können Stifte ausgefällt, und pelleted durch langsame Zentrifugation. PEG-vermittelten Reinigung ist sehr bequem, Low Cost, es braucht keiner vorgerückte Ausrüstung, aber gibt es Bedenken über die...

Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine X-chromosomal rezessiv, progressive neuromuskuläre Erkrankungen verursacht durch eine Mutation in DMD gen und den Verlust der funktionellen Dystrophin-1. Dystrophin drückt sich vor allem im Skelettmuskel und Myokard und weniger drückt sich in endokrinen Drüsen, glatte Muskulatur und Neuronen2,3. DMD ist die häufigste Form der Muskeldystrophie mit einer Inzidenz von 1 pro 3.500 bis 5.000 Neugeborenen jungen weltweit4,5. Menschen entwickeln in der Regel progressive Muskelentspannung Nekrose, Verlust des unabhängigen Gehens von frühen Jugend und Tod in der zweiten bis dritten Jahrzehnte ihres Lebens durch Herzversagen und Atemstillstand6.
Dilatative Kardiomyopathie, Herzrhythmusstörungen und Herzinsuffizienz sind gemeinsame kardiovaskuläre Manifestationen von DMD7,8. Die Krankheit kann nicht geheilt werden, unterstützende Behandlung kann Symptome verbessern oder das Fortschreiten der Herzinsuffizienz zu verzögern, aber es ist sehr schwierig, die Herz-Funktion9,10zu verbessern.
Ähnlich wie bei DMD-Patienten, X-chromosomale Muskeldystrophie (MDX) Mäuse haben einen Mangel an Dystrophin-Protein und vorliegenden Symptome einer Kardiomyopathie11und werden daher häufig in DMD verbundenen Kardiomyopathie Forschung eingesetzt. Um das Dystrophin in den betroffenen Muskeln wiederherzustellen, erweist allogene Stammzell-Therapie sich eine wirksame Behandlung für DMD12,13,14. Exosomen, 30-150 nm Membranvesikel abgesondert von verschiedenen Zelltypen, spielen eine wichtige Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation durch genetische Materialtransport wie Boten-RNA (mRNA) und nicht-kodierende RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Unsere frühere Studien haben gezeigt, dass Exosomen abgeleitet myogen Vorläuferzellen (MPC), wie z. B. C2C12 Zelllinie Dystrophin übertragen können mRNA zu Host Kardiomyozyten nach kardialen Direkteinspritzung22, darauf hinweist, dass die allogene Lieferung von MPC-abgeleitete Exosomen (MPC-Exo) können vorübergehend DMD Genexpression in MDX-Mäuse wiederherstellen. Dieser Artikel konzentriert sich auf MPC-Exo-Reinigung und Transplantation-Techniken.

<table><tbody><tr><td>0,22 μm m Filter</td><td>Fisherbrand</td><td>09-720-004</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Zellkulturschale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>157150</td><td></td></tr><tr><td>24 G Katheter</td><td>TERUMO</td><td>SR-OX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>31 G Insulinnadel</td><td>BD</td><td>328291</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Nahtmaterial</td><td>Pro Advantage by NDC</td><td>P420697</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziegen Anti-Kaninchen IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum Antimykotische Lösung</td><td>Corning&nbsp;</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dystrophin-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>Antigen-Retriever&nbsp;</td><td>Aptum Biologics</td><td>R2100-US</td><td></td></tr><tr><td>Autofluoreszenz-Quenching-Kit</td> für die Antigenwiederherstellung<td>Vector Laboratories</td><td>SP-8400</td><td></td></tr><tr><td>C2C12 Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Unico</td><td>C8606</td><td></td></tr><tr><td>Change-A-Tip High Temp Cauteries</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>HIT</td><td></td></tr><tr><td>Konfokale Mikroskopie</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 780 Aufrecht Konfokale</td><td></td></tr><tr><td>DBA/2J-mdx Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>013141</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Serum&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>191356</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Henry Schein</td><td>056344</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium mit DAPI&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Retraktor-Set</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol-tert-octylphenylether</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Nagetierbeatmungsgerät</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-7066</td><td></td></tr><tr><td>SW-28 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td>Die Vevo 2100 Bildgebungsplattform</td><td>FUJIFILM VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td>Ultraschallsystem&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tubes</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin (XylaMed)</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td><td>1XYL003 8XYL006</td><td></td></tr></tbody></table>

reinigung und transplantation von myogen progenitor cell abgeleitet exosomen zur verbesserung der herzfunktion bei duchenne muskulöse dystrophischen mäusen

Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

Duchene Muskeldystrophie (DMD) ist eine X-chromosomal rezessive genetische Krankheit verursacht durch einen Mangel an funktionalen Dystrophin-Protein. Die Krankheit kann nicht geheilt werden, und wenn die Krankheit fortschreitet, entwickelt der Patient Symptome einer dilatative Kardiomyopathie, Herzrhythmusstörungen und Herzinsuffizienz. Die DMDMDX mutierte Mäuse Dystrophin nicht ausdrücklich und werden häufig als ein Maus-Modell der DMD verwendet. In unserer aktuellen Studie beobachteten wir, dass Intramyocardial Injektion von breite Ausführung (WT)-myogen Progenitor Zellen abgeleitet Exosomen (MPC-Exo) vorübergehend restauriert die Expression von Dystrophin im Myokard von DMDMDX mutierten Mäusen, die verbunden WT-MPC-Exo kann eine vorübergehende Verbesserung der Herzfunktion, die darauf hindeutet, dass eine Option, um die kardiale Symptome von DMD zur Verfügung. Dieser Artikel beschreibt die Technik der MPC-Exo-Reinigung und Transplantation in Herzen von DMDMDX mutierten Mäusen.

Ein Flussdiagramm zur Isolierung und Reinigung von Exosomen aus C2C12 Zellen ist in Abbildung 1Adargestellt. Um das Vorhandensein von Exosomen zu bestätigen, haben wir Transmission Electron Microscopy Analyse durchgeführt. Transmission Electron Microscopy Bild (Abbildung 1B) zeigt die Morphologie der Vesikel hell und Runde Form von Exosomen C2C12 abgeleitet. Western-Blot Analyse bestätigte die Anwesenheit von Exosom Markierungen...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um vorübergehend verbessern Herzfunktion bei Duchenne-Muskeldystrophie Mäusen durch die Transplantation von Exosomen von normalen myogen Vorläuferzellen abgeleitet.

Reinigung und Transplantation von myogen Progenitor Cell abgeleitet Exosomen zur Verbesserung der Herzfunktion bei Duchenne muskulöse dystrophischen Mäusen

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

Dieses Protokoll stellt die Methode zur vorübergehenden Verbesserung der Herzfunktion in Duchennes Muskeldystrophie-Mäusen dar, indem Exon aus normalen myogenen Vorläuferzellen transplantiert wird. Die exosomale Transplantation kann die Herzfunktion bei DMD-Mäusen in Verbindung mit einer erhöhten Expression von Dystrophie in Empfängerherzen verbessern. Geeignete Methode zur Exonisolation, Reinigung und intramyokardialen Transplantation trägt zum Erfolg der Exontransplantation bei, um die Herzfunktion von Mäusen mit Duchennes Muskeldystrophie zu verbessern.Die Von MPC abgeleitete Exosomentherapie könnte die Skelettmuskelfunktion durch exosomenvermittelten normalen Dystrophin mRNA-Transfer verbessern. Dieses Video zeigt die kritischen Techniken für die Exosomenreinigung, die intramyokardiale Exosomenabgabe und die Echokardiographie nach der Transplantation. Die Demonstration der Echokardiographie wird von Yan Shen, Techniker aus unserem Labor, durchgeführt.Um dieses Verfahren zu beginnen, säen Sie fünf Millionen C2C12-Zellen in eine 15-Zentimeter-Kulturschale mit 20 Millilitern vollständiger DMEM mit 10%FBS und Antibiotika. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Als nächstes verwenden Sie einen schwingenden Schaufelrotor, um FBS bei 100, 000 mal G und bei vier Grad Celsius für 18 Stunden zu ultrazentrieren, um exosome-depleted Medium vorzubereiten.Entsorgen Sie das Pellet und sammeln Sie den Überstand. Wenn die Monolayer-Zellen 80% Konfluss in der Kulturschale erreichen, ersetzen Sie das komplette DMEM durch exosomen-erschöpftes Medium. Verwenden Sie eine Transferpipette, um den Überstand alle 48 Stunden aus der Zellkulturschale zu sammeln.Zentrifugieren Sie die Rohre bei 150 mal G für zehn Minuten, um die verbleibenden Zellen zu entfernen. Filtern Sie den Überstand durch einen 0,22-Mikrometer-Filter, um Zellablagerungen zu beseitigen und das gefilterte Medium auf ultraklare Rohre zu übertragen. Als nächstes verwenden Sie einen Schwenkschaufelrotor, um die Rohre bei 100, 00 mal G und bei 4 Grad Celsius für 120 Minuten zu ultrazentrieren, um die Exosomen auszufällen.Setzen Sie das exosomenhaltige Pellet in PBS wieder auf und füllen Sie dann das gesamte ultraklare Rohr mit PBS. Ultrazentrifugieren Sie diese Suspension bei 100, 00 mal G und bei 4 Grad Celsius für 120 Minuten, um kontaminierende Proteine zu beseitigen. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Exosomepellet in 100 Mikroliter PBS wieder aus.Bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung aufbewahren. Fixieren Sie zunächst jede anästhesierte Maus in der Rückenposition auf einer chirurgischen Plattform, indem Sie jede Gliedmaße mit Klebeband sichern. Legen Sie eine 3-0 Naht horizontal unter den oberen Zähnen, um den Oberkiefer an Ort und Stelle zu halten.Als nächstes tragen Sie Enthaarungscreme auf die linke Seite der Brust der Maus auf, um die Tanne von der Haut zu entfernen. Führen Sie mit einem 24 Gauge-Katheter endotracheale Intubation über die Mundhöhle durch. Und verwenden Sie ein Nagetier-Beatmungsgerät, um die Maus mit Raumluft mit einer Rate von 195 Atemzügen pro Minute zu belüften.Desinfizieren Sie die Haut mit 70% Alkohol und 10% Povidon Jod. Dann machen Sie einen 10 bis 15 Millimeter schrägen Schnitt von der linken Heckkante zur linken Achselhöhle. Verwenden Sie eine Schere, um die pectoralis major und pectoralis minor zu schneiden.Und machen Sie eine linke Thoracotamy durch den vierten intercoastal Raum. Legen Sie vorsichtig Retraktorbänder ein, um die Brusthöhle auf eine Breite von 10 Millimetern zu verteilen, wobei darauf geachtet wird, die linke Lunge nicht zu beschädigen. Danach verwenden Sie zwei gerade Pinzette, um das Perikard zu entfernen.Ziehen Sie sie auseinander und legen Sie sie hinter die Retraktor-Tipps, um das Herz zu entblößen. Verwenden Sie eine 31 Gauge Insulinnadel, um entweder MPC-Exo oder PBS intramyokardienweise in die vordere Wand des linken Ventrikels an einer Stelle zu injizieren. Verwenden Sie dann 6-0 Nylon Nähte, um die Brusthöhle, die Pectoralis Muskeln und die Haut, in der Reihenfolge zu schließen.Zwei Tage nach der PBS-Exosomentransplantation die Mäuse wie im Textprotokoll beschrieben anästhesieren. Verwenden Sie Klebeband, um eine Maus in der Supine-Position zu fixieren und vorgeheiztes Akustikgel auf den linken Brustbereich aufzutragen. Verwenden Sie als Nächstes die Echokardiographie, um die linksventrikuläre Funktion zu bewerten.Erhalten Sie die parasternale Langeachsenansicht des linken Ventrikels in zwei Dimensionen und drehen Sie dann die Ultraschallsonde um 90 Grad, um eine linke Ventrikel-Kurzachsenansicht auf papillarer Muskelebene zu erhalten. Danach nehmen Sie M-Mode-Echokardiographische Bilder auf und messen den linksventrikulären enddiastolischen Durchmesser, das linksventrikuläre endsystolische Volumen, das linksventrikuläre enddiastolische Volumen und das linksventrikuläre endsystolische Volumen. Die Herzfrequenz der Mäuse sollte für die Herzmessfunktion mindestens 400 bpm gesteuert werden.Nachdem Exosomen isoliert und aus C2C12-Zellen gereinigt wurden, wird ihre Anwesenheit durch Transmissionselektronenmikroskopie-Analyse bestätigt. Das Transmissionselektronenmikroskopiebild zeigt die Morphologie der hellen und runden förmigen Vesikel von C2C12-abgeleiteten Exosomen. Die Western-Blot-Analyse bestätigt das Vorhandensein von Exosomenmarkern wie CD63 und Tsg101.Nach der intramyokardialen Injektion in die vordere Wand der linken Herzkammer von mdx-Mäusen wird ein transluzenter Ödembereich beobachtet, der darauf hinweist, dass die Injektion in das Myokard erfolgreich ist. Immunfluoreszierende Färbung für Dystrophin wird dann durchgeführt, um festzustellen, ob die kardiale MPC-Exo-Lieferung die Dystrophin-Protein-Expression in mdx-Herzen wiederherstellt. Teilweise Restauration der Dystrophin-Expression wird mit Membranlokalisierung in einigen Kardiomyozyten beobachtet.Die Herzfunktion wird durch Echokardiographie zwei Tage nach der intramyokardialen Geburt gemessen, um festzustellen, ob die Transplation von MPC-Exo die Herzfunktion bei mdx-Mäusen verbessert. Die MPC-Exo-Behandlung wird gesehen, um die Innere Wandbewegung im Vergleich zu PBS zu verbessern, was darauf hindeutet, dass die MPC-Exo-Transplantation die Herzfunktion bei mdx-Mäusen verbessert. Die Verwendung einer 31 Gauge Insulinnadel mit der Spitze bei etwa 20 Grad ist entscheidend für den Erfolg für die Lieferung der meisten Exosomen in das Myokard und maximiert die Exposition der injizierten Exosomen, um Kardiomyozyten zu beherbergen.Im Anschluss an das Verfahren kann die Dystrophinexpression nach der Von MPC abgeleiteten Exosomeninjektion durch immunfluoreszierende Färbung nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass die kardiale, von MPC abgeleitete Exosomenabgabe die Dystrophin-Protein-Expression wiederherstellt. Diese Technik wird den Weg für die Kardiomyopathie-Behandlung mit exosomentragenden therapeutischen Materialien wie DNA, mRNA, lncRNA oder microRNAs ebnen.

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Forschung

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Genetics

Genetik

Induzierte pluripotente Stammzell (iPSC)-abgeleitete myogene Vorläufer sind vielversprechende Kandidaten für Zelltherapiestrategien zur Behandlung von Muskeldystrophien. Dieses Protokoll beschreibt Transplantations- und Funktionsmessungen, die erforderlich sind, um die Engraftmentierung und Differenzierung von iPSC-abgeleiteten Mesoangioblasten (eine Art von Muskelvorläufern) in Mausmodellen der akuten und chronischen Muskelregeneration zu bewerten.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Die Isolierung und Kultur einer reinen Population von ruhenden Satellitenzellen, eine Muskelstammzellpopulation, ist wesentlich für das Verständnis der Muskelstammzelle Biologie und Regeneration sowie Stammzelltransplantation bei Therapien Muskeldystrophie und anderen degenerativen Erkrankungen.

Isolierung, Kultur und Transplantation von Muskel-Satelliten-Zellen

Dieses Protokoll beinhaltet detaillierte Verfahren zur Isolierung von Urinzellen von Muskeldystrophie-Patienten; ihre effiziente und schnelle Reprogrammierung durch Sendai-Virus-Transduktion.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen

Wir präsentieren drei neue und effizientere Protokolle für den menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in Kardiomyozyten, Endothelzellen differenzieren und glatten Muskelzellen und eine Fördermethode, die das Einwachsen von transplantierten Zellen verbessert durch Zellinjektion mit Patch-vermittelten Cytokin-Lieferung zu kombinieren.

Pluripotente Stammzellen Herzzellen für Myocardial Repair Abgeleitet

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Durchführung kardiale gen bearbeiten in Vivo in Mäusen mit rekombinanten Adeno-Associated Virus (rAAV)-Lieferung von CRISPR vermittelt. Dieses Protokoll bietet eine vielversprechende therapeutische Strategie zur Behandlung von Dystrophischen Kardiomyopathie in Duchenne-Muskeldystrophie und kann verwendet werden, um Herz-Kreislauf-spezifische ko in postnatale Mäuse zu erzeugen.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen

Hier stellen wir ein Cas9-basiertes Exon23-Löschprotokoll vor, um die Dystrophinexpression in iPSC von Dmdmdx Maus-abgeleiteten Hautfibroblasten wiederherzustellen und iPSCs direkt in myogene Vorläuferzellen (MPC) mit dem Tet-on MyoD Aktivierungssystem zu differenzieren.

CRISPR/Cas9-Technologie zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression in iPSC-abgeleiteten Muskelprogenitoren

Komplexe menschliche Krankheiten können in traditionellen Labormodellsystemen eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir einen chirurgischen Ansatz zur Modellierung menschlicher Muskelerkrankungen durch die Transplantation menschlicher Skelettmuskelbiopsien in immundefizienten Mäusen.

Durchführung von Human Skeletal Muscle Xenografts bei immundefizienten Mäusen

In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur effizienten Modellierung des Duchenne-Muskeldystrophie-Muskels mit MYOD1-konvertiertenUrin-abgeleiteten Zellen, um die Wiederherstellung von Dystrophin mRNA und Proteinspiegel nach Exon-Skipping zu bewerten.

Exon Springt in direkt umprogrammierten Myotubes aus menschlichen Urin-abgeleiteten Zellen

Dieses Protokoll veranschaulicht 1) die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus dem adulten Musculus gastrocnemius der Maus sowie 2) die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen unter Verwendung einer differentiellen Ultrazentrifugationsmethode in Kombination mit Saccharosedichtegradienten gefolgt von Western-Blot-Analysen.

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten

Dieses Protokoll beschreibt die Umwandlung von Hautfibroblasten in Myoblasten und deren Differenzierung in Myotuben. Die Zelllinien stammen von Patienten mit neuromuskulären Störungen und können zur Untersuchung pathologischer Mechanismen und zur Erprobung therapeutischer Strategien verwendet werden.

Direkte Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in Myoblasten zur Untersuchung von Therapien für neuromuskuläre Störungen

Die ultraschallgesteuerte Zellabgabe um die Stelle des Myokardinfarkts bei Mäusen ist eine sichere, effektive und bequeme Art der Zelltransplantation.

Ultraschallgesteuerte induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten-Implantation bei myokardinfarktierten Mäusen

Erfahren Sie die Reinigung und Transplantation von Exosomen myogener Vorläuferzellen zur Verbesserung der Herzfunktion bei Mäusen mit Duchenne-Muskeldystrophie. Diese Methode demonstriert echokardiographische Überwachung.

Reinigung und Transplantation von myogen Progenitor Cell abgeleitet Exosomen zur Verbesserung der Herzfunktion bei Duchenne muskulöse dystrophischen Mäusen (Video) | JoVE Journal

Reinigung und Transplantation von myogen Progenitor Cell abgeleitet Exosomen zur Verbesserung der Herzfunktion bei Duchenne muskulöse dystrophischen Mäusen

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