Name: Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Lernen Sie die Umwandlung von iPSCs in funktionale Motorneuronen mit PiggyBac-Vektoren. Diese Methode ermöglicht schnelle Zellgenerierung ohne Aufreinigungsschritte für ALS-Forschung und Arzneimittelscreening.

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Die Autoren danken der Imaging Facility at Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, für die Unterstützung und technische Beratung. Wir danken den Mitgliedern des Center for Life Nano Science für die hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Stipendium von AriSLA (Pilotstipendium 2016 "StressFUS") an AR unterstützt.

1. Wartung menschlicher iPSCs
<ol><li>
Zubereitung von matrix-beschichteten Platten
	<ol>
<li>Tauen Sie eine 5 mL Ampull-Ampull-Matrix (siehe Materialtabelle) über Nacht bei 4 ° C auf. Die ursprünglichen Matrixbestände kommen in unterschiedlichen Lagerkonzentrationen und Aliquots werden nach dem auf dem Datenblatt angegebenen Verdünnungsfaktor hergestellt, der für das einzelne Los spezifisch ist. Es ist wichtig, die Ampullen und Rohre eiskalt zu halten, um ein vorzeitiges Gelalten der Matrix zu verhindern. Despense Matrix in Aliquots in vorgekühlten Kryotubes auf Eis. Ungenutzte Aliquots bei-20 ° C einfrieren.</li>
		<li>Legen Sie ein Aliquot auf Eis für etwa 2 h zu tauen.</li>
		<li>Das Aliquot der Matrix mit 20 ml kaltem DMEM/F12 in einem 50 mL konischen Rohr verdünnen.</li>
		<li>Gut verrühren und 1 mL verdünnte Matrix in 35 mm-Geschirr verteilen (Gegenwerte pro Oberfläche anderer Gerichte).</li>
		<li>Halten Sie die Schalen mit verdünnter Matrix für 1 Stunde bei Raumtemperatur, um die Beschichtung zu ermöglichen. NOTE: Geschirr, die mit Parafilm versiegelt sind, kann bei 4 ° C bis zu 2 Wochen gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Bestandslösung (20 mL) und 1x funktionierende Aliquots des sanften Zelldissoziationsreagenzials (Siehe Materialtabelle).<ol>
<li>Pulver auf 10 mg/mL in PBS auflösen (Ca2 +/mg2 + free).</li>
		<li>Filter sterilisieren durch eine 0,22 μm Filtermembran.</li>
		<li>20 Aliquots (je 1 ml) vorbereiten und bei-20 ° C lagern.</li>
		<li>Vor dem Gebrauch einen Aliquotot in PBS (Ca2 +/Mg2 + free) auf 1 mg/mL (1x funktionierende Aliquots) verdünnen. Hinweis: 1x funktionierende Aliquots können bei 4 ° C bis zu 2 Wochen gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Die Weitergabe menschlicher iPSCs.
	<ol>
<li>Vor dem Start: Bei 4 ° C gelagert, werden vorwärme Matrix-beschichtete Platten im Inkubator bei 37 ° C für 20-30 min gelagert. Bei Raumtemperatur ist die Menge des menschlichen iPSC-Mediums (siehe Materialtabelle) vorwarm. Der DMEM/F12 vorwarm.</li>
		<li>Aspirate Kultur Medium.</li>
		<li>IPSCs mit PBS abspülen (Ca2 +/Mg2 + free).</li>
		<li>1x schonende Dissoziationslösung (0,5 ml für eine 35-mm-Schale) hinzufügen. Inkubieren Sie bei 37 ° C, bis sich die Kanten der Kolonien von der Platte lösen, in der Regel 3-5 min.</li>
		<li>Aspirieren Sie die sanfte Dissoziationslösung, wobei man darauf achtet, die iPSC-Kolonien nicht zu trennen.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit DMEM/F12 (2 ml für eine 35-mm-Schale) und Aspirat darauf zu achten, die Zellen nicht zu lösen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.</li>
		<li>Das menschliche iPSC-Medium (1 mL für eine 35 mm Schüssel) hinzufügen.</li>
		<li>Die Kolonien mit einem Zellheber sanft abschalten und auf ein 15 mL Rohr übertragen.</li>
		<li>Mit einem P1000-Pipettor 3-4 mal die Zellklumpen vorsichtig brechen.</li>
		<li>Aspirieren Sie den Supernatant von der matrix-beschichteten Platte (n).</li>
		<li>Saatgut die Zellen im entsprechenden Kulturvolumen des menschlichen iPSC Mediums. Das Split-Verhältnis kann von Linie zu Linie variieren und ist etwa 1:4-1:8. Wechseln Sie das Medium täglich.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Generation von NIL und NIP-iPSC Linien
<ol><li>
Zelltransfektion.
	<ol>
<li>Spülen Sie die Zellen mit PBS (Ca2 +/Mg2 + kostenlos).</li>
		<li>Fügen Sie das Zelldissoziations-Reagenz hinzu (siehe Materialtabelle) (0,35 mL für eine 35-mm-Schale) und inkubieren Sie bei 37 ° C, bis einzelne Zellen getrennt sind (5-10 min). </li>
		<li>Sanft komplette Zelltrennung durch Pipettieren mit einem P1000-Pipettor 3-4 mal.</li>
		<li>Sammeln Sie in einem 15 mL-Rohr und fügen Sie PBS (Ca2 +/Mg2 + frei) zu 10 mL. Zählen Sie die Zellen.</li>
		<li>Pellet 10 6Zellen und Wiedersehen in 100 μl von Buffer R (im Zell-Elektroporation-Kit enthalten, siehe Materialtabelle). </li>
		<li>Plasmid-DNA für die Transfektion hinzufügen: 4,5 μg umsetzbarer Vektor (epB-Bsd-TT-NIL oder epB-Bsd-TT-NIP12) und 0,5 μg des PiggyBac-Transposaals Plasmid 13.</li>
		<li>Transfekt mit dem Zellelektroporationssystem (siehe Materialtabelle) nach Herstellerangaben und wie bereits beschrieben 3 mit folgenden Parametern: 1.200 V Spannung, 30 ms Breite, 1 Puls. Die Zellen des menschlichen iPSC-Mediums werden mit 10 μM Y-27632 (ROCK-Inhibitor, siehe Materialtabelle) in einer 6-mm-matrix-beschichteten Schüssel ergänzt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selektion mit Antibiotika.
	<ol>
<li>Zwei Tage nach dem Transkriptions 5 μg/mL Blasticidin in das Kulturmedium geben.</li>
		<li>Die meisten der nicht transferierten Zellen werden innerhalb von 48 Stunden an Blasticidin-Selektion sterben. Halten Sie die Zellen in Blasticidin für mindestens 7-10 Tage, um die Zellen, die die Transgene nicht in das Genom integriert haben, zu konterkarieren.</li>
		<li>Halten Sie stüftige transflektierte Zellen als gemischte Population, die aus Zellen mit unterschiedlicher Anzahl von Transgenen und verschiedenen Integrationsstätten besteht, oder isolieren Sie einzelne Klone.</li>
		<li>Bereiten Sie ein zusätzliches Gericht vor, um die Transgene auf 1 μg/mL Doxycycline-Induktion durch RT-PCR mit transgenspezifischen Primern für Ngn2 (Forward: TATGCCACCTCACCTCCCCATAG) wirksam auszudrücken; Umgekehrt: GAAGGAGGAGGCGCGCGACT), wie bereitsbeschrieben12.</li>
		<li>In dieser Phase werden die Vorräte der neuartigen NIL-und NIP-iPSC-Leitungen im Gefriermedium für menschliche iPSCs gefrieren (siehe Materialtabelle ).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Motor Neuron Differenzierung
<ol><li>Dissoziieren Sie die Zellen mit Zelldissoziationsreagenz, wie beschrieben (Schritte 2.1.1 .-2.1.3.). Sammeln Sie getrennte Zellen in einem 15 mL Rohr und verdünnen Sie mit 5 Volumina DMEM/F12. Die Zellen pumpen und im menschlichen iPSC-Medium wiederbeleben, das mit 10 μM ROCK-Inhibitor ergänzt wird. Zählen Sie die Zellen und Samen auf matrix-beschichtete Gerichte mit einer Dichte von 62.500Cells/2.</li>
	<li>Am Tag danach ersetzen Sie das Medium durch DMEM/F12, ergänzt durch 1x stabile L-Glutamin-Analogie, 1x nicht-essentielle Aminosäure (NEAA) Zellkultur-Ergänzung und 0,5x Penicillin/Streptomycin, und die 1 μg/mL Doxycycline enthält. Dies gilt als Tag 0 der Differenzierung. Am ersten Tag das Medium und die Doxycycline erfrischen.</li>
	<li>Wechseln Sie am 2. Tag das Medium auf Neurobasal/B27 (Neurobasal Medium ergänzt mit 1x B27, 1x stabiles L-Glutamin-Analogon, 1x NEAA und 0,5x Penicillin/Streptomycin), mit 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 und 1 μg/mL Doxycycline (siehe Materialtabelle) ). Erfrischen Sie das Medium und die Doxycycline täglich bis zum 5. Tag.</li>
	<li>
Tag 5: Zellen trennen sich mit Zelldissoziation Reagenz (Siehe Materialtabelle).<ol>
<li>Spülen Sie die Zellen mit PBS (Ca2 +/Mg2 + kostenlos).</li>
		<li>Die Zelldissoziation Reagenz (0,35 mL für eine 35-mm-Schale) dazugeben und bei 37 ° C inkubieren, bis sich der gesamte Zellmonolayer von der Schale trennt. Beachten Sie, dass einzelne Zellen während der Inkubation nicht getrennt werden.</li>
		<li>1 ml DMEM/F12 hinzufügen und die Zellen in einem 15 mL Rohr sammeln.</li>
		<li>Sanft komplette Zelltrennung durch Pipettieren mit einem P1000-Pipettor 10-15 mal.</li>
		<li>Fügen Sie 4 ml DMEM/F12 hinzu und zählen Sie die Zellen.</li>
		<li>In diesem Stadium können Motorneuronenvorläufer im Zellgefrieren einfrieren (siehe Materialliste), nach Herstellerangaben. </li>
		<li>Pelletieren Sie die Zellen und wiederbeleben in Neuronal Medium (Neurobasal/B27 Medium mit 20 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF und 200 ng/mL L-Ascorbinsäure, siehe Tabelle von Material s) mit 10 μM ROCK-Inhibitor ergänzt.</li>
		<li>Die Zellen auf polyornithine/laminin-oder alternativ auf matrix-beschichteten Stützen bei der Dichte von 100.000 Cells/2. Verwenden Sie für die Immunfärbung die Kunststoffträger mit Polymer-Kokslip (siehe Materialtabelle). </li>
	</ol>
</li>
	<li>An Tag 6 wechseln Sie das Medium mit frischem neuronalen Medium ohne ROCK-Inhibitor. An den nächsten Tagen alle 3 Tage die Hälfte des Mediums erfrischen. Das Kulturmedium muss sehr sorgfältig verändert werden, um eine Ablösung von der Oberfläche zu verhindern.</li>
</ol>4. Immunfluoranalyse
<ol><li>Zellbefestigung. Spülen Sie die Zellen mit PBS (mit Ca2 +/Mg2 +) und inkubieren Sie die Zellen für 15 Minuten in 4% Paraformaldehyd in PBS (mit Ca2 +/Mg2 +) bei Raumtemperatur. CAUTION: Paraformaldehyd ist giftig und steht im Verdacht, Krebs zu verursachen. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen und behandeln Sie unter einer chemischen Rauchhaube.</li>
	<li>Durchlässigkeit mit PBS (mit Ca2 +/Mg2 +), die 0,1% Triton X-100 für 5 min bei Raumtemperatur enthält.</li>
	<li>Inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur in Antikörper-Sperrlösung (ABS: 3% BSA in PBS mit Ca2 +/Mg2 +).</li>
	<li>Inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur mit primären Antikörpern in ABS: Anti-TTUJ1 (1:1000; Kaninchen) und Anti-Oct4 (1:200; Maus) oder Anti-CHAT (Anti-Choline Acetyltransferase; 1:150; Ziege). Siehe Materialtabelle.</li>
	<li>45 Minuten bei Raumtemperatur mit entsprechendem Esel-Sekundie-Antikörper-Paar in ABS inkubieren: Anti-Maus Alexa Fluor 647 (1:250), Anti-Kaninchen Alexa Fluor 594 (1:250) und Anti-Ziege Alexa Fluor 488 (1:250). Siehe Materialtabelle.</li>
	<li>Inkubieren Sie in 0,4 μg/mL DAPI für 5 min bei Raumtemperatur, um Kerne zu kennzeichnen.</li>
	<li>Montieren Sie die Zellen mit Mounting Medium (siehe Materialtabelle) für die Bildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
</ol>5. Funktionelle Charakterisierung über Patch-Klamperaufnahmen
<ol><li>Bereiten Sie die HEPES-ausgleichbare externe Lösung (NES) wie folgt vor: 140 mM NaCl, 2,8 mM KCl,2 mM CaCl 2,2, 2 mM MgCl2,10mM HEPES und 10 mM Glukose. Stellen Sie die Osmolarität zwischen 290-300 m-und. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 mit 1N NaOH ein und speichern Sie die Lösung bei 4 ° C.</li>
	<li>Die interne Lösung vorbereiten: 140 mM K-Gluconat, 2 mM NaCl, 5 mM BAPTA,2 mM MgCl 2,10 mM HEPES, 2 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP. Stellen Sie den pH-Wert mit 1M KOH auf 7,3 ein und überprüfen Sie, ob die Osmolarität auf rund 290 m angesetzt ist. Die Lösung bei-20 ° C in kleinen Aliquots einfrieren.</li>
	<li>Bevor die Experimente durchgeführt werden, die NES-Lösung in einem Wasserbad auf etwa 28-30 ° C vorwärmen.</li>
	<li>Ziehen Sie einige Borosilikat-Mikropipetten (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) mit einem Spitzwiderstand: 5-6 M-und mit der intrazellulären Lösung füllen, bevor sie in den Pipette-Halter eingebaut wird. NOTE: Denken Sie daran, die Silberdrähte der Aufzeichnungselektrode und der Referenzelektrode in Bleichmittel für mindestens 30 Minuten zu chlorid zu chlorid, um eine gleichmäßige Schicht von AgCl auf der Drahtoberfläche zu bilden.</li>
	<li>Die Petrischale in die Aufnahmekammer geben und die Kammer mit der NES-Lösung bei 1-2 mL/min ablegen. Lassen Sie den Fluss durch eine Inline-Heizung bei einer Temperatur von 30 ° C gesetzt, um die Lösung warm zu halten.</li>
	<li>Platzieren Sie die elektrophysiologische Aufnahmekammer unter ein aufrechtes Mikroskop. Mit dem Patch-Klemmverstärker Membranströme aufzeichnen und Daten mit einer entsprechenden Software erfassen.</li>
	<li>Öffnen Sie die Verstärker-Steuerungssoftware und setzen Sie die Signalgewinne auf den Wert 1 und den Bessel-Filter auf 10 kHz. Stellen Sie sicher, dass der Bessel-Filter 2,5-mal niedriger ist als die Abtastfrequenz.</li>
	<li>Stellen Sie die Versuchsprotokolle für Spannungs-und Stromklemmversuche in der Aufnahmesoftware ein.</li>
	<li>In der Protokolleinstellung ticken Sie den episodischen Stimulationsmodus an und setzen die Sampling-Frequenz auf 25 kHz. Dann bewegen Sie sich auf die Wellenform und geben Sie die Spannung oder Stromschritt Amplitude und-länge als folgt.</li>
	<li>Für die spannungsverschlachten Natriumströme verwenden Sie 15 Spannungsschritte (jeweils 50 ms Dauer) von-100 mV bis + 40 mV (10 mV-Zuwachs). Führen Sie das Protokoll aus, nachdem Sie der gepatchten Zelle ein Haltepotenzial von-60 mV durch den Verstärker auferlegt haben. In ähnlicher Weise werden die spannungsgezeichneten Kalienströme durch Spannungsschritte (je 250 ms Dauer) von-30 mV bis + 50 mV (10 mV-Zuwachs) hervorgerufen, die die aufgezeichnete Zelle auf-40 mV halten.</li>
	<li>Für die Untersuchung der Brenneigenschaften von iPSC-abgeleiteten Schädel-und WirbelsäulenmNs, Klemmzellen, im Stromklemmmodus, bei einem Membranpotenzial von-70 mV und Verwendung von 4 Strompulsen (je 1) von zunehmender Amplitude (von + 20 pA bis + 80 pA; 20 pA-Zuwachs).</li>
	<li>Erwerben Sie für jede Zelle spannungsaktivierte Ströme, evozierte Brennaktivität und drei passive Eigenschaften wie Ganzzellen-Kapazität (Cm), Zellmembranwiderstand (Rm) und Resting Membran-Potential (RMP).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren

Dieses Protokoll ermöglicht es, menschliche iPSCs dank der ektopischen Expression von linearpezifischen Transkriptionsfaktoren effizient in Wirbelsäulen-und Schädelmotorneuronen umzuwandeln. Diese Transgene sind durch Doxycyclin induzierbar und dank eines Transpokortvektors auf Sparkug stabil in das Genom integriert. In einer gemischten Population wird ein oder mehrere Exemplare des Huckepitschwein-Vektors nach dem Zufallsprinzip in das Genom einzelner Zellen integriert, was das Risiko von Veränderungen der Genomintegrit...

Motor-Neuron (MN) Degeneration spielt eine ursächliche Rolle bei menschlichen Erkrankungen wie der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) und der Wirbelsäulenmuskulären Atrophie (SMA). Die Etablierung geeigneter In-vitro-Zellmodellsysteme, die die Komplexität des menschlichen MN rekapitulieren, ist ein wichtiger Schritt zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze. Ausgeführte pluripotente Stammzellen (iPSCs), die mit bemerkenswerten Plurilinage-Differenzierungseigenschaften ausgestattet sind, stammen inzwischen von einer Reihe von Patienten, die von motorischen Neuronenkrankheiten 1,2betroffen sind. Zusätzliche iPSC-Linien, die pathogene Mutationen im Zusammenhang mit MN-Erkrankungen tragen, wurden durch die Genbearbeitung erzeugt, angefangen von der Kontrolle "gesunder" pluripotenter Stammzellen 3. Diese Linien stellen nützliche Werkzeuge für die Modellierung von In-vitro-Krankheiten und das Arzneimittelscreening dar, vorausgesetzt, dass geeignete Methoden für die iPSC-Figierung in MNs zur Verfügung stehen. Die Begründung für die Entwicklung dieser Methode besteht darin, der an PN-Krankheiten interessierten wissenschaftlichen Gemeinschaft ein schnelles und effizientes Differenzierungsprotokoll zu bieten, das zu reifen funktionellen MNs führt. Der erste Vorteil dieser Methode ist der Zeitrahmen der Ausführung. Ein weiterer relevanter Punkt der Stärke ist die Beseitigung eines Reinigungsschrittes. Schließlich kann das Protokoll verwendet werden, um zwei verschiedene Populationen von motorischen Neuronen zu erzeugen.
Die Möglichkeit, verschiedene Subtypen von MNs zu erzeugen, ist besonders für die Modellierung von MN-Erkrankungen relevant. Nicht alle MN-Subtypen sind in ALS und SMA gleich anfällig und das Auftreten von Symptomen in verschiedenen Motoreinheiten beeinflusst die Prognose stark. Bei ALS führt der Wirbelsäuleneintritt mit Symptomen, die in der oberen und unteren Gliedmaßen beginnen, in etwa 3-5 Jahren 4 zum Tod. Umgekehrt hat der Bulbar-Auftakt, beginnend mit der Degeneration der Schädelmähne, eine schlechteste Prognose. Darüber hinaus ist der Anteil des Bulbar-Ansatzes bei Patienten mit Mutationen in den RNA-bindenden Proteinen FUS und TDP-43 signifikanthöherals bei Personen mit SOD1-Mutationen 5. Fast die Gesamtheit alternativer MN-Differenzierungsprotokolle beruht auf der Aktivität der Retinosäure (RA), die der Differenzierung von iPSCs6,7,8einenWirbelsäulencharakter verleiht. Dies schränkt die Möglichkeit ein, intrinsische Faktorenzuuntersuchen, die in bestimmten PN-Subtypen 9,10Schutz bieten könnten.
Im Einklang mit einer früheren Arbeit in der Maus embryonalen Stammzellen11, Wir haben vor kurzem gezeigt, dass in menschlichen iPSCs ectopischen Ausdruck von Ngn2, Isl1 und Lhx3 (NIL) induziert eine Wirbelsäulen-MN-Identität, während Ngn2 und Isl1 plus Phox2a (NIP) angeben,kranial MNs 12. Deshalb haben wir ein effizientes Protokoll entwickelt, das zur Produktion von menschlichen MNs führt, die in einem 12-tägigen Turnaround mit funktionalen Eigenschaften ausgestattet sind. Ziel dieser Methode ist es, in kurzer Zeit und ohne Reinigungsbedarf (z.B. durch FACS) Zellpopulationen zu erhalten, die für MNs mit Wirbelsäulen-oder Schädelidentität hoch angereichert sind.

<table><tbody><tr><td>5-Bapta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926-1G</td><td>Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML&nbsp;</td><td>Reagenz zur Zelldissoziation</td></tr><tr><td>Anti-CHAT</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>AB144P</td><td>Anti-Cholin-Acetyltransferase. Primärer Antikörper, der in Immunfärbeassays verwendet wird. RRID: AB_2079751; Chargennummer: 2971003</td></tr><tr><td>Anti-Ziegen-Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A11055</td><td>Sekundärantikörper zur Verwendung für Immonofluoreszenz-Assays. RRID: AB_2534102; Chargennummer: 1915848</td></tr><tr><td>Anti-Maus Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31571</td><td>Sekundärantikörper zur Verwendung von Immonofluoreszenz-Assays. RRID: AB_162542; Losnummer: 1757130</td></tr><tr><td>anti-Oct4&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>611202</td><td>Primärer Antikörper, der in Immunfärbeassays verwendet wird. RRID: AB_398736; Chargennummer: 5233722</td></tr><tr><td>Anti-Phox2b</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-376997</td><td>Primärer Antikörper, der in Immunfärbeassays verwendet wird. Chargennummer: E0117</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>Immunologische Wissenschaften</td><td>IS-20152-1</td><td>Sekundärantikörper für Immonofluoreszenz-Assays</td></tr><tr><td>anti-TUJ1&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T2200</td><td>Primärer Antikörper, der in Immunfärbeassays verwendet wird. RRID: AB_262133</td></tr><tr><td>B27</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-566</td><td>Serumfreies Nahrungsergänzungsmittel für die Erhaltung neuronaler Zellen</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Nippon Genetics</td><td>NGE-BB02</td><td>Zellgefriermedium, hier für Motoneuronen-Vorläuferzellen</td></tr><tr><td>verwendet BDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-02</td><td>Brain-Derived Neurotrophic</td></tr><tr><td>Factor Blasticidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203350</td><td>Nukleosid-Antibiotikum, das die Proteinsynthese in Prokaryoten und Eukaryoten hemmt</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>Rinderserumalbumin. Blockierungsmittel zur Verhinderung der unspezifischen Bindung von Antikörpern in Immunfärbeassays</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen</td></tr><tr><td>Clampex 10 Software</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 10</td><td>Membranstromaufzeichnungssystem</td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC-qualifizierte Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Rekonstituiertes Basalmembranpräparat aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maussarkom. Wird zur Adhäsion von iPS-Zellen auf Kunststoff- und Glasträgern verwendet</td></tr><tr><td>CRYOSTEM ACF GEFRIERMEDIEN</td><td>Biological Industries</td><td>05-710-1E</td><td>Gefriermedium für humane iPSCs</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5146</td><td>Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen</td></tr><tr><td>DAPI-Pulver Roche</td><td></td><td>10236276001</td><td>4&prime;,6-diamidino-2-phenylindol. Fluoreszierender Farbstoff, der an Adenin bindet&ndash; thyminreiche Regionen in der DNA, die für die Zellkernfärbung in Immonofluoreszenz-Assays verwendet werden</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>AdipoGen</td><td>AG-CR1-0016-M005</td><td>Gamma-Sekretase-Inhibitor</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>Reagenz für die schonende Dissoziation humaner iPSCs</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421-500ML</td><td>Basalmedium für Zellkultur</td></tr><tr><td>Doxycyclin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G& nbsp;</td><td>Wird verwendet, um die Expression von Transgenen aus epB-BSD-TT-NIL- und epB-BSD-TT-NIP-Vektoren zu induzieren</td></tr><tr><td>DS2U&nbsp;</td><td>WiCell</td><td>UWWC1-DS2U</td><td>Kommerzielles humanes iPSC-Linie</td></tr><tr><td>E.Z.N.A Gesamt-RNA-Kit&nbsp;</td><td>Omega bio-tek</td><td>R6834-02</td><td>Kit für die vollständige Extraktion von RNA aus kultivierten eukaryotischen Zellen</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-10</td><td>Glial-Derived Neurotrophic Factor</td></tr><tr><td>Gibco Episomale hiPSC-Linie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A18945</td><td>Kommerzielle humane iPSC-Linie</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>Eine Alternative zu L-Glutamin mit erhöhter Stabilität. Verbessert die Zellgesundheit.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen</td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix für RT-qPCR&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td>Kit für die Genexpressionsanalyse mittels real-time qPCR</td></tr><tr><td>iTaqTM Universal SYBR Green Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&nbsp;</td><td>Gebrauchsfertiger Reaktions-Mastermix, optimiert für die farbstoffbasierte quantitative PCR (qPCR) auf jedem real-time PCR-Gerät</td></tr><tr><td>K-Gluconat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td>Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen</td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>LKT Laboratories</td><td>A7210</td><td>Wird in Zellkulturen als Antioxidans verwendet</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11243217001</td><td>Fördert die Anheftung und das Wachstum von Nervenzellen in vitro</td></tr><tr><td>Konfokales Laserscanning-Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>&nbsp; iX83 FluoView1200</td><td>Konfokalmikroskop für die Aufnahme von Immunfärbebildern</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>Chemikalien für elektrophysiologische</td></tr><tr><td>Lösungen MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen</td></tr><tr><td>Einbettmedium&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>50001</td><td>Einbettlösung für konfokale Mikroskopie und Immunfluoreszenz-Assays</td></tr><tr><td>Multiclamp-Patch-Clamp-Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td>700B</td><td>Membranstrom-Aufzeichnungssystem</td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td>Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>nicht-essentielle Aminosäuren. Wird als Ergänzung für Zellkulturmedium verwendet, um das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit zu erhöhen.</td></tr><tr><td>Neon 100 &mu; L Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td>Cell Elektroporationskit</td></tr><tr><td>Neon Transfection System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Cell Elektroporationssystem</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Basalmedium für die langfristige Erhaltung und Reifung neuronaler Zellpopulationen ohne die Notwendigkeit einer Astrozyten-Feeder-Schicht</td></tr><tr><td>NutriStem-XF/FF&nbsp;</td><td>Biologische Industrie</td><td>05-100-1A</td><td>Humanes iPSC-Kulturmedium</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Wissenschaften 157-8</td><td>Wird für die Zellfixierung in Immunfärbeassays</td></tr><tr><td>verwendet PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td>Dulbecco's Phosphatpuffer Kochsalzlösung, mit Calcium, mit Magnesium</td></tr><tr><td>PBS Ca2+/Mg2+ frei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>Dulbecco's Phosphatpuffer Kochsalzlösung, ohne Calcium, ohne</td></tr><tr><td>Magnesium Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>Penicillin/Streptomicin-Lösung zur Verhinderung einer Zellkulturkontamination durch Bakterien.</td></tr><tr><td>Poly-Ornithin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>Fördert die Anheftung und das Wachstum von Nervenzellen in vitro</td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0443-5MG</td><td>Selektiver Inhibitor des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2 (VEGFR-2)</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylenglykol,&nbsp; t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglykol&nbsp; tert-Octylphenylether. Wird für die Zellpermeabilisierung in Immunfärbeassays verwendet</td></tr><tr><td>Aufrechtes Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51VI</td><td>Mikroskop für elektrophysiologische Aufzeichnungen, ausgestattet mit CoolSnap Myo Kamera&nbsp;</td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp; (ROCK-Hemmer)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-270-333-M005&nbsp;</td><td>Zellpermeabler selektiver Inhibitor der Rho-assoziierten, Coiled-Coil enthaltenden Proteinkinase (ROCK). Erhöht das iPSC-Überleben</td></tr><tr><td>&mu;-Folie 8 Well&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Unterstützung für high&ndash; Endmikroskopische Analyse von fixierten Zellen</td></tr></tbody></table>

umwandlung von vom menschen induktiven pluripotent-stammzellen (ipscs) in funktionale wirbelsäulen-und krankheitsanleitungsneuronen mit piggybac-vektoren

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Wir beschreiben hier eine Methode, um funktionelle Wirbelsäulen-und Schädelmotor-Neuronen aus vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zu erhalten. Die direkte Umwandlung in Motorneuron erfolgt durch die ektopische Expression alternativer Module von Transkriptionsfaktoren, nämlich Ngn2, Isl1 und Lhx3 (NIL) oder Ngn2, Isl1 und Phox2a (NIP). NIL und NIP geben jeweils die Identität des Wirbelsäulen-und Schädelmotors Neuron an. Unser Protokoll beginnt mit der Generierung von modifizierten iPSC-Leitungen, bei denen NIL oder NIP über einen PiggyBac-Transpospo-Vektor stabil in das Genom integriert sind. Die Expression der Transgene wird dann durch Doxycyclin induziert und führt in 5 Tagen zur Umwandlung von iPSCs in MN-Vorläufer. Die anschließende Reifung führt zu einer homogenen Population von Wirbelsäulen-oder Schädelmlassen. Unsere Methode hat gegenüber früheren Protokollen mehrere Vorteile: Sie ist extrem schnell und vereinfacht; Es erfordert keine Virusinfektion oder eine weitere MN-Isolierung; Es ermöglicht die Erzeugung von verschiedenen MN-Subpopulationen (Wirbelsäule und Schädelung) mit einem bemerkenswerten Reifungsgrad, wie die Fähigkeit zeigt, Züge von Aktionspotenzialen zu befeuern. Darüber hinaus kann eine große Anzahl von motorischen Neuronen ohne Reinigung von gemischten Populationen gewonnen werden. Die iPSC-abgeleiteten Wirbelsäulen-und Schädelmotor-Neuronen können für die In-vitro-Modellierung der amyotrophen Lateralsklerose und anderer neurodegenerativer Erkrankungen des motorischen Neurons eingesetzt werden. Homogene motorische Neuronenpopulationen könnten eine wichtige Ressource für zelltypspezifische Arzneimittel-Screenings darstellen.

Eine schematische Beschreibung der Differenzierungsmethode ist in Abbildung1 dargestellt. Die menschlichen iPSCs (WTIline 3) wurden mit epB-Bsd-TT-NIL oder epB-Bsd-TT-NIP transferiert, wodurch bei der Blasticidin-Auswahl stabile und induzierbare Zelllinien12erzeugt wurden, im Folgenden iPSC-NIL und iPSC-NIP genannt. Für die Expression des Pluripotenzmarkers OCT4 und des panneuronalen Markers TUJ1 wurden unterschiedliche Zellen charakterisiert. ...

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und effiziente Umwandlung von induzierten pluripotenten Stammzellen in motorische Neuronen mit einer Wirbelsäulen-oder Schädelidentität, indem es die Transkriptionsfaktoren von induzierbaren PiggyBac-Vektoren ausführt.

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Die Möglichkeit, verschiedene Subtypen von motorischen Neuronen zu erzeugen, ist besonders relevant für die Modellierung moderner motorischer Neuronenerkrankungen wie der amyotrophen Lateralsklerose. Diese Methode ermöglicht die Erfassung von Zellpopulationen, die für motorische Neuronen mit einer Wirbelsäulen- oder Schädelidentität in kurzer Zeit und ohne Reinigungsschritt hochsteif sind. Die Erzeugung menschlicher motorischer Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen oder iPSC unter vereinfachter Kulturbedingung kann das Arzneimittelscreening auf motorische Neuronenerkrankungen erleichtern.Die induzierbare Expression des Programmiertranskriptionsfaktors kann verwendet werden, um weitere Zelltypen wie Neuronal, Skelettmuskel und Gliazellen aus einem iPSC-Repository zu generieren. Für die Nil- und NIP iPSC-Liniengenerierung spülen Sie die humane iPSC-Kultur mit calcium- und magnesiumfreiem PBS ab, bevor Sie die Zellen fünf bis zehn Minuten bei 37 Grad Celsius mit Zelldissoziationsreagenz behandeln. Wenn sich die Zellen vom Kulturcontainer zu lösen begonnen haben, verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die Zellen drei- bis viermal manuell zu trennen.Übertragen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Rohr und bringen Sie das Endvolumen bis zu 10 Milliliter mit frischem PBS ohne Kalzium und Magnesium zum Zählen. Sammeln Sie ein mal 10 bis die sechsten Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter Puffer R aus dem Elektroporationskit wieder auf. Fügen Sie 4,5 Mikrogramm transponierbare Vektorplasma-DNA und 0,5 Mikrogramm der piggyBac-Transposase-Plasma-DNA für die Transfektion hinzu.Transfekt mit dem Zellelektroporationssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den angegebenen Parametern. Dann säen Sie die Zellen im humanen iPSC-Medium mit 10 mikromolaren ROCK-Hemmer Y-27632 in einer sechs Millimeter Matrix-beschichteten Schale ergänzt. Zwei Tage nach der Transfektion, fügen Sie 5 Mikrogramm pro Milliliter pro Milliliter Blasticidin auf das Kulturmedium halten die Zellen im Antibiotikum für mindestens sieben bis zehn Tage, um die Zellen, die nicht integriert haben die Transgene gegenzuwählen.Am Ende der Inkubation die stabil transfizierten Zellen als gemischte Population, die aus Zellen mit unterschiedlicher Anzahl von Transgenen und verschiedenen Integrationsstellen besteht, zu erhalten oder einzelne Klone zu isolieren. Bereiten Sie eine zusätzliche Schale vor, damit die effektive Expression der Transgene auf ein Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin-Induktion von RT-PCR mit transgenspezifischen Primern für Neurogenin-2, wie zuvor beschrieben, bewertet werden kann. In diesem Stadium sollten die Bestände der neuartigen NIL- und NIP-iPSC-Linien auch im Gefriermedium für humane iPSCs eingefroren werden.Zur motorischen Neurondifferenzierung dissoziieren Sie die stabil transfizierten Zellkulturen mit Dissoziationsreagenz, wie gezeigt, um die Zellen in einem 15-Milliliter-Rohr mit fünf Bänden DMEM/F12-Medium summieren zu können. Nach der Zentrifugation, resuspendieren Sie die Zellen im menschlichen iPSC Medium mit mikromolaren ROCK-Hemmer zum Zählen ergänzt. Säen Sie die Zellen auf Matrix-beschichteten Schalen mit einer 6,25 mal 10 die vierte Zelle pro Zentimeter quadratische Dichte.Für die nächsten zwei Tage die Überräube durch frisches Differenzierungsmedium ersetzen, das durch Doxycyclin ergänzt wird. Am zweiten Tag, ändern Sie das medium zu neurobasalen B27 Medium mit Gamma-Sekretase-Hemmer ergänzt, vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor-Rezeptor-Hemmer, und Doxycylin. Am fünften Tag die Zellen wie gezeigt zu dissoziieren und die abgetrennten Zellen in vier MilliliterDM/F12-Medium zum Zählen wieder aufzusetzen.Pipettieren ist wichtig für eine vollständige Dissoziation der Zellen. Einfrieren eines Aliquotders der motorischen Neuronenvorläufer im Zellgefriermedium gemäß den Anweisungen des Herstellers und sammeln Sie den Rest der Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet im neuronalen Medium mit 10 mikromolaren ROCK-Hemmern auf.Samen die Zellen auf Polyornithin Laminin-beschichteten Mikroslide-Stützen mit Polymerabdeckung rutscht mit einem mal 10 bis die fünfte Zelle pro Zentimeter quadratische Dichte. Ersetzen Sie das Medium am sechsten Tag sorgfältig durch ein frisches neuronales Medium ohne Kulturinhibitor bis zur nachgeschalteten Analyse, ohne die Zellen von der Stützfläche zu lösen. Eine einheitliche Expression des Pluripotenzmarkers Octamer-bindender Transkriptionsfaktor vier oder OTC4 kann bei der Differenzierung von Zellkulturen am Tag Null beobachtet werden, wenn es keine panneuronale Marker-Neuron-spezifische Klasse drei Beta-Tubulin TUJ1-Positivität gibt.Am dritten Tag ist ein starker Rückgang der Anzahl der OCT4-positiven Zellen zu beobachten. Dies spiegelt sich in der Ausprägung von TUJ1 in einer Teilmenge differenzierender iPSCs wider. Am fünften Tag wird in der Population kein Ausdruck von OCT4 beobachtet, der eine konsistente Expression von TUJ1 und eine erworbene neuronale Morphologie zeigt.Immunostaining Analyse sieben Tage nach der Replatierung der motorischen Neuron Vorläuferzellen zeigt eine einheitliche Expression von TUJ1 und der reifen motorischen Neuronmarker Cholin Acetyltransferase. iPSC NIL-abgeleitete Neuronen zeigen erfolgreich spannungsabhängige Natriumströme und spannungsabhängige Kaliumströme an. 80% der iPSC NIL-abgeleiteten Motorneuronen, die in der aktuellen Klemmmodalität eingeklemmt sind, sind in der Lage, Spike-Züge auszulösen, wenn sie mit einem Stromimpuls von plus 60 Picoamps oder mehr injiziert werden.Der Minimale Strom, der erforderlich ist, um in mehr als 50% der aufgezeichneten Zellen ein repetitives Abfeuern auszulösen, beträgt plus 40 Picoamps mit einer Spitzenschwelle von etwa minus 38 Millivolt und einer durchschnittlichen Feuerfrequenz von plus 40 Picoamps von etwa acht Hertz, was darauf hindeutet, dass iPSC NIL-abgeleitete spinale Motorneuronen funktionelle Eigenschaften aufweisen, die typisch für reife Neuronen sind. Spinale und schädelmotorische Neuronen können aus kontrollierten iPSCs oder iPSCs abgeleitet werden, die pathologische Mutationen tragen und dass diese Zellen als Thesenmodelle oder für das Drogenscreening verwendet werden können. Unsere Methode kann verwendet werden, um zu verstehen, warum verschiedene motorische Neuroneneinheiten differential von ALS beeinflusst werden.

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Lernen Sie die Umwandlung von iPSCs in funktionale Motorneuronen mit PiggyBac-Vektoren. Diese Methode ermöglicht schnelle Zellgenerierung ohne Aufreinigungsschritte für ALS-Forschung und Arzneimittelscreening.

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren (Video) | JoVE Journal

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

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