Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

Die Möglichkeit, verschiedene Subtypen von motorischen Neuronen zu erzeugen, ist besonders relevant für die Modellierung moderner motorischer Neuronenerkrankungen wie der amyotrophen Lateralsklerose. Diese Methode ermöglicht die Erfassung von Zellpopulationen, die für motorische Neuronen mit einer Wirbelsäulen- oder Schädelidentität in kurzer Zeit und ohne Reinigungsschritt hochsteif sind. Die Erzeugung menschlicher motorischer Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen oder iPSC unter vereinfachter Kulturbedingung kann das Arzneimittelscreening auf motorische Neuronenerkrankungen erleichtern.

Die induzierbare Expression des Programmiertranskriptionsfaktors kann verwendet werden, um weitere Zelltypen wie Neuronal, Skelettmuskel und Gliazellen aus einem iPSC-Repository zu generieren. Für die Nil- und NIP iPSC-Liniengenerierung spülen Sie die humane iPSC-Kultur mit calcium- und magnesiumfreiem PBS ab, bevor Sie die Zellen fünf bis zehn Minuten bei 37 Grad Celsius mit Zelldissoziationsreagenz behandeln. Wenn sich die Zellen vom Kulturcontainer zu lösen begonnen haben, verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die Zellen drei- bis viermal manuell zu trennen.

Übertragen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Rohr und bringen Sie das Endvolumen bis zu 10 Milliliter mit frischem PBS ohne Kalzium und Magnesium zum Zählen. Sammeln Sie ein mal 10 bis die sechsten Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter Puffer R aus dem Elektroporationskit wieder auf. Fügen Sie 4,5 Mikrogramm transponierbare Vektorplasma-DNA und 0,5 Mikrogramm der piggyBac-Transposase-Plasma-DNA für die Transfektion hinzu.

Transfekt mit dem Zellelektroporationssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den angegebenen Parametern. Dann säen Sie die Zellen im humanen iPSC-Medium mit 10 mikromolaren ROCK-Hemmer Y-27632 in einer sechs Millimeter Matrix-beschichteten Schale ergänzt. Zwei Tage nach der Transfektion, fügen Sie 5 Mikrogramm pro Milliliter pro Milliliter Blasticidin auf das Kulturmedium halten die Zellen im Antibiotikum für mindestens sieben bis zehn Tage, um die Zellen, die nicht integriert haben die Transgene gegenzuwählen.

Am Ende der Inkubation die stabil transfizierten Zellen als gemischte Population, die aus Zellen mit unterschiedlicher Anzahl von Transgenen und verschiedenen Integrationsstellen besteht, zu erhalten oder einzelne Klone zu isolieren. Bereiten Sie eine zusätzliche Schale vor, damit die effektive Expression der Transgene auf ein Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin-Induktion von RT-PCR mit transgenspezifischen Primern für Neurogenin-2, wie zuvor beschrieben, bewertet werden kann. In diesem Stadium sollten die Bestände der neuartigen NIL- und NIP-iPSC-Linien auch im Gefriermedium für humane iPSCs eingefroren werden.

Zur motorischen Neurondifferenzierung dissoziieren Sie die stabil transfizierten Zellkulturen mit Dissoziationsreagenz, wie gezeigt, um die Zellen in einem 15-Milliliter-Rohr mit fünf Bänden DMEM/F12-Medium summieren zu können. Nach der Zentrifugation, resuspendieren Sie die Zellen im menschlichen iPSC Medium mit mikromolaren ROCK-Hemmer zum Zählen ergänzt. Säen Sie die Zellen auf Matrix-beschichteten Schalen mit einer 6,25 mal 10 die vierte Zelle pro Zentimeter quadratische Dichte.

Für die nächsten zwei Tage die Überräube durch frisches Differenzierungsmedium ersetzen, das durch Doxycyclin ergänzt wird. Am zweiten Tag, ändern Sie das medium zu neurobasalen B27 Medium mit Gamma-Sekretase-Hemmer ergänzt, vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor-Rezeptor-Hemmer, und Doxycylin. Am fünften Tag die Zellen wie gezeigt zu dissoziieren und die abgetrennten Zellen in vier MilliliterDM/F12-Medium zum Zählen wieder aufzusetzen.

Pipettieren ist wichtig für eine vollständige Dissoziation der Zellen. Einfrieren eines Aliquotders der motorischen Neuronenvorläufer im Zellgefriermedium gemäß den Anweisungen des Herstellers und sammeln Sie den Rest der Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet im neuronalen Medium mit 10 mikromolaren ROCK-Hemmern auf.

Samen die Zellen auf Polyornithin Laminin-beschichteten Mikroslide-Stützen mit Polymerabdeckung rutscht mit einem mal 10 bis die fünfte Zelle pro Zentimeter quadratische Dichte. Ersetzen Sie das Medium am sechsten Tag sorgfältig durch ein frisches neuronales Medium ohne Kulturinhibitor bis zur nachgeschalteten Analyse, ohne die Zellen von der Stützfläche zu lösen. Eine einheitliche Expression des Pluripotenzmarkers Octamer-bindender Transkriptionsfaktor vier oder OTC4 kann bei der Differenzierung von Zellkulturen am Tag Null beobachtet werden, wenn es keine panneuronale Marker-Neuron-spezifische Klasse drei Beta-Tubulin TUJ1-Positivität gibt.

Am dritten Tag ist ein starker Rückgang der Anzahl der OCT4-positiven Zellen zu beobachten. Dies spiegelt sich in der Ausprägung von TUJ1 in einer Teilmenge differenzierender iPSCs wider. Am fünften Tag wird in der Population kein Ausdruck von OCT4 beobachtet, der eine konsistente Expression von TUJ1 und eine erworbene neuronale Morphologie zeigt.

Immunostaining Analyse sieben Tage nach der Replatierung der motorischen Neuron Vorläuferzellen zeigt eine einheitliche Expression von TUJ1 und der reifen motorischen Neuronmarker Cholin Acetyltransferase. iPSC NIL-abgeleitete Neuronen zeigen erfolgreich spannungsabhängige Natriumströme und spannungsabhängige Kaliumströme an. 80% der iPSC NIL-abgeleiteten Motorneuronen, die in der aktuellen Klemmmodalität eingeklemmt sind, sind in der Lage, Spike-Züge auszulösen, wenn sie mit einem Stromimpuls von plus 60 Picoamps oder mehr injiziert werden.

Der Minimale Strom, der erforderlich ist, um in mehr als 50% der aufgezeichneten Zellen ein repetitives Abfeuern auszulösen, beträgt plus 40 Picoamps mit einer Spitzenschwelle von etwa minus 38 Millivolt und einer durchschnittlichen Feuerfrequenz von plus 40 Picoamps von etwa acht Hertz, was darauf hindeutet, dass iPSC NIL-abgeleitete spinale Motorneuronen funktionelle Eigenschaften aufweisen, die typisch für reife Neuronen sind. Spinale und schädelmotorische Neuronen können aus kontrollierten iPSCs oder iPSCs abgeleitet werden, die pathologische Mutationen tragen und dass diese Zellen als Thesenmodelle oder für das Drogenscreening verwendet werden können. Unsere Methode kann verwendet werden, um zu verstehen, warum verschiedene motorische Neuroneneinheiten differential von ALS beeinflusst werden.