In Vivo Hemmung von MicroRNA zur Verringerung des Tumorwachstums bei Mäusen

Wir führen die erste Therapie durch, basierend auf einem microRNA-Hemmer in einem Schilddrüsenkrebsmodell. Diese sich entwickelnden Therapien versprechen die Behandlung dieser Krankheit. Diese Art von orthotopischem Modell, das einen systemischen Behandlungsweg nutzt, erleichtert die Validierung eines neuen mikroRNA-basierten Arzneimittels.

Obwohl wir ein orthotopisches Modell verwenden, um menschliche Schilddrüsenkrebszellen in Mausschilddrüsen zu implantieren, könnten diese Modelle alle systemisch für andere Krebsarten sein. Mit Julia Ramirez-Moya und Adrian Acuna wird Raquel Arocha Riesco das Prozedere demonstrieren. Sie ist Technikerin unseres Instituts.

Nach der Etablierung einer CAL-62 menschlichen Schilddrüsenkrebs-Zelllinie unvollständiges Medium, suspendieren Sie ein 1 mal 10 bis die 6. Zelle aliquot in 50 Mikroliter PBS bei 4 Grad Celsius, und mischen Sie die Zellen mit einem gleichen Volumen der Kellermembranmatrix. Laden Sie die Zellen in eine 1 Milliliter Spritze, ausgestattet mit einer 27 gage Halb-Zoll-Nadel, und subkutan injizieren 100 Mikroliter der Probe in die linke Flanke einer 6 Wochen alten immundeficient valve C Nacktmaus. Zwei Wochen nach der Injektion die AntagomiR- oder kontrollierte Behandlungspufferlösung zu 160 Mikroliterraumtemperatur in vivo-Abgabereagenz in einem 1 Punkt 5 Milliliter Tube hinzufügen.

Und sofort wirbeln die Lösung für 10 Sekunden, um die Komplexierung der Mischung zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Behandlungslösung 30 Minuten bei 50 Grad Celsius, gefolgt von einer kurzen Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge. Anschließend den Sedimentbehandlungskomplex versechsfacht mit frischem PBS und gründlicher Vermischung.

Und injizieren Sie das gesamte Volumen von 200 Mikrolitern der Behandlung direkt in den Tumor. Injizieren Sie 50 Mikroliter einer 40 Milligramm pro Liter D-Luciferin Substratlösung subkutan 2 mal pro Woche, in jedes Versuchstier. Achten Sie darauf, einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifung nach Isoflurananästhesie zu bestätigen.

Legen Sie das Tier in die Kammer eines In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebungssystems und stellen Sie das Biolumineszenzsignal mit der in vivo Bildgebungssoftware nach Standardprotokollen ab. Analysieren Sie dann das Tumorwachstum. Vergleich beider Behandlungen und Bestimmung der Signifikanz und Wachstumsunterschiede mit einem T-Test.

Für orthotopische Schilddrüsen-Tumorzell-Impfung suspendieren Sie ein Aliquot von CAL-62-Zellen in 5 Mikroliter PBS, und subkutan injizieren 100 Mikroliter analgetisch und 100 Mikroliter Antibiotikum in eine 7 Wochen alte Ventil C Nacktmaus. Nachdem Sie eine fehlende Reaktion auf Zehenkneifen bestätigt haben, legen Sie das Tier unter ein Sezierendes Mikroskop und desinfizieren Sie den Hals des Tieres mit Iodopovidon. Als nächstes machen Sie einen etwa 2 Zentimeter großen Schnitt in der Haut und verdrängen Sie die Speicheldrüsen, um den Hals freizulegen.

Verwenden Sie Sezieren Zangen, und / oder Schere, um die Riemenmuskeln zu sezieren, um die Luftröhre und Schilddrüse zu belichten, und verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Spritze, um das 5-Mikroliter Volumen der Tumorzellen in die rechte Schilddrüsenlobule zu injizieren, die sich an der Seite des Cricoid-Knorpels befindet. Wenn alle Zellen geliefert wurden, positionieren Sie die Speicheldrüsen, und verwenden Sie Seidengeflochtene, beschichtete, nicht resorbierbare Nähte, um den Schnitt zu schließen. Dann iodopovidon auf den Wundbereich auftragen und die Maus auf eine thermische Decke mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung legen.

zwei bis drei Wochen nach der Intrathyroid-Zellinjektion, bereiten Sie die Behandlungslösung wie gezeigt vor und liefern Sie die Lösung intravenös durch retroorbitale Injektion der venösen Sinus des anästhesierten Schilddrüsentumor tragenden Tieres. In diesem repräsentativen Experiment wurde das Wachstum von Tumoren intratumoral ohne microRNA 146B-Inhibitor injiziert, in Bezug auf die Negative Kontrolle signifikant unterdrückt. Intratumorale Expressionsniveaus einiger Proliferationsmarker wurden auch in niedrigen Konzentrationen beobachtet, bei antagomiR behandelten Tumoren, im Vergleich zu kontrollierbaren Tumoren.

Darüber hinaus kann die Wiederherstellung der Mikro-RNA-Ziele durch die Analyse von tumorextrahierter RNA oder Protein untersucht werden. Kollektiv enthüllt, dass die In-vivo-Hemmung einzelner Mikro-RNA wirksam ist und therapeutisch für Schilddrüsenkrebsbehandlungen genutzt werden kann. Histologische Analyse von Schilddrüsentumoren, die bei Mäusen nachgewiesen wurden, ermöglicht die Färbung der Epithelzellen, die den Tumor umgeben, und zeigt die Schilddrüsenfollikelarchitektur des Tumorgewebes.

Insbesondere führt die intravenöse Injektion von microRNA 146B-Hemmern in Mäuse mit einem etablierten Tumor zu einer signifikanten Abnahme des Tumorvolumens im Vergleich zu kontrollbehandelten Tieren. Darüber hinaus erhöht sich die Expression der neu beschriebenen microRNA 146B Ziel DICER1 im Primärtumor, erhöht sich nach der Anti-Micro-RNA 146B-Behandlung, was das Potenzial der Hemmung der indogenösen Mikro-RNA-Expression und damit die Wiederherstellung ihrer Zielgene als Therapie bei Schilddrüsenkrebs weiter unterstreicht. Diese Technik und die nachfolgenden Lipin-Ergebnisse eröffnen die Möglichkeit, neue Therapien zu erforschen, die auf nicht heilenden RNAs zur Behandlung von Schilddrüsenkrebs basieren.