Verwendung von En Face Immunofluoreszenz Färbung zur direkten Beobachtung von vaskulären Endothelzellen

Dieses Protokoll hilft Menschen, die Endothelzellmorphologie und die Expression von Molekülen in Regionen unter unterschiedlicher Fluidscherspannung zu analysieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine direkte Beurteilung der vaskulären Endothelzellen unter unterschiedlicher Fluidscherspannung ermöglicht. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sind die wichtigsten Schritte, frisch zubereitetes Paraformaldehyd zu verwenden und eine gute Perfusion durchzuführen.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Anästhesisierung einer 12 Wochen alten C57BL/6-Maus, wie im Textprotokoll beschrieben. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie, indem Sie den Schwanz sanft kneifen. Verkleben Sie die Pfoten der Maus mit Klebeband auf einen Stapel Papiertücher.

Halten Sie die Haut der Maus mit Zange, und schneiden Sie die Haut mit einer Schere aus dem Bauch bis zur Oberseite des Thorax. Öffnen Sie die Bauchhöhle, unter dem Brustkorb, mit einer scharfen Schere. Heben Sie das Brustbein mit Dereins, und schneiden Sie die Membran.

Schneiden Sie dann den Brustkorb ab, um die Brusthöhle freizulegen. Schneiden Sie die Vena cava knapp über der Leber mit der Schere ab. Druck durchdringt den arteriellen Baum für fünf Minuten, mit vorgekühlter normaler Kochchen mit 40 Einheiten pro Milliliter Heparin, durch den linken Ventrikel, bis Lunge und Leber blass werden.

Dann mit vorgekühlten 4%Paraformaldehyd in PBS für vier Minuten durchziehen. Entfernen Sie alle Muskeln, Organe und Fett, bis die Aorta ausgesetzt ist. Platzieren Sie die Maus unter ein Sezierendes Mikroskop.

Verwenden Sie zarte Zangen und eine zarte Schere, um die Aorta deutlich unter einem Sezierendes Mikroskop zu belichten und das Bindegewebe entlang der Aorta so sauber wie möglich zu entfernen. Sezieren Sie die thorakale Aorta vom Herzen zum Zöliakiestamm mit einer zarten Schere. Legen Sie die Aorta in eine sechs Zentimeter große Zellkulturschale mit PBS.

Schneiden Sie die Aorta längs, zuerst entlang der geringeren Kurve, und verwenden Sie dann die Mikroschere, um die drei Zweige des Aortenbogens, einschließlich der Innomin, linken gemeinsamen Karotis, und der linken subklavischen Arterie entlang der größeren Kurve zu schneiden, bis das gerade Segment erreicht ist. Permeabilisieren Sie die Aorta mit 1%Polyoxyethylenoctylphenylether, in PBS für 10 Minuten. Dann blockieren Sie die Aorta mit 10% normalem Ziegenserum in tris-gepufferter Kochsaline, die 2,5%Polysorbat 20 für eine Stunde bei Raumtemperatur enthält, in einer 12 Well-Zell-Kulturplatte.

Als nächstes inkubieren die Aorta in der Sperrpuffer enthält fünf Gramm pro Milliliter Kaninchen Anti-VCAM1, und fünf Gramm pro Milliliter Ratte Anti-VE-Cadherin, über Nacht bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Probe dreimal mit Waschlösung gespült haben, die fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörper eine Stunde bei Raumtemperatur auftragen und an einem dunklen Ort halten. Spülen Sie noch dreimal in der Waschlösung.

Counterstain die Aorta mit DAPI für 10 Minuten, an einem dunklen Ort zu halten. Dann spülen Sie die gefärbte Aorta dreimal in Waschlösung. Legen Sie die Aorta auf einen Deckszettel mit der Lumenoberfläche nach unten, und bewegen Sie sie langsam zu einer Antifade-Montagelösung, die zuvor auf dem Deckelschlupf abgelegt wurde.

Dehnen Sie die Aorta vorsichtig, um das Exemplar flach zu halten. Invertieren Sie den Deckelschlupf und legen Sie ihn auf die Glasrutsche. Achten Sie darauf, Luftblasen zwischen der Probe und dem Glas zu vermeiden.

Untersuchen Sie die Aorta mit einem laserscannenden Konfokalmikroskop. Analysieren Sie farbintensitäten verschiedener Kanäle aus dem gewünschten Bereich in den En-Face-Bildern mit der Image-Pro Plus-Software. Gezeigt werden Immunfluoreszenz-Färbungsbilder von vaskulären Endothelzellen aus der Mausaorta.

Die Immunfluoreszenz des Gefäßzelladhäsionsproteins eins und die Expression mit VE-Cadherin als endothelialem Marker werden unter unterschiedlichen Strömungsmustern aus verschiedenen Regionen der Mausaorta gezeigt. DAPI wurde auch konterkariert, um die Zellkerne für eine bessere Visualisierung zu zeigen. Beim Blick durch die Z-Stacks unter dem Mikroskop lassen sich die endotheliale und glatten Muskelzellen leicht durch ihre Zellkernmorphologie unterscheiden.

Die endotheliale Zellkerne sind oval geformt und größer als die spindelförmigen, glatten Muskelzellkerne. Der Ausdruck von VCAM-1 war häufiger in Regionen unter gestörtem Fluss, bei geringerer Krümmung des Aortabogens, verglichen mit Regionen unter stetigem Fluss, bei größerer Krümmung des Aortabogens und an der Brustaorta. Hier werden Bereiche mit geringerer Krümmung einer Mausaorta als d-Flow-Bereiche und die größere Krümmung und Brust angezeigt.

Mit der richtigen Modifikation kann diese Technik auch auf die Analyse der Gefäßdurchlässigkeit und der Position von Makromolekülen in der Endothelzellintima angewendet werden.