Verwendung von En Face Immunofluoreszenz Färbung zur direkten Beobachtung von vaskulären Endothelzellen
20. August 2019
Hier stellen wir ein Protokoll zur Immunfluoreszenzfärbung vor, um die Endothelzellen der Mausaorta direkt zu beobachten. Diese Technik ist nützlich, wenn der zelluläre und molekulare Phänotyp von Endothelzellen in verschiedenen Strömungsmustern und bei der Entwicklung von Arteriosklerose untersucht wird.
Dieses Protokoll hilft Menschen, die Endothelzellmorphologie und die Expression von Molekülen in Regionen unter unterschiedlicher Fluidscherspannung zu analysieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine direkte Beurteilung der vaskulären Endothelzellen unter unterschiedlicher Fluidscherspannung ermöglicht. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sind die wichtigsten Schritte, frisch zubereitetes Paraformaldehyd zu verwenden und eine gute Perfusion durchzuführen.
Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Anästhesisierung einer 12 Wochen alten C57BL/6-Maus, wie im Textprotokoll beschrieben. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie, indem Sie den Schwanz sanft kneifen. Verkleben Sie die Pfoten der Maus mit Klebeband auf einen Stapel Papiertücher.
Halten Sie die Haut der Maus mit Zange, und schneiden Sie die Haut mit einer Schere aus dem Bauch bis zur Oberseite des Thorax. Öffnen Sie die Bauchhöhle, unter dem Brustkorb, mit einer scharfen Schere. Heben Sie das Brustbein mit Dereins, und schneiden Sie die Membran.
Schneiden Sie dann den Brustkorb ab, um die Brusthöhle freizulegen. Schneiden Sie die Vena cava knapp über der Leber mit der Schere ab. Druck durchdringt den arteriellen Baum für fünf Minuten, mit vorgekühlter normaler Kochchen mit 40 Einheiten pro Milliliter Heparin, durch den linken Ventrikel, bis Lunge und Leber blass werden.
Dann mit vorgekühlten 4%Paraformaldehyd in PBS für vier Minuten durchziehen. Entfernen Sie alle Muskeln, Organe und Fett, bis die Aorta ausgesetzt ist. Platzieren Sie die Maus unter ein Sezierendes Mikroskop.
Verwenden Sie zarte Zangen und eine zarte Schere, um die Aorta deutlich unter einem Sezierendes Mikroskop zu belichten und das Bindegewebe entlang der Aorta so sauber wie möglich zu entfernen. Sezieren Sie die thorakale Aorta vom Herzen zum Zöliakiestamm mit einer zarten Schere. Legen Sie die Aorta in eine sechs Zentimeter große Zellkulturschale mit PBS.
Schneiden Sie die Aorta längs, zuerst entlang der geringeren Kurve, und verwenden Sie dann die Mikroschere, um die drei Zweige des Aortenbogens, einschließlich der Innomin, linken gemeinsamen Karotis, und der linken subklavischen Arterie entlang der größeren Kurve zu schneiden, bis das gerade Segment erreicht ist. Permeabilisieren Sie die Aorta mit 1%Polyoxyethylenoctylphenylether, in PBS für 10 Minuten. Dann blockieren Sie die Aorta mit 10% normalem Ziegenserum in tris-gepufferter Kochsaline, die 2,5%Polysorbat 20 für eine Stunde bei Raumtemperatur enthält, in einer 12 Well-Zell-Kulturplatte.
Als nächstes inkubieren die Aorta in der Sperrpuffer enthält fünf Gramm pro Milliliter Kaninchen Anti-VCAM1, und fünf Gramm pro Milliliter Ratte Anti-VE-Cadherin, über Nacht bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Probe dreimal mit Waschlösung gespült haben, die fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörper eine Stunde bei Raumtemperatur auftragen und an einem dunklen Ort halten. Spülen Sie noch dreimal in der Waschlösung.
Counterstain die Aorta mit DAPI für 10 Minuten, an einem dunklen Ort zu halten. Dann spülen Sie die gefärbte Aorta dreimal in Waschlösung. Legen Sie die Aorta auf einen Deckszettel mit der Lumenoberfläche nach unten, und bewegen Sie sie langsam zu einer Antifade-Montagelösung, die zuvor auf dem Deckelschlupf abgelegt wurde.
Dehnen Sie die Aorta vorsichtig, um das Exemplar flach zu halten. Invertieren Sie den Deckelschlupf und legen Sie ihn auf die Glasrutsche. Achten Sie darauf, Luftblasen zwischen der Probe und dem Glas zu vermeiden.
Untersuchen Sie die Aorta mit einem laserscannenden Konfokalmikroskop. Analysieren Sie farbintensitäten verschiedener Kanäle aus dem gewünschten Bereich in den En-Face-Bildern mit der Image-Pro Plus-Software. Gezeigt werden Immunfluoreszenz-Färbungsbilder von vaskulären Endothelzellen aus der Mausaorta.
Die Immunfluoreszenz des Gefäßzelladhäsionsproteins eins und die Expression mit VE-Cadherin als endothelialem Marker werden unter unterschiedlichen Strömungsmustern aus verschiedenen Regionen der Mausaorta gezeigt. DAPI wurde auch konterkariert, um die Zellkerne für eine bessere Visualisierung zu zeigen. Beim Blick durch die Z-Stacks unter dem Mikroskop lassen sich die endotheliale und glatten Muskelzellen leicht durch ihre Zellkernmorphologie unterscheiden.
Die endotheliale Zellkerne sind oval geformt und größer als die spindelförmigen, glatten Muskelzellkerne. Der Ausdruck von VCAM-1 war häufiger in Regionen unter gestörtem Fluss, bei geringerer Krümmung des Aortabogens, verglichen mit Regionen unter stetigem Fluss, bei größerer Krümmung des Aortabogens und an der Brustaorta. Hier werden Bereiche mit geringerer Krümmung einer Mausaorta als d-Flow-Bereiche und die größere Krümmung und Brust angezeigt.
Mit der richtigen Modifikation kann diese Technik auch auf die Analyse der Gefäßdurchlässigkeit und der Position von Makromolekülen in der Endothelzellintima angewendet werden.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll für die Immunfluoreszenzfärbung zur direkten Beobachtung von endothelialen Zellen der Maus-Aorta vor. Die Technik eignet sich zur Analyse des zellulären und molekularen Phänotyps dieser Zellen unter verschiedenen Strömungsschubspannungsbedingungen, insbesondere im Zusammenhang mit der Entstehung von Atherosklerose.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Endothelzellenbiologie
- Atheroskleroseforschung
- Immunfluoreszenztechniken
Hintergrund
- Bedeutung von endothelialen Zellen in der Gefäßbiologie
- Rolle der Scherkräfte bei der endothelialen Funktion
- Zusammenhang zwischen Strömungsmustern und der Entstehung von Atherosklerose
Verwendete Methoden
- Protokoll zur Immunfluoreszenzfärbung
- Mausmodell (C57BL/6)
- Konfokale Mikroskopie zur Bildgebung
Hauptergebnisse
- Direkte Beurteilung von Endothelzellen mithilfe fluoreszierender Marker
- Erhöhte VCAM-1-Expression in Bereichen mit gestörtem Fluss
- Deutliche Unterscheidung der Kernmorphologie zwischen Endothel- und glatten Muskelzellen
Schlussfolgerungen
- Diese Studie bietet eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der Reaktionen von Endothelzellen auf hämodynamische Kräfte.
- Die Ergebnisse sind bedeutend für das Verständnis der vaskulären Biologie und der Mechanismen, die der Atherosklerose zugrunde liegen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die direkte Visualisierung intakter endothelialer Monolayer unter physiologischem Scherstress ermöglicht eine mechanistische Entschärfung vaskulärer Zielstrukturen in der Atheroskleroseforschung. Dieser Ansatz stärkt die Vorhersagekraft bei der Zielvalidierung, indem er hämodynamische Kräfte mit molekularen Phänotypen vor Ort verknüpft. Er stellt ein krankheitsrelevanteres System für pathophysiologische Erkenntnisse in frühen Stadien bereit, ohne genetische Modifikationen oder pharmakologische Störungen zu erfordern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem gestörte Strömungsmuster mit der Hochregulation von VCAM-1 als frühen Entzündungsmarker korreliert werden.
- Operativer Wert: Bietet eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur funktionellen Target-Validierung unter Verwendung endogener endothelialer Marker wie VE-Cadherin.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem molekulare Reaktionen identifiziert werden, die der Läsionsbildung in präklinischen Atherosklerosemodellen vorausgehen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, quantitative immunfluoreszenz-basierte Ausgaben, die für die Hochdurchsatzanalyse endothelialer Phänotypen geeignet sind.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die parallele Untersuchung mehrerer Aortenabschnitte unter definierten Strömungsbedingungen und damit vergleichende Screening-Untersuchungen.
- Assay-Standardisierung: Verwendet konsistente Perfusions-, Blockier- und Färbeprotokolle, um die Variabilität zwischen Experimenten und Laboren zu minimieren.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert direkt die frühe Anfälligkeit für Atherosklerose, indem endotheliale Reaktionen in Regionen untersucht werden, die anfällig für Plaque-Initiierung sind.
- Translationale Kontinuität: Verbindet die hämodynamische Mechanobiologie mit molekularen Messgrößen, die für die menschliche vaskuläre Pathologie relevant sind.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht die mechanistische Risikominderung von Zielstrukturen, indem deren Regulation unter pathophysiologischem Scherstress vor der Wirksamkeitsprüfung in vivo validiert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Technik fügt sich in die Entdeckungskette von der Testung von Zielhypothesen über das phänotypische Screening bis zur präklinischen Validierung ein, insbesondere für auf das vaskuläre System ausgerichtete Programme.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem die direkte Beobachtung endothelialer Aktivierungszustände unter kontrolliertem Scherstress ermöglicht wird.
- Screening: Liefert quantitative, multiplexfähige Messgrößen (z. B. VCAM-1, VE-Cadherin, Kernmorphologie) zum Vergleich der Wirkstoff- oder genetischen Effekte auf das endotheliale Phänotyp.
- Analytik: Bietet räumlich aufgelöste, intensitätsbasierte Messungen, die einen statistischen Vergleich der molekularen Expression in verschiedenen Aortenregionen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Flussmodelle mit in-vivo-ähnlichen endothelialen Reaktionen und erhöht so die Vorhersagekraft für präklinische Studien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Gefäßphänotypisierung, die in mehreren Projekten zu Atherosklerose, Hypertonie oder vaskulärer Entzündung eingesetzt werden kann.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Reduziert mechanistische Unschärfen, indem hämodynamische Kräfte mit spezifischen endothelialen molekularen Phänotypen im intakten Gewebe verknüpft werden.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Perfusion-, Fixierungs- und Färbungsschritte sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem die Zielinteraktion unter pathophysiologisch relevante mechanischen Reizen validiert wird.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf deren Regulation in frühen atherosklerotischen endothelialen Phänotypen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der vaskulären Dissektion von Mäusen, Perfusionsmethoden und konfokaler Mikroskopie.
- Setzt den Zugang zu Perfusionseinrichtungen, Stereomikroskopen und Laserscanning-konfokalen Systemen mit spektraler Entmischung voraus.
- Erfordert die Standardisierung von Perfusionsdruck, Fixierungstemperatur und Antikörpertitration über verschiedene Anwender und Standorte hinweg.
- Die Anpassung an andere Gefäßbetten (z. B. Arteria carotis, Koronararterien) kann eine Optimierung der Dissektions- und Permeabilisierungsschritte erfordern.
- Auf Endpunktanalysen beschränkt; ermöglicht keine Echtzeit-Aufnahme dynamischer endothelialer Reaktionen unter Flussbedingungen.
