Name: Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Lernen Sie die Ex-Vivo-Konfokalmikroskopie zur Visualisierung von T- und B-Zellen in Lymphknoten. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen der Immunantwort in vivo.

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Diese Arbeit wurde vom NIH (R01 AI43458 bis H.L.W.) unterstützt.

Das Protokoll wurde vom Standing Committee on Animals an der Harvard Medical School und dem Brigham and Women es Hospital, Protokoll 2016N000230, genehmigt.
1. Mäuse, die für das Experiment verwendet werden
<ol><li>Verwenden Sie 8 Wochen alte männliche und weibliche Mäuse auf dem B6-Hintergrund für die Verabreichung der Antikörpermischung.</li>
	<li>Verwenden Sie CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT-Mäuse, um festzustellen, ob ex vivo ganze LN-Bildgebung auch auf Reportermäuse angewendet werden kann, ohne Antikörpermischung zu verabreichen, sowie um das Vorhandensein von mononukleären Zellen zu untersuchen, einschließlich Antigen, die Zellen und Phagozyten und ihre Verteilung in den LN. HINWEIS: CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT Reportermäuse haben grünes fluoreszierendes Protein (GFP) und rotes fluoreszierendes Protein (RFP) unter der Kontrolle von CX3CR1 bzw. CCR2-Promotoren eingesetzt. Reportermäuse können mit oder ohne Injektion der Antikörpermischung verwendet werden. Bitte beachten Sie Referenz4 für Antikörper-Mix-Injektion in einer Reportermaus. Fahren Sie mit der Operation fort, wenn kein Antikörper injiziert wird.</li>
</ol>2. Antikörper-Mix-Vorbereitung und Injektion
HINWEIS: Führen Sie diese Schritte an Mäusen aus, die in Schritt 1.1 beschrieben sind.
<ol><li>1:10 von brillantviolett (BV) 421 anti-CD4 verdünnen (GK1.5; 0,2 mg/ml), 1:10 von brillantblau (BB) 515 Anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/ml) und 1:20 Von Phycoerythrin (PE) Anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/ml) in PBS mit dem entsprechenden Endvolumen, um in den inneren Oberschenkel zu injizieren (zu Bild leisten) oder in die Pfotenpad (um popliteal) Lymphe zu bilden. HINWEIS: Verwendung als Isotypen: BV421 Mouse IgG2b, k Isotype Control (R35-38; 0,2 mg/ml); PE Ratte IgG2a, Isotype Control (R35-95; 0,2 mg/ml); BB515 Ratte IgG2a, Isotype Control (R35-95; 0,2 mg/ml). Wenn Sie den Färbeantikörper ändern, verwenden Sie den richtigen Isotyp.</li>
	<li>Um die Leistenbild LN abzubilden, injizieren Sie 100 l des Antikörper-Mix subkutan in den inneren Oberschenkel (Abbildung 1A). Alternativ können Sie eine subkutane Antikörpermischung von 50 l in das Pfotenpad in das Bild popliteal LN (Abbildung 2A) einspritzen. Verwenden Sie empfindliche 1 ml Insulinspritzen (Insulin U-100) mit der Nadel der Größe 0,30 mm x 13 mm (30 Gauge bei 1/2 Zoll). HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Injektion für die Braunfärbung von LN subkutan und nicht intramuskulär ist (i.m.), da die Antikörpermischung nicht ordnungsgemäß entleert wird, wenn die i.m. Verabreichung durchgeführt wird.</li>
	<li>Anästhesisieren Sie Tiere nicht vor der Injektion von Antikörpermischungen.</li>
	<li>Warten Sie mindestens 3 h (leistend) und 12 h (popliteal dLN) nach der Injektion, um die Organe zu entfernen.</li>
	<li>Wenn die LN-Zellbeschriftung nicht vollständig mit großen Polymerfluoreszenzfarbstoffen wie brillanten Violett- oder Brillantblau-Farbstoffen beobachtet wird, verwenden Sie als Alternative kleinere Fluorophore, einschließlich Fluoresceinisothiocyanat (FITC), PE und Allophycocyanin (APC).</li>
</ol>3. Chirurgisches Verfahren zur Entfernung des leistend entwässernden Lymphknotens
<ol><li>Euthanisieren Sie Mäuse mit CO2-Erstickung, gefolgt von zervikalen Dislokationen.</li>
	<li>Immobilisieren Sie Mäuse auf der Acrylbühne mit Klebeband und tragen Sie Mineralöl mit einem Wattestäbchen auf die Bauchhaut auf, um Fellablagerungen um den Schnitt zu verhindern (Abbildung 1B). Pelzentfernung ist nicht notwendig.</li>
	<li>Führen Sie einen Mittellinienschnitt mit einer mikrochirurgischen gekrümmten Schere (11,5 cm) und einer mikrochirurgischen gekrümmten Zange (12,5 cm) im Bauch vom Schambein bis zum xiphoiden Prozess durch (Abbildung 1C).</li>
	<li>Dissoziieren Sie die Bauchmuskulatur von der Haut (Abbildung 1D).</li>
	<li>Machen Sie horizontale Hauteinschnitte an der Ober- und Unterseite der vertikalen Schnittlinie, um Hautklappen auf der Seite des Interesses zu erstellen (entsprechend der Seite der Antikörper-Mix-Injektion) und klappern Sie die Haut, um den Lymphknoten zu visualisieren (Abbildung 1E).</li>
	<li>Kleben Sie die Hautklappe auf die Acrylplatte (Abbildung 1F).</li>
	<li>Entfernen Sie den inguinal entwässernden Lymphknoten mit mikrochirurgischen gekrümmten Zangen (Abbildung 1F). Lymphknoten erscheint als transluzider, in der Regel bilobular, Kugel unter der Haut.</li>
</ol>4. Chirurgisches Verfahren zur Entfernung des popliteal enzierenden Lymphknotens
<ol><li>Euthanisieren Sie Mäuse mit CO2-Erstickung, gefolgt von zervikalen Dislokationen.</li>
	<li>Immobilisieren Sie Mäuse in einer anfälligen Position auf Acryl-Bühne mit Klebeband und wenden Sie Mineralöl mit einem Wattestäbchen in der Wade und Knie (Abbildung2A-D).</li>
	<li>Führen Sie einen Mittellinienschnitt in der Wade von der Ferse bis zum Knie (Abbildung 2E,F).</li>
	<li>Dissoziieren Sie die Kalbsmuskulatur von der Haut (Abbildung 2F,G).</li>
	<li>Expose the popliteal fossa (Abbildung 2G). Popliteallymphknoten erscheint als transluziden Kugel in der poplitealen Fossa.</li>
	<li>Entfernen Sie den poplitealen Lymphknoten mit mikrochirurgischen gekrümmten Zangen (Abbildung 2G).</li>
	<li>Alternativ drehen Sie die Maus auf supine Position, und nähern Sie sich der poplitealen Fossa zwischen bizeps femoris und semitendinosus für popliteale LN Entfernung durch Durchführung einer Mittellinie Schnitt in der Wade von der Ferse bis zum Knie gefolgt von Dissoziation des Kalbs Muskulatur von der Haut. HINWEIS: Popliteal fossa ist eine flache Depression an der Rückseite des Kniegelenks. Öffnen Sie sorgfältig, um den poplitealen Lymphknoten zu sehen.</li>
</ol>5. Lymphknotenvorbereitung
<ol><li>Legen Sie das ganze Organ in eine Kulturschale mit Glasboden (35 mm x 10 mm) und entfernen Sie das Fett, das das Organ umgibt, mit mikrochirurgischen gebogenen Zangen (Abbildung 1G-I und Abbildung 2H).</li>
	<li>Zentralisieren Sie das Organ in der Mitte der Schale (Abbildung 1J und Abbildung 2H).</li>
	<li>Bedecken Sie das Organ mit einem Fragment von empfindlichen Aufgabenwischern und halten Sie es mit Raumtemperatur-Saline 0,9% oder Phosphat-Puffer-Lösung (Abbildung 1K-M und Abbildung 2H) getränkt. HINWEIS: Es ist nicht notwendig, Lymphknoten nach der Entfernung zu waschen oder die Lymphknotenextraktion in der Haube durchzuführen.</li>
</ol>6. Ex-vivo konfokale Mikroskopie (Imaging)
<ol><li>Positionieren Sie die Petrischale im invertierten konfokalen Mikroskopschlitz (Abbildung 1N und Abbildung 2H).</li>
	<li>Bild-LNs unter einem konfokalen Mikroskop (Abbildung 1O und Abbildung 2H).</li>
	<li>Erhalten Sie zunächst den richtigen Fokus, indem Sie das herkömmliche Licht des konfokalen Mikroskops mit 4x oder 10x Objektiv verwenden. Wechseln Sie dann von der Lichtfunktion in den Lasermodus. HINWEIS: Wenn das konfokale Mikroskop kein 4-faches Objektiv enthält, kann der Fokus mit dem 10-fachen Objektiv perfekt erreicht werden.</li>
	<li>Anpassen der Laserleistung, des Offsets und der Verstärkung mit einer isotypgefärbten, nicht gefleckten oder nicht fluoreszierenden Probe (Tabelle1), um Autofluoreszenz und unspezifische Färbung enthäut von fluoreszierenden Antikörpern, wie sie in den in diesem Bild gezeigten Manuskript (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 und PE anti-F4/80).</li>
	<li>Passen Sie Z- und XY-Positionen mit dem mikrometrischen bzw. wagen den Bereich des Interesses am Lymphknoten an.</li>
	<li>Erfassen Sie Bilder unter 4x, 10x und 20x Objektiven, die sich auf die LN-Struktur und Zellverteilung konzentrieren. Verwenden Sie die Definition von 1024 x 1024 Pixel. HINWEIS: Erwerben Sie mindestens fünf Bilder in verschiedenen Feldern pro Ziel pro Tier.</li>
	<li>Analysieren Sie Bilder mit einer Bildsoftware, um Kanäle zu trennen, Skalierung und Farben von Interesse hinzuzufügen und 3D-Ansicht zu rekonstruieren.</li>
</ol>

<ol><li>Willard-Mack, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of lymph nodes.</a> Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).</li>
<li>Tas, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antibody+affinity+maturation+in+germinal+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers.</a> Science. 351, 1048-1054 (2016).</li>
<li>David, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Mass+Cytometry+and+Imaging+Analysis+Reveals+Origin%2C+Location%2C+and+Functional+Repopulation+of+Liver+Myeloid+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice.</a> Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).</li>
<li>Rezende, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+control+humoral+immune+response+by+inducing+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation.</a> Nature Communications. 9, 3151(2018).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+triple-fluorescent+mouse+strain+allows+a+dynamic+and+spatial+visualization+of+different+liver+phagocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Anais+da+Academia+Brasileira+de+Ciencias%22%5BJournal%5D)">Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo.</a> Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317(2019).</li>
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<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
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<li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26, 655-667 (2007).</li>
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<li>Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+splenic+marginal+zone+B-cell+shuttling+and+follicular+B-cell+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress.</a> Nature. 493, 684-688 (2013).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li>
<li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).</li>
<li>Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+receptor+2+mediates+the+retention+of+immature+B+cells+in+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids.</a> Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+metabolic+shifts+during+neonatal+development+reprogram+liver+identity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function.</a> Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Roozendaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conduits+mediate+transport+of+low-molecular-weight+antigen+to+lymph+node+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles.</a> Immunity. 30, 264-276 (2009).</li>
<li>Sarder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-near-infrared+multiphoton+microscopy+interrogates+intact+tissues+at+deeper+imaging+depths+than+conventional+single-+and+two-photon+near-infrared+excitation+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 106012(2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Kombination von Bildgebung mit anderen Techniken, einschließlich Molekularbiologie und hochdimensionaler Immunphenotypisierung, hat unsere Fähigkeit verbessert, Immunzellen in ihrem nativen Kontext zu untersuchen. Während andere Ansätze gewebeverdauliche und zellisolierte Anwendungen erfordern – was zu einem Verlust der Gewebeintegrität führen kann – bietet die Verwendung von In-vivo- oder Ex-vivo-Bildgebung einen großen Vorteil bei der geographischen Untersuchung verschiedener Zellsubtypen3 <...

Lymphknoten (LNs) sind eiförmige Organe, die weit verbreitet im ganzen Körper vorhanden sind, mit der entscheidenden Funktion, die angeborenen und adaptiven Immunantworten zu überbrücken. LNs filtern die Lymphe, um Fremdpartikel und Krebszellen zu identifizieren, um eine Immunantwort gegen sie zu montieren1. Antigen-präsentierende Zellen (APCs), T-Zellen und B-Zellen arbeiten zusammen, um antigenspezifische Antikörper (humorale Immunität) und zytotoxische Lymphozyten (zelluläre Immunität) zu erzeugen, um die Fremdpartikel und Krebszellen zu beseitigen2. Das Verständnis der Dynamik der im Lymphsystem vorhandenen Immunzellen wird daher wichtige Auswirkungen auf die Impfstoffentwicklung und die Krebsimmuntherapie haben.
Das Aufkommen leistungsstarker Mikroskope - einschließlich neuer konfokaler und superhochauflösender Mikroskope - hat einen außergewöhnlichen Fortschritt im Verständnis des Verständnisses ermöglicht, wie sich verschiedene Immunzellpopulationen in ihrer heimischen Umgebung verhalten3. Es ist nun möglich, mehrere simultane Zellsubtypen mit einer Kombination von Sonden mit genetisch veränderten Mäusen abzubilden, die fluoreszierende Proteine unter Kontrolle spezifischer Targets4,5ausdrücken. In der Tat waren hochdimensionale Techniken, einschließlich Massenzytometrie und multiparametrische Strömungsanalyse, entscheidend für die Erweiterung unseres Wissens über verschiedene Immunzellabteilalisation und Funktionalität in Gesundheit und Krankheit6, 7. Um jedoch Proben für diese Techniken vorzubereiten, müssen Gewebe verdaut werden und Zellen werden von ihrem natürlichen Milieu getrennt, um in Zellsuspensionen analysiert zu werden. Um diese Grenzen zu übertreffen und eine bessere Übersetzung in die Biologie zu ermöglichen, ist das Ziel des hier vorgeschlagenen Protokolls, eine einfache Methodik anzuwenden, um ex vivo ganze Lymphknoten mit Stock-Konfokalmikroskopen mit dem Vorteil einer verbesserten Geschwindigkeit, Gewebe Strukturerhaltung und Zelllebensfähigkeit im Vergleich zur herkömmlichen Immunfluoreszenzfärbung. Mit diesem Ansatz konnten wir zeigen, dass Mäuse, die einen Mangel an T-Zellen haben, einem Subtyp von T-Lymphozyten, der an der frühen Abwehr von Krankheitserregern beteiligt ist4, Follikel und T-Zellzonen im Vergleich zu Wildtypmäusen kompromittiert haben. Diese Ergebnisse ermöglichten es uns, eine Studie zu verfolgen, in der wir zeigten, dass T-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Homöostase von Lymphorganen und der humoralen Immunantwort spielen4. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll einen physiologischen Weg für Sonden und Antikörper, um den Lymphknoten zu erreichen, da sie subkutan verabreicht werden und sich durch die Lymphzirkulation des Gewebes ableiten, aufbauend auf früheren Berichten, die in situ-Kennzeichnung verwendet wurden. mit Antikörpern zur Visualisierung lymphatischer Strukturen8,9, Keimzentrumsdynamik10,11,12und Targets leicht zugänglich für den Blutfluss13 ,14,15.

<table><tbody><tr><td>BV421 Anti-CD4</td><td>BD Horizon</td><td>562891</td><td>GK1,5; 0,2 mg mL-1</sup</td></tr><tr><td>>BB515 anti-CD19</td><td>BD Horizon</td><td>564509</td><td>1D3; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BB515 Ratten-IgG2a & Kappa; Isotype Control</td><td>BD Horizon</td><td>564418</td><td>R35-95; 0,2 mg mL-1</sup</td></tr><tr><td>>BV421 Maus IgG2b, K Isotype Control</td><td>BD Horizon</td><td>562603</td><td>R35-38 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Cellview Kulturschale</td><td>Greiner-Bio</td><td>627861</td><td>35x10 mm mit Glasboden</td></tr><tr><td>Insulinspritzen</td><td>BD Plastipak-Insulin</td><td></td> <td>U-100</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech Science Brand</td><td>7557</td><td>Größe 21 x 20 cm / 100 Blatt pro Karton</td></tr><tr><td>Mikrochirurgie gebogene Pinzette</td><td>WEP Chirurgische Instrumente</td><td>nach Maß</td><td>12,5 cm</td></tr><tr><td>Mikrochirurgie gebogene Schere</td><td>WEP Chirurgische Instrumente</td><td>nach Maß</td><td>11,5 cm</td></tr><tr><td>Nadel</td><td>BD PrecisionGlide-30</td><td></td> <td>Gauge &times; &frac12; Zoll</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Te + A1R konfokaler Kopf</td><td>Nikon</td><td>-</td><td>beladen mit 4 Hauptlaserlinien (405, 488, 543 und 647 nm)</td></tr><tr><td>PE anti-F4/80</td><td>BD Pharmigen</td><td>565410</td><td>T45-2342; 0,2 mg mL<>-1</td></tr><tr><td>PE Ratte IgG2a, & kappa; Isotype Control</td><td>BD Pharmigen</td><td>553930</td><td>R35-95; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 konfokales Mikroskop</td><td></td><td></td> <td>Zeiss-bestückt mit 4 Hauptlaserlinien (405, 488, 543 und 647 nm)</td></tr></tbody></table>

visualisierung der lymphknotenstruktur und zelllokalisierung mittels ex-vivo konfokalmikroskopie

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymphknoten (LNs) sind Organe, die sich im Körper ausbreiten, wo sich die angeborenen Immunantworten mit der adaptiven Immunität verbinden können. Tatsächlich sind LNs strategisch im Pfad der Lymphgefäße intergesetzt, was einen intimen Kontakt von Gewebeantigenen mit allen ansässigen Immunzellen in der LN ermöglicht. So wird das Verständnis der zellulären Zusammensetzung, Verteilung, Lage und Interaktion mit ex vivo ganze LN-Bildgebung das Wissen darüber, wie der Körper lokale und systemische Immunantworten koordiniert, ergänzen. Dieses Protokoll zeigt eine ex vivo-Bildgebungsstrategie nach einer In-vivo-Verabreichung von fluoreszierend markierten Antikörpern, die eine sehr reproduzierbare und leicht durchzuführende Methodik mit herkömmlichen konfokalen Mikroskopen und Stoffreagenzien ermöglicht. Durch subkutane Injektion von Antikörpern ist es möglich, verschiedene Zellpopulationen in entwässernden LNs zu kennzeichnen, ohne Gewebestrukturen zu beeinträchtigen, die durch eine herkömmliche Immunfluoreszenzmikroskopie-Technik potenziell beschädigt werden können.

Dieses Manuskript zeigt Techniken zur Entfernung von Leisten- und Popliteal-Lymphknoten, ohne ihre Struktur nach der Injektion fluoreszierender Antikörper zu beschädigen, um bestimmte Zellpopulationen in diesen Organen zu färben (Abbildung 1 und Abbildung 2 ).
Die leistungsstarke Kombination von Immunolabeling von LN-Zellen mit BV421 Anti-CD4 und BB515 Anti-CD19 und konfokaler Bildgebungsanalyse definierte die Lokalisation von T-Zelle...

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um verschiedene Zellpopulationen in entwässernden Lymphknoten ohne Veränderungen in der Organstruktur abzubilden.

Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Dieses reproduzierbare und einfach durchzuführende Protokoll verwendet eine Ex-vivo-Lymphknoten-Bildgebungsstrategie, um die Entwässerung von in-vivo verabreichten fluoreszierenden markierten Antikörpern an lokale sekundäre Lymphoidorgane zu verfolgen. Die Demonstration dieser Technik ermöglicht eine spezifische Visualisierung der Prozedur, was eine erfolgreiche Ausführung des Protokolls erleichtern kann. Dies ist eine sehr einfache und unkomplizierte Technik, die von jedem durchgeführt werden kann.Der einzige herausfordernde Aspekt ist die Maushandhabung, die einiges Training erfordert. Diese Technik hat den Vorteil einer verbesserten Geschwindigkeitsgewebebelastungundung und Zelllebensfähigkeit im Vergleich zu herkömmlichen fluoreszierenden Färbungsmethoden. Ausbildung des Verfahrens wäre Bruna Tatematsu, eine Technikerin aus dem Labor.Verdünnen Sie die Mitstoffe von Interesse, konjugiert zu den entsprechenden Fluorophoren, in 100 Mikroliter PBS für die Bildgebung von Leistenlymphknoten oder 50 Mikroliter PBS für die popliteale Lymphknotenbildgebung. Für die Bildgebung von Leisten-Lymphknoten 100 Mikroliter des Antikörpercocktails in eine einMilliliter-Insulinspritze laden, die mit einer 30-Meter-mal-Halbzoll-Nadel ausgestattet ist, und die Antikörper subkutan in den inneren Oberschenkel der Versuchsmaus injizieren. Zur poplitealen Lymphknotenbildgebung 50 Mikroliter des Antikörpercocktails subkutan in ein Pfotenpad des Versuchstiers injizieren.Dann kehren Sie das Tier in seine Heimatbox zurück. Für Leistenentwässerung Lymphknoten Ernte, nach dem Warten mindestens drei Stunden von der Injektion, immobilisieren Sie die Maus auf der Acryl-Bühne mit Klebeband und wenden Sie Mineralöl auf die Bauchhaut. Verwenden Sie Standard-Mikrochirurgie-Schere und Mikrochirurgie gekrümmte Zange, um einen Mittellinien-Hautschnitt im Bauch von der Schambein-Totschlag-Prozess zu machen, und dissoziieren Sie die Bauchmuskulatur von der Haut.Machen Sie horizontale Hauteinschnitte in der Ober- und Unterseite der vertikalen Schnittlinie, um Hautklappen an der Seite der Injektion zu erstellen, und ziehen Sie die Haut zurück, um den Lymphknoten zu visualisieren. Sichern Sie die Hautklappe an der Acrylplatte, und verwenden Sie die Zange, um den transluzenten, in der Regel zweisprachigen sphärischen Leistenabfluss-Lymphknoten zu entfernen. Für popliteale entwässernde Lymphknoten Ernte, mindestens 12 Stunden nach der Injektion, immobilisieren Sie die Maus in der anfälligen Position auf einer Acryl-Bühne.Tragen Sie Mineralöl auf das Kalb und knie auf der injizierten Seite des Tieres auf. Als nächstes machen Sie einen Mittellinienschnitt in der Wade von der Ferse bis zum Knie, und distanzieren Sie die Wadenmuskulatur von der Haut. Expose die popliteale Fossa.Der popliteale Lymphknoten erscheint als transluzente Kugel innerhalb der Fossa. Entfernen Sie dann den Lymphknoten mit den gekrümmten Zangen der Mikrochirurgie. Um den Lymphknoten für die Bildgebung vorzubereiten, legen Sie die gesamten Organe in eine 35 mal 10 Millimeter große Kulturschale mit einem Glasboden und entfernen Sie mit Zangen das Gesamteinfett, das das Gewebe umgibt.Zentrieren Sie das Organ in der Mitte der Schale, und bedecken Sie das Gewebe mit einem Stück salinegetränkten zarten Aufgabenwischer. Positionieren Sie die Schale für die Ex-vivo-Bildgebung im invertierten konfokalen Mikroskopschlitz und verwenden Sie das herkömmliche Licht des konfokalen Mikroskops und das 4-10X-Objektiv, um den richtigen Fokus zu erhalten. Wechseln Sie von der Lichtfunktion in den Lasermodus und verwenden Sie eine isotopbefleckte, nicht gefleckte oder nicht fluoreszierende Probe, um die Laserleistung, den Offset und die Verstärkung anzupassen, um die automatische Fluoreszenz und jede nicht spezifizierte Färbung zu entfernen.Erfassen Sie Bilder unter den 4, 10 und den 20X-Objektiven, die sich auf die Struktur des Lymphknotens und die Zellverteilung konzentrieren und eine Definition von 1024 x 1024 Pixel verwenden. Verwenden Sie dann ein geeignetes Imaging-Analyse-Softwareprogramm, um die Kanäle zu trennen, den Maßstab und die Farben von Interesse hinzuzufügen und die 3D-Ansicht zu rekonstruieren. Die leistungsstarke Kombination von Immunolabeling von Lymphknotenzellen mit Anti-CD4- und Anti-CD19-Antikörpern und konfokaler Bildgebungsanalyse ermöglicht die Lokalisierung von T- und B-Zellen innerhalb der Leistenlymphknoten.In den poplitealen Lymphknoten, wie im Leistengewebe, sind die B-Zellfollikel von T-Zellpopulationen umgeben, ein Kennzeichen der Lymphknotenstruktur. Wie in diesen Bildern beobachtet, verinnerlichen Phagozyten die injizierten Antikörper nicht, was darauf hindeutet, dass die B- und T-Zellfärbung spezifisch ist. Darüber hinaus weist eine Rekonstruktion der Etikettierung darauf hin, dass sich die T- und B-Zellfärbung nicht überlappen, was die Spezifität der Färbung bestätigt.Monozelluläre Zellen werden im gesamten Leisten-Lymphknoten beobachtet, einschließlich der subkapsulären Sinus. Mit der Mehrheit der mononukleären Zellen, die CX3XR1 exdrücken, gefolgt von CCR2 und CXCR31CCR2 doppelpositive Zellen. Das gleiche Muster der Zellverteilung und Zellphänotypen wird im poplitealen Lymphknoten beobachtet.Beide Lymphknoten weisen auch dunkle Regionen ohne mononukleäre Zellrezeptorexpression auf, die von Lymphozyten belegt sind. Darüber hinaus sind mononukleäre Zellen im inneren Bereich der Lymphknoten knapp und bleiben in den äußeren Bereichen des Gewebes konzentriert, was darauf hindeutet, dass diese Zellen in erster Linie den lymphen Knoten subkapsulären Sinus besetzen. Das Antikörpergemisch muss präzise in das Subkutangewebe injiziert werden, damit das Lymphsystem die Antikörper ordnungsgemäß an den Lymphknoten abtropfen lässt.Diese Methode kann auf die Bioverteilung von fluoreszierenden markierten Arzneimitteln und auf Zellzielstudien von fluoreszierenden nanopartikeln Nanopartikeln angewendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zwei-Photonen-Imaging hat Lymphozyten Motilität und zellulären Interaktionen im Lymphknoten unter basalen Bedingungen und während einer Immunantwort Antwort 1 aufgedeckt. Hier zeigen wir, adoptiven Transfer von T-Zellen, Isolierung von Lymphknoten und Imaging-Motilität der CD4 + T-Zellen in der explantierten Lymphknoten.

Dissection und 2-Photonen-Imaging der peripheren Lymphknoten in Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Bild fluoreszierenden T-Zellen in Lymphknoten Scheiben eingeführt. Die Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen der T-Zell-Migration mit traditionellen Weitfeld-Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopen.

Ex-vivo-Imaging von T-Zellen in Murine Lymph Node Slices mit Weitfeld und konfokale Mikroskope

Jüngste Fortschritte in der 2-Photonen-Mikroskopie sind in Echtzeit...

Bildgebung des dem Maus-Kniekehlen-Lymphknoten

Kürzlich entwickelte Bildgebungsverfahren mittels Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) kann helfen erläutern die Rolle spielt das Lymphsystem in Krebsmetastasen, Immunantwort, Wundheilung und anderen lymphatischen-assoziierten Krankheiten.

Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

Dieses Video zeigt eine Seziertechnik zur Entnahme von kniekehlendrainierenden Lymphknoten aus den Hinterbeinen der Maus. Lymphknoten spielen eine entscheidende Rolle bei der Überbrückung der angeborenen und adaptiven Immunität, und die Entnahme intakter Lymphknoten – mit einer erhaltenen Gewebestruktur und zellulären Lebensfähigkeit – kann helfen, lokale und systemische Immunreaktionen zu untersuchen.

Eine Dissektionsmethode zur Entnahme von murinen Kniekehle-Drainagelymphknoten für die ex vivo-Bildgebung

Hochauflösende intravitalen Bildgebung mit Kontrastverstärkung von bis zu 120 &amp;mgr; m Tiefe in Lymphknoten von erwachsenen Mäusen durch räumliches Modulieren des Erregungsmusters einer multifokalen Zwei-Photonen-Mikroskop erreicht. In 100 um Tiefe gemessen wir Auflösungen von 487 nm (lateral) und 551 nm (axial) und damit umgehen, Streuung und Beugung Grenzen.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Die extrazelluläre Matrix unterliegt erheblichen Umbau während der Wundheilung, Entzündung und Tumorgenese. Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz Intravital-Immunfluoreszenz-Mikroskopie, die Dynamik der Fibrillen sowie netzartige Matrix-Komponenten mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit Epi-Fluoreszenz-oder Zwei-Photonen-Mikroskopie visualisieren.

Langzeit-Intravitalimmunfluoreszenz-Imaging von Gewebematrix Bestandteile mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Bild resident Tumor infiltrieren CD8 T-Zellen beschriftet mit Gewebekulturen gekoppelten Antikörpern im menschlichen Lunge Tumor Scheiben. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen von CD8 T Zelle Migration mit der konfokalen Mikroskopie.

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

Ein Protokoll wird vorgestellt, das gewebeclearing mit Derobogenfluoreszenzmikroskopie (LSFM) kombiniert, um dreidimensionale und zelluläre Auflösungsbilder der Lymphgefäße und Lymphknoten (LNs) zu erhalten, die die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und die spinale Epiduralanflüssigkeit sammeln.

Dreidimensionale Bildgebung der wirbelförmigen lymphatischen Vaskulatur und Drainage mit iDISCO+ und Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie

Hier wird ein Protokoll zur Bewertung der meningealen lymphatischen Gefäße (MLVs) der Maus vorgestellt, die eine wichtige Rolle bei mehreren neurologischen Erkrankungen spielen. Ziel dieses Protokolls ist es, eine integrierte Methode bereitzustellen, die sowohl die funktionale Bewertung der Tracerdrainage als auch eine detaillierte morphologische Charakterisierung des dorsalen MLVs-Netzwerks ermöglicht.

Integriertes Protokoll zur Beurteilung der meningealen Lymphatik: Cisterna-Magna-Injektion, Lymphknotenbildgebung, meningeale Dissektion und Ganz-Mount-Färbung

Lernen Sie die Ex-Vivo-Konfokalmikroskopie zur Visualisierung von T- und B-Zellen in Lymphknoten. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen der Immunantwort in vivo.

Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie

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