Biosynthese eines Flavonols aus einem Flavanon durch Die Etablierung einer Ein-Topf-Bienzymatischen Kaskade

Mit diesem Protokoll können wir leicht eine ganze Reihe von Flavonolen aus Flavanonen in einem Topf produzieren. Diese Technik ist arbeits- und zeitsparend, sehr kostengünstig und leicht zu kontrollieren, so dass sie ein enormes Industrialisierungspotenzial hat. Ja, diese Methode kann Einblick in die wirtschaftliche Produktion anderer sekundärer Metaboliten geben, aber sie erfordert einige Änderungen, wenn sie angewendet wird.

Er wird in der Regel nichts oder sehr geringe Ausbeute bekommen. Mein Rat ist, rekombinante Enzyme auf Eis zu behandeln und 10% Glycerin in die Stammlösung von Enzymen hinzuzufügen. Das liegt daran, dass nur durch visuelle Demonstration eine neue Hand die wichtigen Details und Wahrheiten verstehen kann, die die erfolgreiche Durchführung des Experiments beeinflussen.

Bereiten Sie zunächst Puffer vor. Machen Sie zweimal synthetischepuffer, indem Sie die entsprechende Menge an TRIS-Basis, Natriumascorbat, Alpha-Ketoglutersäure in entionisiertes Wasser und Pipette entsprechend viel Glycerin für die Lösung auflösen. Verwenden Sie eine Pipette, um Salzsäure hinzuzufügen, um den pH-Wert auf 7,2 einzustellen, und passen Sie die Lautstärke durch Zugabe von entionisiertem Wasser an.

Bewahren Sie den zweifachen synthetischen Puffer bei vier Grad Celsius für die zukünftige Verwendung auf. Dann machen Sie eine 100-fache Stammlösung, indem Sie Eisensulfat-Heptahydrat in entionisiertem Wasser auflösen. Machen Sie eine Lagerlösung von 25 Millimolar Flavonoid durch Lösen von Flavonoid in Methanol, und speichern Sie die Lösung bei minus 20 Grad Celsius.

Der wichtigste Schritt ist die Einrichtung eines synthetischen Systems. Um ein synthetisches System zur Herstellung eines Flavanols aus einem Flavanon einzurichten, bereiten Sie zunächst das synthetische System in einem Zwei-Milliliter-Rohr gemäß den in dieser Tabelle aufgeführten Reagenzien vor. Legen Sie das offene Rohr in einem schüttelnden Wärmeblock bei 40 Grad Celsius, bei 600 U/min für vierzig Minuten.

Danach beenden Sie die Reaktion, indem Sie 10 Mikroliter Essigsäure und 100 Mikroliter Ethylacetat hinzufügen. Zwei Stunden später verwenden Sie eine Pipette, um die obere organische Phase auf ein 1,5-Milliliter-Rohr zu übertragen, und legen Sie das Rohr in eine Haube für die Lufttrocknung bei Raumtemperatur. Um eine TLC-Analyse durchzuführen, rufen Sie zunächst die Rohre aus der Haube ab und lösen Sie das Flavanoidpulver in 160 Mikroliter Methanol in einem Rohr wieder auf.

Bereiten Sie authentische Flavonoidproben mit seriellen Konzentrationen vor, indem Sie die 25 Millimolar Flavonoid-Stammlösung in Methanol verdünnen. Einen Mikroliter der wieder aufgelösten Reaktionsprobe und einen Mikroliter der authentischen Flavonoidprobe auf eine Polyamidplatte laden. Tun Sie das gleiche für die anderen Konzentrationen von authentischem Flavonoid auf der gleichen Platte.

Dann in einer Dunstabzugshaube die Probenplatte in einen Chromatographiezylinder geben, der mit einem Lösungsmittelsystem gefüllt ist. Befestigen Sie die Platte an der Unterseite des Zylinders, und führen Sie die Platte 20 Minuten lang im Lösungsmittelsystem aus. Die Platten werden bei Raumtemperatur an die Luft trocknen.

Mit einer Sprühflasche die Platten mit 1%ethanolischer Lösung aus Aluminiumchlorid besprühen, gefolgt von der Lufttrocknung bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Visualisieren Sie die Flecken auf den Platten unter einem UV-Licht bei 254 Nanometern, und nehmen Sie Bilder auf, dann öffnen Sie auf dem Computer die Software ImageJ. Klicken Sie auf Datei, öffnen Sie, um das zu analysierende Bild zu öffnen.

Klicken Sie auf das rechteckigste Auswahlwerkzeug links in der ImageJ-Benutzeroberfläche. Umreißen Sie den ROI im Bild mit der Maus, und drücken Sie einen, um den ersten ROI zu beschriften. Verschieben Sie die rechteckige Auswahl mit der Maus nach rechts zum nächsten ROI, und drücken Sie zwei, um den zweiten ROI zu beschriften.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, um alle anderen ROIs zu beschriften, indem Sie zwei drücken. Drücken Sie drei, um Profildiagramme für alle ROIs in einem Popupfenster zu generieren. Verwenden Sie dann das Auswahlwerkzeug für gerade Linien, um Basislinien zu löschen, um einen geschlossenen Bereich für jeden Spitzenwert zu definieren.

Aktivieren Sie das Zauberstab-Tool, indem Sie auf das entsprechende Symbol in der ImageJ-Benutzeroberfläche klicken. Klicken Sie in die Spitze, um die Ergebnisse für alle Spitzen in einem Popupfenster anzuzeigen. Als Nächstes zeichnen Sie in Excel die Grauwerte aus dem Pop-up-Fenster mit den entsprechenden Flavonoidkonzentrationen, um eine TLC-basierte Standardkurve des authentischen Flavonoids zu erstellen.

Berechnen Sie dann die Ausbeute des in diesem Protokoll erzeugten Flavonoids, entsprechend der resultierenden Formel. Verwenden Sie eine Spritze, um jede Probe sequenziell durch einen 0,45-Mikrometer- und 0,22-Mikrometer-Filter zu verarbeiten. Laden Sie die Proben durch Saugdüse in ein HPLC-MS-System und trennen Sie die Proben bei 30 Grad Celsius mit einer C18-Säule.

Elute die Säule bei einem Milliliter pro Minute durch einen Gradienten von 10 bis 85 Volumen pro Prozent Acetyl Nitril in Wasser, und überwachen Sie die Absorption des Eluats von 200 bis 800 Nanometer. Führen Sie die LC-MS-Analyse im negativen Ionenmodus mit einem trocknenden Stickstoffstrom von 10 Litern pro Minute bei 300 Grad Celsius in einem Mantelgasstrom von sieben Litern pro Minute bei 250 Grad Celsius durch und sammeln Sie Daten mit einer eingebauten Software. Um Chromatographen mit einer Wellenlänge zu extrahieren, öffnen Sie das qualitative Analyseprogramm, und klicken Sie auf Datei, öffnen Sie die Datendatei.

Wählen Sie die zu analysierende Datei im Fenster "Geöffnete Datendatei" aus, und klicken Sie auf Öffnen, um die Datei zu öffnen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste im Chromatogramm-Ergebnisfenster und extrahieren Sie dann Chromatogramme in einem Popup-Menü. Klicken Sie in der Typenliste auf andere Chromatogramme.

Wählen Sie im Feld Detektorkombination DAD1 aus, und klicken Sie dann auf OKAY, um die HPLC-Ergebnisse im Chromatogrammergebnisfenster anzuzeigen. Klicken Sie auf das manuelle Integrationssymbol, das oben im Chromatogramm-Ergebnisfenster angedockt ist. Zeichnen Sie die Basislinie für die Spitze, die für die manuelle Integrationsanalyse mit der Maus erforderlich ist.

Klicken Sie auf Ansicht, Integrations-Peak-Liste, um die Ergebnisse anzuzeigen. Kopieren Sie die Ergebnisse der Spitzenbereiche nach Excel, und zeichnen Sie eine HPLC-basierte Standardkurve des authentischen Flavonoids gegen die entsprechenden Flavonoidkonzentrationen, und berechnen Sie dann die Ausbeute des in diesem Protokoll erzeugten Flavonoids gemäß der resultierenden Formel. Wiederholen Sie dann die gleichen Verfahren, um Chromatogramme mit einer Wellenlänge zu extrahieren, um die MS-Daten auf die genaue Masse der Flavonoidverbindungen zu analysieren.

Klicken Sie auf das Bereichsauswahlsymbol auf der Symbolleiste der Chromatogrammergebnisse. Wählen Sie den Höhepunkt des Interesses aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in den ausgewählten Bereich, und klicken Sie im Popup-Menü auf das MS-Spektrum extrahieren, um die Ergebnisse im Ergebnisfenster des MS-Spektrums anzuzeigen.

Um festzustellen, ob dieses In-vitro-System für die Umwandlung eines Flavanons in ein Flavonol verwendet werden kann, wurde NRN in das System aufgenommen. Auf einer Polyamid-TLC-Platte entstanden zwei neue Flecken. Ein Punkt zeigte eine Migrationsentfernung ähnlich der von DHK, und die anderen ähnlich der von KMF.

Weitere Analysen von HPLC und LC-MS zeigten, dass die neue Chemikalie eine Retentionszeit von 12 bzw. 20 Minuten bei einem quasi-molekularen IonenspitzenWert M über Z bei 287 und 285 aufwies, die mit denen von DHK und KMF identisch waren. Um festzustellen, ob das System für die Umwandlung anderer Flavanone in die entsprechenden Flavonole verwendet werden kann, wurde ERD in das System aufgenommen. Zwei neue Flecken auf einer Polyamid-TLC-Platte zeigten einen Migrationsabstand ähnlich dem von DHQ bzw. QRC.

HPLC- und LC-MS-Analysen zeigten, dass diese neuen Chemikalien eine Retentionszeit von 10 bzw. 16 Minuten und einen quasi-molekularen IonenspitzenWert M über Z bei 303 und 301 aufwiesen, der genau denen von DHQ und QRC entsprach. Bei der Vorbereitung des synthetischen Systems sollten Sie das Enzym zuletzt hinzufügen und das Eisensulfat vorletzter Hinzufügen. Ja, es bietet einen Leitfaden für die wirtschaftliche Produktion von anderen sekundären Metaboliten.