Name: DNA-Elektrophorese mit Thiazole Orange statt Interkalation Bromid oder Alternative Farbstoffe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Lernen Sie eine sichere DNA-Elektrophorese mit Thiazolorange statt Ethidiumbromid für die Molekularbiologie. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die schonende Visualisierung mit Blaulicht und erhöht die Erfolgsrate nachfolgender Experimente.

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Diese Arbeit wurde von Startup-Fonds zu TDG von Christopher Newport University unterstützt.

1. Vorbereitung des Gels
Hinweis: Für allgemeine Gel-Elektrophorese-Protokolle, siehe auch Baujahr Lee Et Al. 14.
<ol><li>Mischen Sie Agarose (~ 1 % w/V, Prozentsatz variiert werden, für bestimmte Größe Trennungen) im Puffer (ca. 70 mL für ein Mini-Gel (8 x 7 cm)). Puffer sind häufig TAE (Tris-Acetat-EDTA, 40 mM Tris, 20 mM Acetat, 1 mM EDTA, pH-Wert ca. 8,6) oder FSME (Tris-Borat-EDTA, 90 mM Tris, 90 mM Borat, 2 mM EDTA, pH-Wert ca. 8,3)).</li>
	<li>Hinzu kommt eine Endkonzentration von 1,3 μg/mL Thiazole orange.<ol>
<li>Lösen Sie Thiazole orange in DMSO zu einer 10.000 X Vorratslösung (13 mg/mL auf). Während nicht besonders lichtempfindlich speichern bis in die dunklen, wenn nicht in Gebrauch. Diese Lösung ist bei Raumtemperatur stabil ~ Monate; langfristiger Lagerung kann durch Einfrieren Aliquote (DMSO wird im standard Kühlschrank Einfrieren) erreicht werden. Achten Sie darauf, vollständig schmelzen und erneut eine gefrorene Lösung vor Gebrauch. Hinweis: Das Gel kann auch auch gebeizt mit TO nach Elektrophorese (siehe Punkt 2.6). Weile, hat ein verbessertes Sicherheitsprofil über Interkalation Bromid, standard Molekularbiologie Labor Sicherheits-Vorkehrungen sollte beibehalten werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikrowellen-die Mischung aus Agarose, Puffer- und Thiazole orange aufzulösen Agarose (ca. 60 s). Dieser Schritt ist gemeinhin als "schmelzen". Wirbel (5 s), Auflösung unterstützen, wenn nötig. Hinweis: Um auch nach der Mikrowelle auf Wunsch hinzugefügt werden können.</li>
	<li>Lassen Sie die Agarose-Lösung kurz vor dem Gießen in Gel Gießvorrichtung mit einem geeigneten Kamm abkühlen.</li>
	<li>Lassen Sie die Agarose-Lösung zu einem Gel zu festigen.</li>
</ol>(2) laden und Ausführen der gel
<ol><li>Legen Sie das Gel in der Elektrophorese-Apparatur, falls nicht bereits vorhanden.</li>
	<li>Fügen Sie laufenden Puffer (TAE oder FSME als oben) auf um die Oberfläche des Gels zu decken.</li>
	<li>Laden Sie DNA-Proben (üblicherweise 10 μL) mit einem Farbstoff beladen. Enthalten Sie eine DNA-Dimensionierung Leiter als Referenz.</li>
	<li>Befestigen Sie die Abdeckung und Elektroden (das Gel sollte in Richtung der roten Anode (positive) ausgeführt werden).</li>
	<li>Spannung anlegen (in der Regel ~ 100V für ein Mini-Gel, obwohl Größe des Gels erfordern eine veränderte Spannung, damit das Gel nicht beschädigt) bis laden Farbstoff eine angemessene Distanz zurückgelegt hat (ca. 4-7 cm für ein Mini-Gel, obwohl Abstand variieren je nach präzise Anwendung). Hinweis: Wie Interkalation Bromid und viele andere DNA-bindende Farbstoffe, Thiazole Orange ist positiv geladen. Infolgedessen werden diese Farbstoffe in die entgegengesetzte Richtung der electrophoresing DNA migriert. Für Proben, die das Gel für verbesserte Trennung weit heruntergekommen sind, wird schließlich der Farbstoff aus den kleineren DNA-Fragmenten, was schwache Färbung trennen. In diesen Fällen sollte das Gel wie in Schritt 2.6 befleckt werden. Diese Situation ist nicht eindeutig an, einer positiv geladenen, Farbstoff, der reversibel mit DNA interagiert wird dieses Verhalten (einschließlich Interkalation Bromid zu, und andere) aufweisen.</li>
	<li>Wenn nicht hinzugefügt wurde vor dem Gießen (Schritt 1.2) gel, Flecken durch das Gel in den Puffer mit Thiazole orange eintauchen.<ol>
<li>Bereiten Sie genügend Puffer (TAE oder FSME) mit 1,3 μg/mL Thiazole orange vollständig bedecken das Gel und das Gel mit sanften Agitation zu tränken, bis die Bänder voll sind (ca. 20 min) erkannt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Visualisierung von Thiazole orange Agarose-Gel (UV-Transilluminator)
<ol><li>Entfernen Sie das Gel aus der Elektrophorese-Apparatur und auf einem UV-Transilluminator. Achtung: UV-Licht ist schädlich für Haut und Augen. Achten Sie darauf, entsprechende Augen (Brille) und Gesichtsschutz (Gesichtsschutz) tragen. Hände sollten Handschuhe und lange Ärmel getragen werden sollte.</li>
	<li>Falls gewünscht, auf Wunsch ausgeschnittenen DNA-Bänder aus dem Gel (für weitere Verdauung oder Ligatur, zum Beispiel). Dem Gel, UV-Licht für möglichst kurze eine Zeitspanne wie möglich während Exzision aussetzen. UV-Licht (unabhängig von der DNA-Farbstoff) schädigt die DNA.</li>
	<li>Extrahieren Sie DNA aus dem Gel-Scheibe mit einem leicht zugänglich-Kit oder Protokoll15.</li>
</ol>(4) Visualisierung von Thiazole orange Agarose-Gel (Blaulicht-Transilluminator oder Taschenlampe)
<ol><li>Entfernen Sie das Gel aus der Elektrophorese-Apparatur und auf ein Blaulicht-Transilluminator (~ 470 nm maximale Emissionswellenlänge). Alternativ, eine blaue LED (~ 470 nm) Taschenlampe kann auf das Gel (entweder von oben oder unten) gerichtet sein. Hinweis: Während Empfindlichkeit Interkalation Bromid ein Blaulicht-Transilluminator mit niedriger ist, kann DNA befleckt mit Interkalation Bromid nachgewiesen werden mit diesem Blaulicht-Protokoll.</li>
	<li>Verwenden Sie einen gelbe Emission Filter (~ 560 nm Langpass-, Schutzbrillen oder Quadrat), um blaues Licht, ermöglicht die Visualisierung der Fluoreszenz zu filtern aus DNA: Thiazole orange-komplexe. Hinweis: Ohne den Bernstein Emission Filter ist es sehr schwer zu DNA-Bänder aufgrund der Intensität der Blaulicht-Anregungsquelle erkennen. Vorsicht: Obwohl Blaulicht die Fähigkeit fehlt, akut schädigen Gewebe (kontrastierende UV), verlängert Belastung durch intensives blaues Licht könnte schädlich für Augen und Bernstein Emission Schutzbrille oder Filter sollte verwendet werden.</li>
	<li>Falls gewünscht, Ausschneiden der gewünschten DNA-Bänder aus dem Gel für weitere Anwendungen. Hinweis: Da blaues Licht nicht DNA beschädigen, es ist nicht notwendig Bänder schnell Ausschneiden (z. B. bei Verwendung von UV-Anregung in Schritt 3.2).</li>
	<li>Extrahieren Sie DNA aus dem Gel-Scheibe mit einem leicht zugänglich-Kit oder Protokoll15.</li>
</ol>5. die Bilderfassung
<ol><li>Wählen Sie die entsprechenden Anregung und Emission Einstellungen in Gel-Imaging Apparatur. Die Anregung und Emission von Thiazole Orange (λEx, max = 510 nm (488 nm und 470 nm zeigen auch starke Erregung, neben der starken Erregung bei UV-Wellenlängen); λEm = 527 nm) sind nahezu identisch mit gemeinsamen blau-Licht – nachweisbar Werbespot Farbstoffe, so dass Instrumente Filtereinstellungen voreingestellt haben können, die verwendet werden können. Bemerkung: Einige Filter-Einstellungen für blau-Licht – nachweisbar kommerzielle Farbstoffe tatsächlich schädliche UV-Licht zur Anregung, also Vorsicht, wenn vor dem Ausschneiden Bands imaging. Verwenden Sie wenn möglich ein Blaulicht Anregungsquelle, wenn DNA-Bänder nach dem Imaging herausgeschnitten werden.</li>
	<li>Legen Sie in Ermangelung eines abbildenden Systems mit entsprechenden Filtern einen Bernstein-Filter zwischen der Kamera und die Gel/Blaulicht-Anregungsquelle.</li>
</ol>

<ol><li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li>
<li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella%2Fmicrosome+test%3A+assay+of+300+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li>
<li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H+and+13C+NMR+Assignments+for+the+Cyanine+Dyes+SYBR+Safe+and+Thiazole+Orange%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange.</a> The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).</li>
<li>Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaudet%2C+M+%22Molecular+Probes%2C+Inc%22">Molecular Probes, Inc</a>. , USA. WO/2005/0333342 (2005).</li>
<li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+induced+by+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li>
<li>Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+produced+by+ethidium+bromide+staining+and+exposure+to+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157(1988).</li>
<li>Hartman, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transillumination+can+profoundly+reduce+transformation+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies.</a> BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).</li>
<li>Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange%3A+a+new+dye+for+reticulocyte+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis.</a> Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).</li>
<li>Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interactions+Between+the+Fluorescent+Dye+Thiazole+Orange+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA.</a> Biopolymers. , 1-13 (1998).</li>
<li>Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Up+Probes%3A+Thiazole+Orange-Conjugated+Peptide+Nucleic+Acid+for+Detection+of+Target+Nucleic+Acid+in+Homogeneous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution.</a> Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).</li>
<li>Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Bisquinolinium%2FThiazole+Orange+Conjugates+for+Fluorescent+Sensing+of+G-Quadruplex+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).</li>
<li>Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+FIT-PNA+hybridization+probe+for+the+hybridization+state+specific+analysis+of+a+C+%E2%86%92+U+RNA+edit+via+FRET+in+a+binary+system%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system.</a> Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).</li>
<li>Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-up+properties+of+complexes+between+thiazole+orange-small+molecule+conjugates+and+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers.</a> Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).</li>
<li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Interkalation Bromid ist seit langem ein Standardwerkzeug in der molekularbiologischen Labor, trotz bekannten Toxizität. Es leidet auch unter UV-Licht, die die DNA schädigt, da es erkannt wird, erfordern. Thiazole Orange bietet eine kostengünstige Alternative zur Interkalation Bromid, sowie nützliche, aber teure kommerzielle Farbstoffe.
Die Vorteile von Thiazole Orange sind somit zwei-Fach. Thiazole Orange ist zunächst nur als Ersatz für die Interkalation Bromid einsetzbar. Gele können identis...

Der Zweck dieser Methode ist, DNA in Agarose-Gele mit Thiazole orange (bis) für Fluoreszenz-Detektion zu identifizieren. Wegen seiner niedrigen Kosten und günstige Sicherheitsprofil Thiazole Orange sehen möglicherweise besonderen Vorteil grundständige Lehre Labs und Forschungslabors Durchführung Molekularbiologie, insbesondere Verbindlichkeiten und Klonen.
Interkalation Bromid bleibt der am häufigsten verwendete Farbstoff für die Erkennung von DNA in Agarose-Gele. Dies ist vor allem, weil es sehr kostengünstig bezogen werden kann und erfordert nur Anregung mit UV-Licht zur Erkennung. Beide Interkalation Bromid und Thiazole Orange sind billig, mit niedrigen Erkennung Grenzen (1 bis 2 ng/Bahn)1. Es gibt zwei Hauptnachteile Interkalation Bromid, jedoch zu, denen auf Thiazole Orange verbessert.
Erstens Interkalation Bromid ist ein Mutagen2 mit Sonderbehandlung, Lieferung und Entsorgung Anforderungen, während Thiazole Orange weniger Mutagene (3 – 4 X weniger erbgutverändernd im Ames-Test)3,4 und in der Regel mit entsorgt werden allgemeine chemische Abfälle.
Zweitens erfordert die Interkalation Bromid UV-Licht zur Erkennung. Thiazole Orange kann ähnlich wie UV-Licht, falls gewünscht, aber auch mit blauem Licht erkannt werden. UV-Licht, hat während allgemein verwendet, ein paar markante Nachteile. Erstens ist es schädlich für menschliche Haut und Augen. Während UV-Licht sicher von ausgebildeten Fachleuten verwendet werden kann, Haut oder Auge Unfallschäden (funktionell ähnlich Sonnenbrand) vom Labor UV-Licht sind nicht ungewöhnlich, vor allem bei unerfahrenen Wissenschaftler. Zweitens ist UV-Licht äußerst schädlich für DNA-Proben5, die den Erfolg von nachgelagerten Experimente (z. B. Ligatur und Transformation)1,6,7reduziert. TO ermöglicht die Erkennung mit blauem Licht (λEx, max = 510 nm (488 nm und 470 nm zeigen auch starke Erregung)), die verursacht keine Schädigung der Haut oder DNA schädigen (obwohl kein intensives Licht möglicherweise noch schädlich für die Augen), stark verringern die Risiken für beide der Wissenschaftler und der Probe.
Ist nicht nur Fluoreszenzfarbstoff-Alternative zur Interkalation Bromid; sein Vorteil ist Kosten. In den 1980er Jahren als eine Retikulozytenzahl Fleck8entdeckt wurde, und hat in einer Reihe von DNA-basierten Fluoreszenz Experimente9,10,11,12,13Dienstprogramm gefunden. Es wird derzeit von verschiedenen Anbietern verkauft. Ist die Ausgangssubstanz von zusätzlicher, teurer, blau-Licht – nachweisbar kommerzielle Farbstoffe, und verhält sich ähnlich wie während der Elektrophorese, mit UV- oder blaues Licht für Erkennung1. Während andere Farbstoffe empfindlicher auf sehr geringen DNA-Konzentrationen als EtBr oder TO, für generische Elektrophorese Experimente sind, sind darüber hinaus solche Farbstoffe unerschwinglich teuer in vielen Kontexten.

<table><tbody><tr><td>2-log DNA-Leiter</td><td>New England Biolabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Genetische Analysequalität)</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>Blaulicht-Taschenlampe</td><td>WAYLLSHINE (Amazon)</td><td>WAYLLSHINE Skalierbare blaue LED</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP</td><td>Biorad</td><td>1708280</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>ethidium bromid</td><td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td>Zum Vergleich, nicht erforderlich für das Protokoll</td></tr><tr><td>Gel-Gerät (Owl Easy Cast)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Qiaquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager Viewing Glasses</td><td>Invitrogen</td><td>S37103</td><td>Notwendig für die Verwendung von Blaulicht-Taschenlampe.*</td></tr><tr><td>SafeImager 2.0 (Blaulicht-Transilluminator)</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td>Blaulicht-Taschenlampe kann als Alternative verwendet werden</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Zum Vergleich, nicht notwendig für Protokoll</td></tr><tr><td>TAE (Tris-Acetat-EDTA)</td><td>Corning</td><td>46-010-CM</td><td></td></tr><tr><td>Thiazol orange</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>390062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*Brille ist auch im Lieferumfang von Invitrogen G6600 enthalten</td></tr></tbody></table>

dna-elektrophorese mit thiazole orange statt interkalation bromid oder alternative farbstoffe

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA Gelelektrophorese mit Agarose ist ein gemeinsames Tool im molekularbiologischen Labor, Trennung von DNA-Fragmenten durch Größe. Nach der Trennung ist DNA durch Färbung sichtbar gemacht. Dieser Artikel veranschaulicht, Thiazole orange Fleck DNA zu nutzen. Thiazole Orange im Vergleich zu gemeinsamen Färbung Methoden, insofern er empfindlich, kostengünstig, leicht erregbaren mit UV- oder blaues Licht (zum Beispiel Schäden zu verhindern) und sicherer als Interkalation Bromid. Labs bereits ausgestattet, um DNA Elektrophorese Experimente mit Interkalation Bromid laufen können in der Regel Farbstoffe mit keine zusätzlichen Änderungen in bestehenden Protokolle, mit UV-Licht zur Erkennung. Blaulicht-Erkennung zu Probe vermeiden kann zusätzlich mit einem Blaulicht-Quelle und Emission Filter erreicht werden. Labs bereits für Blaulicht-Erkennung ausgestattet können einfach Farbstoffe mit keine zusätzlichen Änderungen in bestehenden Protokolle.

Thiazole Orange ermöglicht die Erkennung von DNA, ohne Verwendung von Interkalation Bromid und ohne Verwendung von DNA-schädigenden UV-Licht. Interkalation Bromid ist bekannt, mutagene, so vorteilhaft, aus dem Labor zu eliminieren sein kann. UV-Licht schädigt DNA und senkt Transformationseffizienz deutlich, während blaues Licht DNA nicht beschädigt wird. Nachweisgrenzen sind ähnlich zwischen Interkalation Bromid, Thiazole Orange und ein gemeinsames, blau-Licht – nachweisbar kommerzielle DNA-Farbstoff (<strong class="xfig...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Thiazole orange für den Nachweis von DNA in Gel-Elektrophorese Experimente verwenden. Die Verwendung von Thiazole Orange ermöglicht Beseitigung der Interkalation Bromid und Fluoreszenz-Detektion mit UV oder blaues Licht erreicht werden.

DNA-Elektrophorese mit Thiazole Orange statt Interkalation Bromid oder Alternative Farbstoffe

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Dieses Protokoll ist eine einfache und kostengünstige Alternative zur Verwendung von Ethidiumbromid zur DNA-Detektion während der Elektrophorese. Durch die Entfernung von Ethidiumbromid kann entweder UV-Licht oder blaues Licht zur Detektion verwendet werden. Blaues Licht ist nicht schädlich für die DNA, was die Erfolgsaussichten für nachgelagerte Experimente verbessert.Es ist wirklich einfach, dies auszuprobieren. Sie müssen nur das Ethidiumbromid in Ihren Gelen durch Thiazol-Orange ersetzen. Zu Beginn bereiten Sie 1%Mini-Gele vor, indem Sie etwa 0,7 Gramm Agarose in 70 Milliliter Tris-Acetat-EDTA oder Tris-Borate-Puffer mischen.Als nächstes lösen Sie Thiazol-Orange in DMSO auf, um eine 10, 000X-Lagerlösung herzustellen. Obwohl nicht besonders lichtempfindlich, speichern Thiazol Orange im Dunkeln, wenn nicht in Gebrauch. Zur Langzeitlagerung Aliquots der Thiazol-Orange-DMSO-Mischung herstellen und einfrieren.Dann thiazol orange zu einer Endkonzentration von 1,3 Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen, und Mikrowelle die Mischung aus Agarose Puffer und Thiazol Orange, um Agarose für etwa 60 Sekunden aufzulösen. Gießen Sie die Agarose-Mischung in ein Gelgussgerät, das einen geeigneten Kamm enthält, und lassen Sie die Agarose-Lösung zu einem Gel verfestigen. Um das Gel zu laden, legen Sie zuerst das Gel in die Elektrophorese-Apparatur, wenn nicht bereits vorhanden.Fügen Sie dann TAE- oder TBE-Laufpuffer hinzu, um die Oberfläche des Gels zu bedecken. Als nächstes, mit einem Ladefarbstoff, laden Sie 10 Mikroliter einer DNA-Probe. Fügen Sie eine DNA-Größenleiter als Referenz ein.Befestigen Sie die Abdeckung und die Elektroden und führen Sie das Mini-Gel bei 100 Volt aus, bis der Ladefarbstoff für ein Mini-Gel etwa vier bis sieben Zentimeter zurücklegt. Wenn Thiazol-Orange vor dem Gelguss nicht aufgetragen wurde, färben Sie das Gel, indem Sie es in den Puffer eintauchen, der Thiazol-Orange mit sanfter Rührung für etwa 20 Minuten enthält, oder bis die Bänder vollständig erkannt sind. Um das Gel mit einem UV-Transilluminator zu visualisieren, entfernen Sie das Gel aus dem Elektrophoresegerät und legen Sie es auf den UV-Transilluminator.Um das Gel mit einem Blaulichttransilluminator oder einer Taschenlampe zu visualisieren, legen Sie das Gel auf den blauen Lichttransilluminator oder richten Sie die blaue LED-Taschenlampe von oben oder unten an das Gel. Verwenden Sie einen Bernstein-Emissionsfilter, um das blaue Licht herauszufiltern, um die Fluoreszenz aus DNA-Thiazol-Orangenkomplexen zu veranagen und Farbstoffe zu schützen. Für die weitere Verdauung oder Ligation, schneiden Sie gewünschte DNA-Bänder aus dem Gel und fahren Sie mit einem leicht verfügbaren Kit oder Protokoll zu extrahieren.Wählen Sie die entsprechenden Anregungs- und Emissionseinstellungen im Gel-Imaging-Gerät aus. In Ermangelung eines Bildgebungssystems mit entsprechenden Filtern, legen Sie einen Bernsteinfilter zwischen die Kamera und das Gel Blaulicht-Anregungsquelle. Die Nachweisgrenzen sind ähnlich zwischen Ethidiumbromid, Thiazolorange und einem gemeinsamen blaulichtnachweisbaren kommerziellen DNA-Farbstoff, wobei die Nachweisgrenze für alle drei Farbstoffe ein bis zwei Nanogramm pro Spur in einem Mini-Gel beträgt.Thiazol orange-gefärbtes Agarose-Gel eines Restriktions-Digests ist nachweisbar, wenn es mit einem UV- oder Blaulichttransilluminator oder mit einer blaulichten Taschenlampe angeregt wird. Während Thiazol-Orange weniger gefährlich zu sein scheint als Ethidiumbromid, sollten standardmäßige persönliche Schutzausrüstungen wie Handschuhe und Schutzbrillen getragen werden.

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Biochemie

Ein Basis-Protokoll für die Trennung von DNA-Fragmenten unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese beschrieben.

Agarosegel-Elektrophorese für die Trennung von DNA-Fragmenten

Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt...

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

In diesem Video demonstrieren wir den elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassay zum Nachweis von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Infrarot-Fluoreszenz-markierten DNA-Sonden. Wenn das Protein an die DNA-Sonde bindet, bildet es einen großen Komplex, der langsam weiterwandert und als verschobene Bande auf dem Gel erscheint.

Elektrophoretischer Mobilitäts-Shift-Assay zum Nachweis von Transkriptionsfaktor-DNA-Komplexen

Wir beschreiben eine Multi-Target-chromogenen ganze-mount in situ Hybridisierung (MC-WISH) Verfahren in intakten Drosophila-Embryos eine gleichzeitige und spezifischen Nachweis von drei verschiedenen mRNA-Verteilungsmuster durch Kontrastfarbe Niederschläge.

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

Wir präsentieren einen strategischen Plan und ein Protokoll zur Identifizierung nicht-kodierender genetischer Varianten, die die DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors (TF) beeinflussen. Es wird ein detailliertes experimentelles Protokoll für die elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assay (EMSA) und den DNA-Affinitäts-Präzipitations-Assay (DAPA) der Genotyp-abhängigen TF-DNA-Bindung bereitgestellt.

Screening für Funktionelle nichtkodierenden genetischen Varianten Mit elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) und DNA-Affinitätspräzipitation Assay (DAPA)

Wir beschreiben ein Protokoll zum kolorimetrischen Nachweis von E. coli unter Verwendung eines modifizierten Lackmustests, der ein RNA-spaltendes DNAzym, Urease und magnetische Beads nutzt.

Kolorimetrischen Nachweis von Bakterien mit Lackmus-Test

Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll von fluoreszierenden elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (FEMSA) gereinigtes SOX-2-Proteine ​​zusammen mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden als Fallstudie eine wichtige biologische Frage zu bekämpfen.

Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Dieses Protokoll beschreibt die Charakterisierung der DNA-Polymerase Synthese von modifizierten DNA durch Beobachtung der Veränderungen an der Nah-Infrarot-Eindringmittel beschrifteten DNA mittels Gelelektrophorese und Gel-Bildgebung. Acrylamid Gele werden für hochauflösende Bildgebung der Trennung von kurzen Nukleinsäuren verwendet, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in Abhängigkeit von Größe zu migrieren.

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

Diese Methode erlaubt selektive Färbung und Quantifizierung der DNA in den Gelen durch Einweichen das Gel in einem SYBR Grün ich / Nitro blau Tetrazoliumsalz Lösung und setzen Sie sie dem Sonnenlicht oder eine blaue Lichtquelle. Dies erzeugt einen sichtbaren Niederschlag und erfordert fast keine Ausrüstung, wodurch es ideal für den mobilen Einsatz.

DNA-Färbung Methode basiert auf Formazan Niederschlag induziert durch blaues Licht aussetzen

Färbung der DNA-Moleküle für die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht eine Wissenschaftler um sie während eines Experiments zu sehen. In die hier vorgestellte Methode sind DNA-Moleküle vorab mit Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt und mit Methylierung und nicht-Methylierung sensibel Restriktionsenzymen verdaut.

Bestimmen, ob DNA mit einem Cyanin Farbstoff kann nicht verdaut werden mit Restriktionsenzymen gebeizt

Hier präsentieren wir eine empfindliche, schnelle und diskriminierende Post-Gel-Färbungsmethode, um RNAs mit RNA Mango Aptamern I, II, III oder IV abzubilden, wobei entweder native oder denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)-Gelverwendet werden. Nach dem Ausführen von Standard-PAGE-Gelen kann Mango-markierte RNA leicht mit TO1-Biotin gefärbt und dann mit allgemein verfügbaren Fluoreszenzlesern analysiert werden.

Fluoreszierende Visualisierung von Mango-markierter RNA in Polyacrylamidgelen über eine Poststaining-Methode

Lernen Sie eine sichere DNA-Elektrophorese mit Thiazolorange statt Ethidiumbromid für die Molekularbiologie. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die schonende Visualisierung mit Blaulicht und erhöht die Erfolgsrate nachfolgender Experimente.

DNA-Elektrophorese mit Thiazole Orange statt Interkalation Bromid oder Alternative Farbstoffe

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