DNA-Elektrophorese mit Thiazole Orange statt Interkalation Bromid oder Alternative Farbstoffe
31. März 2019
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Thiazole orange für den Nachweis von DNA in Gel-Elektrophorese Experimente verwenden. Die Verwendung von Thiazole Orange ermöglicht Beseitigung der Interkalation Bromid und Fluoreszenz-Detektion mit UV oder blaues Licht erreicht werden.
Dieses Protokoll ist eine einfache und kostengünstige Alternative zur Verwendung von Ethidiumbromid zur DNA-Detektion während der Elektrophorese. Durch die Entfernung von Ethidiumbromid kann entweder UV-Licht oder blaues Licht zur Detektion verwendet werden. Blaues Licht ist nicht schädlich für die DNA, was die Erfolgsaussichten für nachgelagerte Experimente verbessert.
Es ist wirklich einfach, dies auszuprobieren. Sie müssen nur das Ethidiumbromid in Ihren Gelen durch Thiazol-Orange ersetzen. Zu Beginn bereiten Sie 1%Mini-Gele vor, indem Sie etwa 0,7 Gramm Agarose in 70 Milliliter Tris-Acetat-EDTA oder Tris-Borate-Puffer mischen.
Als nächstes lösen Sie Thiazol-Orange in DMSO auf, um eine 10, 000X-Lagerlösung herzustellen. Obwohl nicht besonders lichtempfindlich, speichern Thiazol Orange im Dunkeln, wenn nicht in Gebrauch. Zur Langzeitlagerung Aliquots der Thiazol-Orange-DMSO-Mischung herstellen und einfrieren.
Dann thiazol orange zu einer Endkonzentration von 1,3 Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen, und Mikrowelle die Mischung aus Agarose Puffer und Thiazol Orange, um Agarose für etwa 60 Sekunden aufzulösen. Gießen Sie die Agarose-Mischung in ein Gelgussgerät, das einen geeigneten Kamm enthält, und lassen Sie die Agarose-Lösung zu einem Gel verfestigen. Um das Gel zu laden, legen Sie zuerst das Gel in die Elektrophorese-Apparatur, wenn nicht bereits vorhanden.
Fügen Sie dann TAE- oder TBE-Laufpuffer hinzu, um die Oberfläche des Gels zu bedecken. Als nächstes, mit einem Ladefarbstoff, laden Sie 10 Mikroliter einer DNA-Probe. Fügen Sie eine DNA-Größenleiter als Referenz ein.
Befestigen Sie die Abdeckung und die Elektroden und führen Sie das Mini-Gel bei 100 Volt aus, bis der Ladefarbstoff für ein Mini-Gel etwa vier bis sieben Zentimeter zurücklegt. Wenn Thiazol-Orange vor dem Gelguss nicht aufgetragen wurde, färben Sie das Gel, indem Sie es in den Puffer eintauchen, der Thiazol-Orange mit sanfter Rührung für etwa 20 Minuten enthält, oder bis die Bänder vollständig erkannt sind. Um das Gel mit einem UV-Transilluminator zu visualisieren, entfernen Sie das Gel aus dem Elektrophoresegerät und legen Sie es auf den UV-Transilluminator.
Um das Gel mit einem Blaulichttransilluminator oder einer Taschenlampe zu visualisieren, legen Sie das Gel auf den blauen Lichttransilluminator oder richten Sie die blaue LED-Taschenlampe von oben oder unten an das Gel. Verwenden Sie einen Bernstein-Emissionsfilter, um das blaue Licht herauszufiltern, um die Fluoreszenz aus DNA-Thiazol-Orangenkomplexen zu veranagen und Farbstoffe zu schützen. Für die weitere Verdauung oder Ligation, schneiden Sie gewünschte DNA-Bänder aus dem Gel und fahren Sie mit einem leicht verfügbaren Kit oder Protokoll zu extrahieren.
Wählen Sie die entsprechenden Anregungs- und Emissionseinstellungen im Gel-Imaging-Gerät aus. In Ermangelung eines Bildgebungssystems mit entsprechenden Filtern, legen Sie einen Bernsteinfilter zwischen die Kamera und das Gel Blaulicht-Anregungsquelle. Die Nachweisgrenzen sind ähnlich zwischen Ethidiumbromid, Thiazolorange und einem gemeinsamen blaulichtnachweisbaren kommerziellen DNA-Farbstoff, wobei die Nachweisgrenze für alle drei Farbstoffe ein bis zwei Nanogramm pro Spur in einem Mini-Gel beträgt.
Thiazol orange-gefärbtes Agarose-Gel eines Restriktions-Digests ist nachweisbar, wenn es mit einem UV- oder Blaulichttransilluminator oder mit einer blaulichten Taschenlampe angeregt wird. Während Thiazol-Orange weniger gefährlich zu sein scheint als Ethidiumbromid, sollten standardmäßige persönliche Schutzausrüstungen wie Handschuhe und Schutzbrillen getragen werden.
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Übersicht
Dieses Protokoll stellt eine einfache und kostengünstige Alternative zu Bromid für die DNA-Detektion in der Gelelektrophorese vor. Durch die Verwendung von Thiazolorange können Forscher entweder UV- oder blaues Licht für die Fluoreszenzdetektion nutzen, wodurch die Sicherheit der DNA während der Experimente erhöht wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biochemie
- Molekularbiologie
- Elektrophorese-Techniken
Hintergrund
- Äthidiumbromid ist ein gängiger DNA-Farbstoff, birgt jedoch Risiken für die DNA-Integrität.
- Thiazolorange bietet eine sicherere Alternative zur DNA-Visualisierung.
- Mittels schonendem Blaulicht kann eine Fluoreszenzdetektion erreicht werden.
- Diese Methode ist kostengünstig und einfach zu implementieren.
Zweck der Studie
- Eine Anleitung für die DNA-Detektion ohne Verwendung von Äthidiumbromid bereitstellen.
- Die Wirksamkeit von Thiazolorange in der Gelelektrophorese demonstrieren.
- Die Vorteile der Verwendung von blauem Licht zur DNA-Sichtbarmachung hervorheben.
Verwendete Methoden
- Herstellung von 1 % Mini-Gele mit Agarose und geeigneten Puffern.
- Ersetzung von Bromidethidium durch Thiazolorange in Gele.
- Fluoreszenznachweis mittels UV- oder Blaulicht.
- Beurteilung der DNA-Integrität nach Elektrophorese.
Hauptergebnisse
- Thiazolorange färbt DNA bei der Gelelektrophorese effektiv.
- Die Detektion kann sicher mit blauem Licht durchgeführt werden.
- Das Protokoll ist einfach und reproduzierbar.
- Nachfolgende Experimente weisen aufgrund reduzierter DNA-Schäden verbesserte Erfolgsraten auf.
Schlussfolgerungen
- Thiazolorange ist eine geeignete Alternative zu Äthidiumbromid.
- Die Verwendung von blauem Licht minimiert DNA-Schäden während der Detektion.
- Diese Methode erhöht die Zuverlässigkeit nachfolgender molekularbiologischer Experimente.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die DNA-Gelelektrophorese bleibt ein grundlegendes Verfahren bei der Target-Validierung und Assay-Entwicklung, wobei die Probenechtheit direkten Einfluss auf die Zuverlässigkeit nachgeschalteter Schritte hat. Der Ersatz von Ethidiumbromid durch Thiazolorange verringert das genotoxische Risiko, bewahrt jedoch die Nachweisempfindlichkeit und unterstützt sicherere Screening- und Lead-Identifizierungsprozesse. Dies ermöglicht es Biopharma-F&E-Teams, die DNA-Qualität für Klonierung, Sequenzierung oder funktionelle Assays zu erhalten, ohne Durchsatz oder Kosten-Effizienz zu beeinträchtigen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht das Testen von Hypothesen mittels DNA-Fragmentanalyse, ohne färbungsbedingte Artefakte einzuführen, die die Bestätigung des Zielmoleküls verfälschen könnten.
- Operativer Wert: Kompatibel mit bestehender UV- oder Blaulicht-Bildgebungstechnik und erfordert keine Neugestaltung des Protokolls für Labore, die derzeit Ethidiumbromid verwenden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die quantitative DNA-Größenbestimmung mit Nachweisgrenzen von 1–2 ng/Spur und unterstützt damit eine präzise Fragmentanalyse zur Beurteilung der Klonierungseffizienz oder zur Validierung von PCR-Produkten.
- Operativer Wert: Beseitigt den Umgang mit gefährlichem Abfall und speziellen Entsorgungsanforderungen, die mit Ethidiumbromid verbunden sind, und vereinfacht so die Einhaltung der Laborsicherheitsvorschriften.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die DNA-Integrität für nachgeschaltete Anwendungen wie Ligation, Transformation oder Transfektion und verbessert so die Erfolgsraten bei der Konstruktgenerierung für präklinische Modelle.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Visualisierung unter Blaulicht, reduziert UV-bedingte Probenschäden und erhöht die Reproduzierbarkeit über Wiederholungsexperimente hinweg.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode passt in den Entdeckungsbiologie-Workflow, bei dem die DNA-Analyse die Zielvalidierung, die Identifizierung von Leitstrukturen und die Entwicklung präklinischer Konstrukte unterstützt, insbesondere bei der Bewertung genetischer Modifikationen oder der Auswertung von Screening-Ergebnissen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die genaue Trennung und Größenbestimmung von DNA-Fragmenten und ermöglicht so eine zuverlässige Beurteilung von Genbearbeitungen, Plasmidintegrität oder PCR-Amplicons während der Zielbestätigung.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Banddarstellungen, die zur Bewertung der Bibliotheksvielfalt oder zur Bestätigung von Hits in nukleinsäurebasierten Assays unerlässlich sind.
- Analytik: Erzeugt vergleichbare Fluoreszenzintensitätsdaten über verschiedene Proben hinweg und ermöglicht somit einen konsistenten Vergleich von DNA-Menge oder -Reinheit unter unterschiedlichen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Erhält die DNA-Funktionalität für den Einsatz in der Transfektion von Säugerzellen oder der Herstellung viraler Vektoren, was entscheidend ist, um Kandidaten in die präklinische Testphase zu überführen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt einen direkten Reagentenersatz dar, der ohne erneute Qualifizierung der Elektrophorese-Hardware oder -Software einheitlich in verschiedenen Teams und Standorten standardisiert werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten, indem dye-induzierte DNA-Schäden minimiert werden, und erhöht so das Vertrauen in molekularbiologische Daten, die für die Zielstrukturbeurteilung verwendet werden.
- Operativer Wert: Verwendet kostengünstiges, nicht-gefährliches Thiazolorange mit einfacher Lagerung (aliquotiert, gefrorener DMSO-Stammlösung), wodurch die Reagenzkosten und Sicherheitsaufwände reduziert werden.
- Strategischer Wert: Verbessert die Zuverlässigkeit von Go/No-Go-Entscheidungen, indem die Probenechtheit für nachgeschaltete Sequenzierungen, Klonierungen oder funktionelle Assays erhalten bleibt.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem sichergestellt wird, dass die Qualität datenbasierter DNA-Analysen die Kriterien für die Optimierung von Leitstrukturen und die Auswahl präklinischer Kandidaten erfüllt.
Durchführungsaspekte
- Kenntnisse in Molekularbiologie im Bereich der Agarosegelelektrophorese und Gelelektrophorese.
- Standard-Elektrophoreseapparatur mit UV- oder Blaulichttransilluminator und Amber-Emissionsfilter zur Detektion.
- Konsistentes Auftauen und Mischen gefrorener Thiazolorange-DMSO-Aliquote, um eine gleichmäßige Färbung sicherzustellen.
- Überprüfung der Färbeffizienz anhand verschiedener Modellsysteme (z. B. Plasmid-, genomische DNA), wenn neue Probenarten verwendet werden.
- Einschränkung: Erfordert eine Optimierung der Färbezeit (20 min), falls die Färbung nach der Elektrophorese durchgeführt wird, was im Vergleich zu vorgefertigten Gele einen zusätzlichen Arbeitsschritt darstellt.
