In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

Die Induktion von Sodivderivaten aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) ist ein entscheidender Schritt für die Verwendung pluripotenter Stammzellen für regenerative Therapie- oder Krankheitsforschungsanwendungen. Diese Technik kann verwendet werden, um menschliche iPS-Zellen in sos Derivate wie Myotome, Dermtome, Sklerotom und Syndetomzellen unter chemisch definierten Bedingungen zu differenzieren. Mit iPSC von einem Patienten mit einer hartnäckigen Muskel-Skelett-Störung festgestellt, kann diese Methode verwendet werden, um den Phänotyp der Krankheit zu modellieren und für die Prüfung der neuen Medikament Therapien.

Diese Methode kann auch angewendet werden, um unser Verständnis der Biologie und der Mechanismen, die der Entwicklung des paraxialen Mesoderms während der menschlichen Embryogenese zugrunde liegen, zu fördern. Vier Tage vor Beginn der präsomitischen Mesoderm-Induktion sollte eine 10-Zentimeter-Schale mit vier Millilitern extrazellulärer Matrixlösung für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius beschichtet werden. Ersetzen Sie am nächsten Morgen die extrazelluläre Matrixlösung durch acht Milliliter feederfreies Zellkulturmedium.

Um mit der feederfreien Kultivierung zu beginnen, waschen Sie die menschliche iPSC-Kultur mit PBS und fügen Sie dem Kulturgericht einen Milliliter CTK-Lösung hinzu. Wenn die Zellen beginnen, sich vom Tellerboden zu lösen, waschen Sie die Kultur zweimal mit frischen PBS, um alle SNL-Feederzellen vollständig zu entfernen, bevor Sie dem Gericht einen Milliliter feederfreies Zellkulturmedium hinzufügen. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Stammzellen manuell zu lösen und die Zellen in eine konische Röhre mit 15 Millilitern zu übertragen.

Die Zelllösung dreimal mit einer 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze vorsichtig pipetten und die Zellen auf die extrazelluläre Matrix-beschichtete Kulturschale übertragen. Dann kehren Sie die Zellen für drei Tage in den Zellkultur-Inkubator zurück. Am Ende der Inkubation das feederfreie Zellkulturmedium durch acht Milliliter präsodisches Mesoderm-Induktionsmedium ersetzen und für die nächsten vier Tage eine prädasische Mesodermdifferenzierung im Zellkultur-Inkubator initiieren und das Medium am dritten Tag verändern.

Am Ende der Inkubation isolieren Sie das deltaartige Protein 1 positive Zellen durch Durchflusszytometrie und sammeln die sortierten Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter soshMesoderm-Induktionsmedium zum Zählen aus und säen Sie ein mal 10 bis fünf Zellen in jeden Brunnen einer extrazellulären Matrix-Lösungs-beschichteten 12-Well-Platte, die einen Milliliter sosormisches Induktionsmedium enthält, ergänzt mit 10 Mikromolaren der Rhokinase, oder ROCK-Hemmer Y-27632. Dann kehren Sie die Zellen für vier weitere Tage in den Zellkultur-Inkubator zurück und ändern Sie das Medium, das den Inhibitor an den Tagen eins und drei der Kultur nicht enthält.

Zur Syndetomdifferenzierung von Sklerotomzellen die Sklerotomzellen mit PBS waschen, bevor sie die Zellen mit 0,2 Millilitern Zelldissoziationsreagenz pro Brunnen ablösen. Nach drei Minuten bei Raumtemperatur 0,8 Milliliter chemisch definiertes Basalmedium zu jedem Brunnen hinzufügen und die Zellen mit einem Zellschaber lösen. Übertragen Sie die Zellen zur Zentrifugierung in ein 15-Milliliter-Konikonröhrchen und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Syndetom-Induktionsmedium eins für das Zählen wieder auf.

Samen Sie fünfmal 10 bis zu den vierten Zellen in jeden Brunnen einer extrazellulären Matrix-Lösung-beschichteten 24-Well-Platte mit einem Milliliter Syndetom-Induktionsmedium eins, und geben Sie die Platte für drei Tage in den Zellkultur-Inkubator zurück. Ersetzen Sie am dritten Tag der Syndetome-Induktion das Medium durch das Syndetom-Induktionsmedium zwei, und geben Sie die Platte für 18 Tage an den Inkubator zurück, wodurch das Medium alle drei Tage wechselt. Nach der präsomitischen Mesoderm-Differenzierung sind über 85% der Zellen positiv für deltaartiges Protein 1, ein Marker des präsomitischen Mesoderms, aber negativ für PAX3, ein Marker des sosischen Mesoderms.

Diese Population wird nach vier Tagen der sosischen Mesoderm-Induktion zu PAX3-positiven Sosodermzellen. Weiterhin sammelt sich die Färbung von Cadherin-11, einem Marker des epithelialisierten sosoderms, nur an den Zell-zu-Zell-Kreuzungen an, nachdem CHIR99021 hinzugekommen ist. Die Differenzierung zu Dermomyotom, Myotom, Dermtom, Sklerotom und Syndetom kann durch Immunzytochemie und PAX3-Fluoreszenz beurteilt werden.

Ähnlich wie bei humanen dermalen Fibroblasten produzieren iPSC-abgeleitete Dermtomzellen Kollagen und Hyaluronsäure, wie sie von ELISA bewertet werden. Um die vergleichbare Reaktivität von humanem iPSC-abgeleitetem Syndetom und menschlichen Erwachsenentenozyten zu demonstrieren, kann ein mechanischer Stretchstimulationstest durchgeführt werden. Bestätigen Sie vor dem iPSC-Passaging, dass die Kulturkonfluenz zwischen 70 und 80 % und die geteilten Zellen im Verhältnis eins zu zwei bis eins zu vier liegen.

Diese Passaging ist entscheidend für eine erfolgreiche iPSCs-Differenzierung. Für zukünftige zellbasierte Therapien mit dieser Methode ist es notwendig, einen neuartigen keimfreien Zustand zu etablieren, der keine Komponenten enthält, die von nichtmenschlichen Tieren stammen.