Name: Ein onkogenes Hepatozyten-induziertes orthotopisches Mausmodell von hepatozellulärem Krebs, der bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose entsteht (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines orthotopen hepatozellulären Karzinom-Modells bei männlichen C57BL/6-Mäusen mittels intrasplenischer Injektion und Leberfibrose-Technik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung tumorinduzierter Immunotoleranz.

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Diese Arbeit wird unterstützt von NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O'Carroll, PI) und NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O'Carroll).

HINWEIS: Das gesamte Verfahren einschließlich tierischer Probanden wurde vom IACUC an der University of Missouri genehmigt. Alle Mäuse wurden nach den Kriterien des "Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren" human gepflegt. Das folgende Verfahren zur Zellisolierung und -impfung sollte in einer Kapuze durchgeführt werden. Alle Darsteller sollten die standardmäßige persönliche Schutzausrüstung für den Umgang mit Mäusen und Gewebe tragen.
1. Induktion von Leberfibrose und Zirrhose mit IP-Injektion von Kohlenstofftetrachlorid (CCl4)
HINWEIS: Siehe Abbildung 1. (CCl4 ist ein hochgefährliches Reagenz, es sollte sorgfältig und mit chemikalienbeständigen Handschuhen behandelt werden)
<ol><li>Erhalten Sie männliche C57BL/6J-Mäuse, die sechs bis acht Wochen alt sind (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>10% CCl4 (v/v) Lösung in Maisöl in einem Zentrifugenrohr vorbereiten. Bestimmen Sie das Gesamtvolumen basierend auf der Anzahl der zu injizierenden Mäuse (siehe Schritt 1.6).</li>
	<li>Verwenden Sie die geeignete Mäusehandhabungstechnik, um eine Maus für die Injektion auszuwählen.</li>
	<li>Halten Sie die Maus mit ihrer rückenden Seite (Bauch) manuell zurück.</li>
	<li>Reinigen Sie die Injektionsstelle an der Bauchwand der Maus, indem Sie mit 70% Alkohol schrubben.</li>
	<li>Injizieren Sie männliche C57BL/6J-Mäuse mit 160 l 10% CCl4-Lösung durch intraperitoneale (IP) Injektion mit einer 25-Spur-Einwegnadel.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Nadel nur durch die Bauchwand (ca. 4-5 mm) mit Abschrägung nach oben und leicht abgewinkelt bei 15-20 Grad eindringt.</li>
	<li>Injizieren Sie Mäuse zweimal pro Woche für insgesamt vier Wochen - jede Maus erhält insgesamt acht Injektionen. HINWEIS: Zwei Wochen nach der letzten Injektion sind behandelte Mäuse bereit für die ISPL-Impfung onkogener Hepatozyten von MTD2-Mäusen.</li>
</ol>2. Isolierung von Tag-transgenen Hepatozyten von MtD2-Mäusen der Linie
HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Lösungsrezepte.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>10x Ausgewogene Salzlösung von Earle ohne Ca oder Mg (EBSS ohne Ca oder Mg)</td>
			<td>4 g KCl 68 g NaCl 1.4 g NaH2PO4 H2o 10 g Dextrose Wasser zu 1 Liter hinzufügen, pH bis 4.32 Durchpassern des Filters</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lösung 1</td>
			<td>20 ml 10x EBSS ohne Ca oder Mg 44 g NaHCO3 1,33 ml 1,5 Mio. Hepes 10 ml von 10 ml EGTA Wasser zu 200 ml hinzufügen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lösung 2</td>
			<td>100 ml 10x EBSS 2,2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M Hepes Wasser zu 1 Liter hinzufügen</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,75% Kollagennaselösung</td>
			<td>15 mg Kollagenase Typ 1 20 ml Lösung 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Komplettes Medium</td>
			<td>2 RPMI 50 ml FBS 5 mL 100x Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Lösungsrezepte.
<ol><li>Besorgen Sie sich die Linie MTD2-Mäuse38, um als Quelle onkogener Hepatozyten zu dienen.</li>
	<li>Anästhetisieren Sie 5 Wochen alte MTD2-Mäuse mit 2,5% Isofluran. HINWEIS: Die richtige Anästhesisierung wird durch die Toe Pinch-Methode überprüft. Kurz gesagt, mit zwei Fingern, geben Sie der Maus Zehen / Fuß eine gute Quetschung. Wenn es keine Entzugsreaktion gibt, wird das Tier tief genug beurteilt, um mit der Operation zu beginnen.</li>
	<li>Wenn sie angemessen sediert sind, platzieren Sie Mäuse in eine Supine-Position und fixieren Sie die Extremitäten mit Klebeband, um eine ausreichende Exposition der Bauchoberfläche zu gewährleisten.</li>
	<li>Führen Sie einen Mittellinien-Laparotomie-Einschnitt mit einer Schere entlang der Länge der Linea alba groß genug, um eine ausreichende Exposition der Leber zu bieten.</li>
	<li>Verdrängen Sie den Darm nach links, um eine bessere Exposition der Leber und Portal Triade zu bieten.</li>
	<li>Sezieren Sie über der Leber, um die minderwertige Vena cava (IVC) zu belichten.</li>
	<li>Ligate die IVC über der Leber mit einer Arterienklemme.</li>
	<li>Zurück zur unteren Grenze der Leber, verwenden Sie eine Schmetterlingsnadel (siehe Materialien), um IV Zugang zur Portalvene zu erhalten. Fix Katheter von Hand.</li>
	<li>Sukzessive durchdringen Sie die Mausleber mit einer Injektionsspritze bei 8,9 ml/min mit 15 ml Lösung 1, 15 ml 0,75% Kollagennaselösung 2 und 15 ml Lösung 2 über den Katheter.</li>
	<li>Ernten Sie die durchnässte Leber, indem Sie die Tumormasse von MTD2-Mäusen in einem 50 ml konischen Rohr mit 10-15 ml PBS schneiden und einnehmen.</li>
	<li>ENTFERNEN Sie PBS und waschen Sie eine zusätzliche Zeit mit PBS; zentrifugieren Sie bei diesem Schritt nicht.</li>
	<li>Schneiden Sie die Leber in kleinere Stücke mit der Schere und dann wieder mit PBS 2x waschen, um restliches Blut zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 5 ml komplettes RPMI-Medium in das konische Rohr und kontinuierlich Hacken der Leber mit schere zu kleinen Stücken (<3 mm)-Gewebe sollte glatt durch eine 5 ml Pipette gehen.</li>
	<li>Fügen Sie ein vollständiges RPMI zu einem Endvolumen von 30 ml hinzu und suspendieren Sie die Leber mit einer 5 ml Pipette.</li>
	<li>Filtern Sie die Mischlösung mit einem 70-mm-Sieb in ein 50 ml konisches Rohr.</li>
	<li>Waschen Sie das Sieb mehrmals mit komplettem RPMI und stellen Sie das Endvolumen auf 50 ml ein, indem Sie zusätzliches RPMI-Medium hinzufügen.</li>
	<li>Drehen Sie die Suspension schnell durch Zentrifuge auf maximal 500 U/min; sobald die Geschwindigkeit auf 50 x gbeschleunigt wird, sollte die Zentrifuge gestoppt werden.</li>
	<li>Dekantieren Sie den Überstand und hängen Pellets in 20 ml PBS.</li>
	<li>Zählen Sie Zellen mit Trypan-Blauausschluss und einem Hämozytometer, und passen Sie dann die Zellkonzentration für die folgende Zellimpfung auf 2,5 x 106/ml an. HINWEIS: Die erwartete Ausbeute von 5 Gramm Tumorgewebe beträgt 80 Millionen Hepatozyten mit Lebensfähigkeit >95%.</li>
</ol>3. Impfung der Hepatozyten von MTD2-Mäusen in die Leber von wildlebenden Typ C57BL/6J-Mäusen durch ISPL-Injektion
<ol><li>Die aseptische Technik sollte in allen Verfahren</li>
	<li>Anästhetisieren Siedie CCl 4-behandelten männlichen C57BL/6J-Mäuse mit 2,5% Isofluran, die Mäuse sollten mit Augenschmiere behandelt werden, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.</li>
	<li>Bereiten Sie Spritzen mit 200 L Hepatozyten zur Injektion vor.</li>
	<li>Wenn ausreichend sediert, positionieren Sie Mäuse mit der linken Seite nach oben.</li>
	<li>Rasieren Sie die gesamte linke Flanke der Mäuse, dann schrubben Sie die Fläche, abwechselnd zwischen 70% Alkohol und Betadin dreimal.</li>
	<li>5 mg/kg Carprofen subkutaneouly vor dem chirurgischen Schnitt verabreichen.</li>
	<li>Machen Sie einen 1 cm Schnitt auf der linken Flanke parallel zur13. Rippe vom dorsalen Extrembeginnen direkt unterhalb des Wirbelsäulenmuskels.</li>
	<li>Identifizieren Sie die Milz, und exemiten Sie sie dann mit stumpfspitzen Zangen.</li>
	<li>Beschneiden Sie die Milz mit zwei mittelgroßen Titanclips. Platzieren Sie beide Clips zwischen der Milzarterie und der Vene, lassen Sie Raum zwischen den Clips, um sie später nach der Impfung zu schneiden. HINWEIS: Das Ziel ist es, den unteren Pol der Milz zu isolieren, um das Risiko der Aussaat zu reduzieren.</li>
	<li>Mit einer 27 G-Nadel in die untere Milz der Milz injizieren.</li>
	<li>Schneiden Sie den unteren Zweig des Pedikles (untere Splenic-Polgefäße) mit einem mittelgroßen Clip ab.</li>
	<li>Schneiden Sie die Milz zwischen den beiden zunächst platzierten Clips.</li>
	<li>Entfernen Sie den unteren Pol der Milz, die direkt mit Tumorzellen injiziert wurde.</li>
	<li>Verwenden Sie 3-0 Polyglactin 910 unterbrochenes Nähen, um die innere Muskelschicht zu schließen.</li>
	<li>Verwenden Sie sterilisierte Stahl-Wundclips, um die äußere Hautschicht zu schließen. HINWEIS: Stahlclips werden bevorzugt über Nähten, um zu vermeiden, dass Tiere Nähte auskauen und eine klaffende Wunde hinterlassen.</li>
	<li>5 mg/kg Carprofen subkutan nach der Naht verabreichen.</li>
	<li>Legen Sie alle erholenden Tiere auf ein temperaturgeregeltes Heizkissen und überwachen Sie genau, bis sie vollständig von der Anästhesie genesen sind.</li>
	<li>Geben Sie Mäusen nach der Operation freien Zugang zu Wasser. Wenn die Maus während der Operation dehydriert wird, verabreichen Sie subkutane Flüssigkeiten (<1 ml).</li>
	<li>Entfernen Sie Hautclips nach 7-10 Tagen nach der Operation.</li>
</ol>

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<li>Held, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+antigen+expression+and+tumorigenesis+in+transgenic+mice+containing+a+mouse+major+urinary+protein%2FSV40+T+antigen+hybrid+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene.</a> EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).</li>
<li>Hanahan, D., Weinber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
</ol>

Es gibt keine zu deklarieren.

Mit diesem Protokoll haben wir ein zuverlässiges und reproduzierbares murines Modell von HCC etabliert, das die menschliche HCC-Initiierung und Progression imitiert. Klinisch, viele Risikofaktoren sukzessive induzieren Leberschäden, Leberfibrose, Zirrhose und die endk.-Phase von HCC. In unserem Protokoll wird die IP-Injektion von CCl4 verwendet, um zuerst Leberfibrose bei Wildtypmäusen zu produzieren, was es den nachfolgenden onkogenen Hepatozyten ermöglicht, die Tumoren bei der Einstellung von Leberfibrose zu...

Hepatozellulärer Krebs (HCC) ist die am schnellsten zunehmende Krebsart in den Vereinigten Staaten (US)1,2,3. Jedes Jahr werden ca. 850.000 neue Fälle diagnostiziert4,5 und 700.000 Patienten sterben an dieser tödlichen Krankheit6,7,8,9,10 und ist damit weltweit die zweithäufigste Todesursache im Zusammenhang mit Krebs. Die Verwaltung von HCC umfasst chirurgische Resektion, Transplantation, Ablation, Chemoembolisierung oder systemische Therapien, wie Sorafenib11. Früherkennung und Management mit chirurgischer Resektion oder Transplantation haben den höchsten Gesamtüberlebensvorteil4. Leider, die Mehrheit der Patienten in einem späteren Stadium anwesend und erfordern Management mit Ablation, Chemoembolisierung oder Sorafenib12. Sorafenib, ein Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitor (RTKI), wurde von der Food and Drug Administration im Jahr 2008 als einzige systemische medikamentöse Therapie zur Behandlung von nicht resezierbaren HCC zugelassen. Obwohl das Medikament nur eine bescheidene Erhöhung des Gesamtüberlebens bietet, von 7,9 auf 10,7 Monate13, es bot eine neue therapeutische Strategie, die verwendet werden könnte, um HCC zu verwalten.
Die Manipulation des Immunsystems zur Beseitigung etablierter Krebsarten ist ein schnell wachsendes Feld in der Krebsforschung14. Immun-Checkpoint-Studien haben erheblich fortgeschrittene immuntherapeutische Arzneimittelentwicklung in der Krebsbehandlung15,16. Die FDA genehmigte die Verwendung von Antikörpern (Abs) gegen zytotoxisches T-Lymphozyten-Antigen 4 (CTLA-4), programmiertes Zelltodprotein 1 (PD-1) und seinen Liganden PD-L1 zur Behandlung von Melanom, Lungenkrebs, Kopf- und Nackenkrebs und Blasenkrebs17, 18 , 19 , 20. Klinische Studien zur Monotherapie oder Kombinationstherapie mit einem oder mehreren Antikörpern gegen PD-1, PD-L1 oder CTLA-4 zur Behandlung fortgeschrittener HCC sind im Gange21,22,23und einige Studien haben positive Ergebnisse gezeigt. Im Jahr 2017 erteilte die FDA eine beschleunigte Zulassung für Anti-PD-1-Antikörper zur Behandlung von HCC-Patienten, die gegen Sorafenib resistenzen, aber die Gesamtansprechrate dieser Therapie beträgt nur 14,3%. Andere Strategien wurden zu diesem Zeitpunkt nicht in die klinische Praxis übersetzt24,25. Überwindung der tumorinduzierten tiefen Immuntoleranz zur Verbesserung der Immun-Checkpoint-Therapie26; Vorhersage der Wirksamkeit der Immun-Checkpoint-Therapie; Immunbedingte Nebenwirkungen zu verhindern; Optimierung der Verabreichung S-Route, Dosierung, und Häufigkeit; und die Suche nach effektiven Kombinationen der Therapien27,28,29 bleiben alle extrem herausfordernde Aufgaben.
Es gibt mehrere konventionelle Ansätze, die verwendet werden, um HCC in Mausmodellen zu induzieren und werden in Abhängigkeit von der speziellen Forschungsfrage des Forschersverwendet 30. Chemisch induzierte HCC-Mausmodelle mit genotoxischen Verbindungen imitieren verletzungsinduzierte Malignität. Xenograft-Modelle durch ektopische oder orthotopische Implantation von HCC-Zelllinien eignen sich für das Arzneimittelscreening. Eine Reihe von genetisch veränderten Mäusen wurden entwickelt, um die Pathophysiologie von HCC zu untersuchen. Transgene Mäuse, die virale Gene, Onkogene und/oder Wachstumsfaktoren exdrücken, ermöglichen die Identifizierung von Wegen, die an der Hepatocarcinogenese beteiligt sind. Aufgrund inhärenter Einschränkungen fassen diese Modelle nicht die typischen Immuneigenschaften des menschlichen HCC zusammen, was die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und die Entwicklung innovativer immuntherapeutischer Strategien erheblich behindert hat14 ,15. Kürzlich haben wir ein klinisch relevantes murines Modell entwickelt. Dieses neuartige Modell imitiert nicht nur die Menschliche HCC-Initiierung und Progression, sondern spiegelt auch die meisten typischen Merkmale menschlicher Krankheiten wider, einschließlich Immunfunktionsstörungen. Wir haben seine biologischen und immunologischen Eigenschaften charakterisiert. Unter Der Nutzung dieses neuartigen Modells haben wir verschiedene immuntherapeutische Strategien zur Behandlung von HCC31,32,33,34,35,36, 37. Diese einzigartige Plattform ermöglicht es uns, Mechanismen der tumorinduzierten Immunverträglichkeit zu untersuchen und proof-of-Concept-Therapiestrategien für HCC für eine eventuelle klinische Translation zu entwickeln.

<table><tbody><tr><td>Anästhesiegerät</td><td>VETEQUIP</td><td>IMPAC6</td><td>Anästhesiegerät für die Chirurgie</td></tr><tr><td>Schmetterlingsnadel</td><td>BD</td><td>8122963</td><td>Nadel für die Leberperfusion</td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäuse</td><td>Jackson Lab</td><td>000664&nbsp;</td><td>Mäuse, die in Prototol verwendet werden</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>CRESCENT CHEMICAL</td><td>20402</td><td>Carprofen zur Schmerzlinderung</td></tr><tr><td>Zellsieb&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>REF 431751</td><td>Cell Sieb, 70&micro; m, für die Isolierung von Hepatozyten</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-30R</td><td>Zentrifuge für die Zellisolierung</td></tr><tr><td>Clips&nbsp;</td><td>Teleflex Medical</td><td>REF 523700</td><td>Titan-Clips für Milzmikroskop</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Primovert&nbsp;</td><td>Mikroskop für die Zellbeobachtung</td></tr><tr><td>Mtd2 Mäuse</td><td>N/A</td><td></td><td>Geschenk von Dr. William A Gehalten am Roswell Park Cancer Institute im Jahr 2002, aufbewahrt in unserem Labor</td></tr><tr><td>Nadel</td><td>BD</td><td>REF 305109</td><td>BD precisionglide Nadel, 27G x 1/2 (0,4 mm x 13 mm)</td></tr><tr><td>Naht</td><td>ETHICON</td><td>J303H</td><td>beschichtetes VICRYL Nahtmaterial</td></tr><tr><td>SV40 T Ag Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab16879</td><td>anti-SV40 T-Antigen Antikörper für IHC</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>BD</td><td>REF 309626</td><td>1 mL TB-Spritze für die Zellinjektion</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>SIGMA</td><td>T 8154</td><td>Trypanblau Lösung für den Zellviabilitätstest</td></tr><tr><td>Wundclips</td><td>Reflex</td><td>reflex9, Art.-Nr. 201-1000</td><td>Edelstahl-Wickelclips für den Wundverschluss</td></tr></tbody></table>

ein onkogenes hepatozyten-induziertes orthotopisches mausmodell von hepatozellulärem krebs, der bei der einstellung von leberentzündungen und fibrose entsteht

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

Das Fehlen eines klinisch relevanten Tiermodells, das sich mit den typischen Immunmerkmalen von hepatozellulärem Krebs (HCC) befasst, hat die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und die Entwicklung innovativer immuntherapeutischer Strategien erheblich behindert. Um ein ideales Tiermodell zu entwickeln, das menschliche HCC rekapituliert, erhalten immunkompetente männliche C57BL/6J-Mäuse zunächst eine Tetrachlorsäure-Injektion (CCl4), um Leberfibrose zu induzieren, und erhalten dann histologisch-normale onkogene Hepatozyten von jungen SV40 T Antigen (TAg)-transgene Mäuse (MTD2) durch intrasplenische (ISPL) Inokulation. Androgen erzeugt in Empfänger männlichen Mäusen in der Pubertät initiiert TAg-Expression unter Kontrolle eines Leber-spezifischen Promotor. Dadurch werden die übertragenen Hepatozyten zu Krebszellen und bilden Tumormassen bei der Einstellung von Leberfibrose/Zirrhose. Dieses neuartige Modell imitiert die Initiierung und Progression des menschlichen HCC im Kontext von Leberfibrose/Zirrhose und spiegelt die typischsten Merkmale des menschlichen HCC einschließlich Immunfunktionsstörungen wider.

Onkogene Hepatozyten, die von TAg-transgenen Mäusen isoliert wurden (Abbildung 2), wurden in der Leber von Wildtypmäusen durch intra-splenische Injektion ausgesät (Abbildung 3). Die transplantierten Hepatozyten wuchsen erfolgreich und zuverlässig orthotopische HCC-Tumoren (Abbildung 4) mit tumorspezifischem Antigen SV40 TAg (Abbildung 5) bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose ( Abbildung1).
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Hier beschreiben wir die Entwicklung eines klinisch relevanten murinen Modells von Leberkrebs, das die typischen Immunmerkmale von hepatozellulärem Krebs (HCC) rekapituliert.

Ein onkogenes Hepatozyten-induziertes orthotopisches Mausmodell von hepatozellulärem Krebs, der bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose entsteht

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

Mit nur einem Modell, um ein hepatozelluläres Krebs-Massenmodell zu entwickeln könnte Menschen helfen, ihre tumor-induzierte Immunverträglichkeit und spezifische Behandlung-induzierte, alle Tumor-Immunreaktionen zu klären. Der orthotopische Tumor, der sich mit der Leberfibrose-Technik entwickelt, imitiert die klinischen Merkmale von menschlichem Leberkrebs. Diese Methode könnte ein nützliches Werkzeug in hepatozellululären Krebs immunologischen Studie.Die visuelle Demonstration dieser Methode kann die technisch anspruchsvolleren Schritte, wie z. B. die intrasplenische Injektion, veranschaulichen, die für eine erfolgreiche Ausführung dieses Protokolls unerlässlich sind. Als nächstes, manuell zurückhalten ein Männchen, sechs bis acht Wochen alt C57 schwarz 6 Maus dorsal-Seite nach oben. Verwenden Sie abwechselnd 70% Ethanol und Betadine Peelings, um die Injektionsstelle dreimal zu reinigen.Dann 160 Mikroliter Tetrachlorkohlenstoff per intraperitonealer Injektion an die Maus liefern und das Tier in seinen Heimischenkäfig zurückbringen. Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, in einem fünf Monate alten Simian-Virus 40 T Antigen transgene Maus, legen Sie die Maus in die Supine-Position und sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. Machen Sie einen Mittellinien-Laparotomie-Einschnitt entlang der Länge der Linea alba, groß genug, um eine ausreichende Exposition der Leber zu bieten, und verdrängen Sie den Darm nach links.Sezieren Sie oberhalb der Leber die Exposition der unteren Vena cava. Induzieren Sie eine Arterienklemme, um das Gefäß zu ligieren. Verwenden Sie eine Schmetterlingsnadel, um intravenösen Zugriff auf die Portalvene zu erhalten und den Katheter manuell zu sichern.Sorgfältige Spritzen für jede Lösung zu schalten, liefern erfolgreich 15 Milliliter Lösung eins, 15 Milliliter 0,75%Kollagennase Lösung zwei und 15 Milliliter Lösung zwei ohne Kollagenase über Katheter, bei einer Lösung von ca. 8,9 Millilitern pro Minute Durchflussrate. Am Ende der Perfusion ernten Sie die Tumormasse in ein 50-Milliliter-Konustube mit 10 bis 15 Milliliter PBS. Verbrauchen Sie den Tumor von der nächsten MTD2-Maus, wie gerade gezeigt.Verwenden Sie eine Schere, um die Leber in kleinere Stücke zu schneiden. Übertragen Sie das Gewebe in einen neuen Behälter mit frischem PBS, um das Restdes des Blutes aus dem Gewebe zu entfernen, bevor Sie die Gewebeteile in eine 50-Milliliter-Konustube mit fünf Millilitern komplettem RPMI-Medium übertragen. Die gewaschenen Leberproben zerkleinern, bis die Stücke leicht durch die Spitze einer Fünf-Milliliter-Pipette passen können.Fügen Sie genügend Medium in die Röhre, um ein Endvolumen von 30 Millilitern zu erreichen. Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um die Gewebefragmente zu tritutrieren, bevor Sie die Lösung durch ein 70-Mikrometer-Sieb in ein neues 50-Milliliter-Rohr filtern. Waschen Sie das Sieb mehrmals mit komplettem Medium.Stellen Sie das Endvolumen auf 50 Milliliter mit zusätzlichem kompletten Medium ein. Drehen Sie die Suspension durch Zentrifugierung schnell auf maximal 50 mal g, bevor Sie die Zentrifuge stoppen und den Überstand dekantieren. Dann setzen Sie das Pellet in 20 Milliliter PBS zum Zählen wieder aus.Für die intrasplenische Injektion der MTD2-Hepatozyten eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 27-Spur-Nadel pro Empfängertier mit 220 Mikroliter Hepatozyten pro Maus beladen. Bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenstiche bei einem anästhesierten, mit Tetrachlorkohlenstoff behandelten Tier. Beginnend direkt unter dem Wirbelsäulenmuskel, als nächstes, machen Sie einen Ein-Zentimeter-Einschnitt auf der linken Flanke parallel zur dreizehnten Rippe aus dem dorsalen Extrem und verwenden Stumpf-Spitzenzange, um die Milz zu exezieren.Schneiden Sie die Milz mit zwei mittelgroßen Titanclips zwischen Derstaubader und Vene ab und liefern Sie 200 Mikroliter Zellen in den unteren Pol der Milz. Schneiden Sie den unteren Zweig des Pedikles mit einem mittelgroßen Clip ab und schneiden Sie die Milz zwischen den beiden zunächst platzierten Clips. Entfernen Sie den unteren Pol der Milz, die direkt mit Tumorzellen injiziert wurde und verwenden Sie 3-0 Polyglactin 910 unterbrochenes Nähen, um die innere Muskelschicht zu schließen.Verwenden Sie dann sterilisierte Stahl-Wundclips, um die äußere Hautschicht zu schließen und subkutan fünf Milligramm pro Kilogramm Carprofen zu verabreichen. Nach der Isolierung von T-Antigen transgenen Mäusen, wie gezeigt, können sowohl Hepatozyten als auch Tumor infiltrierende Zellen beobachtet werden. Die Zellen weisen in der Regel eine fast 100%ige Lebensfähigkeit nach der Verarbeitung auf.Nach intrasplenischer Impfung in wildtype Tetrachlort-behandelte Tiere wachsen die transplantierten Hepatozyten erfolgreich und zuverlässig orthotopische hepatozelluläre Karzinomtumoren, die das tumorspezifische Simianvirus 40 T Antigen exprimieren. Die Vorbereitung unserer lebensfähigen und reinen Population von Hepatozyten aus MTD2 Masse und genaue Verabreichung der intrasplenischen Injektion sind wichtig für den Erfolg des Verfahrens. Obwohl unser Team die Hepatozytenimpfung bei Empfängermäusen mittels intravaskulärer und intraperitonealer Injektion getestet hat, waren diese anderen Methoden nicht in der Lage, orthotopisches hepatozelluläres Karzinom zu induzieren.Dieses Modell bietet eine einzigartige Plattform, die die Untersuchung der Immunüberwachung und der Toleranz in ihren frühen und späteren Stadien der Tumorprogression ermöglicht. Bitte seien Sie vorsichtig bei der Verwendung des Tetrachlorkohlenstoffs, da es giftig ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Infektion von Mäusen mit einem Adenovirus, welches das wesentliche humane Autoantigen Cytochrom P450 2D6 (hCYP2D6) durch Seren von Patienten mit Typ-2-Autoimmun-Hepatitis führt zu einer persistierenden Form der Autoimmun-vermittelten Lebererkrankung, die durch umfangreiche Hepatitis, Fibrose und Erzeugung eines CYP2D6 gekennzeichnet anerkannt -spezifische Immunantwort.

Die CYP2D6-Tiermodell: Wie Autoimmune Hepatitis in Mäusen zu induzieren

Menschen Tumorxenotransplantaten in immundefizienten Mäusen sind wertvolle Werkzeuge, um Krebsbiologie zu studieren. Spezifische Protokolle subkutane und intra-Heterotransplantate aus menschlichen Leberzellkarzinom-Zellen oder Tumorfragmente zu erzeugen, werden beschrieben. Leberregeneration nach partieller Hepatektomie in Empfängermäuse induziert wird, als eine Strategie, um intra-Transplantation zu erleichtern präsentiert.

Generierung von subkutanen und Intrahepatische Menschenleberzellkarzinom Xenografts in immundefizienten Mäusen

Eine Störung des Gallenflusses führt zu einer schweren entzündlichen cholestatischen Leberschädigung mit einer charakteristischen zeitabhängigen Abfolge morphologischer Veränderungen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die chirurgische Ligatur des Gallengangs communis bei Mäusen vor, das es ermöglicht, nach 21 bis 28 Tagen eine starke fibrotische Reaktion zu induzieren.

Gallengang-Ligation in Mice: Induktion von Entzündungsleber-Verletzung und Fibrose von obstruktiver Cholestase

Die Metastasierung von Krebs ist die Hauptursache der durch Krebs verursachten Todesfälle. Wir bieten eine eingehende Beschreibung der unser Überleben Chirurgie Methodik für die Festlegung eines "Patienten-like" orthotopen syngenen Mausmodellsystem zur Untersuchung der Mechanismen der Metastasierung bei soliden Organtumoren.

Ein &quot;Patient-Like&quot; Orthotope Syngene Maus-Modell der Leberzellkarzinom Metastasen

Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Methode, um humanisierte Mäuse mit menschlichem Immunsystem und Leberzellen zu etablieren. Dual rekonstituierte immundefizienten Mäuse, die durch intrasplenische Injektion von humanen Hepatozyten und CD34+ hämatopoetischen Stammzellen erreicht werden, sind anfällig für eine Infektion mit dem Humanimmundefizienzvirus-1 und rekapitulieren Leberschäden, wie in HIV-infizierte Patienten.

Etablierung des dualen humanisierten TK-NOG-Mausmodells für HIV-assoziierte Leberpathogenese

Dieses Protokoll stellt ein biomimetisches 3D-Modell mit begleitendem fibrotischen Stromfach dar. Hergestellt mit physiologisch relevanten Hydrogelen in Verhältnissen, die die biophysikalischen Eigenschaften der stromalen extrazellulären Matrix imitieren, ein aktiver Mediator von zellulären Wechselwirkungen, Tumorwachstum und Metastasierung.

Ein biomimetisches Modell für Leberkrebs zur Untersuchung von Tumor-Stroma-Wechselwirkungen in einer 3D-Umgebung mit tunablen biophysikalischen Eigenschaften

Portalveneninjektion von Darmkrebs (CRC) Organoiden erzeugt stromareiche Lebermetastasen. Dieses Mausmodell der CRC-Lebermetastasierung stellt ein nützliches Werkzeug dar, um Tumor-Stroma-Interaktionen zu untersuchen und neuartige Stroma-gerichtete Therapeutika wie Adeno-assoziierte virusvermittelte Gentherapien zu entwickeln.

Portalveneninjektion von Darmkrebs-Organoiden zur Untersuchung der Lebermetastasierung Stroma

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erstellung orthotoper hepatozellulärer Karzinom-Xenotransplantate mit und ohne Leberarterienligatur vor und führen eine nicht-invasive Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Bildgebung der Tumorhypoxie unter Verwendung von [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) und [18 F]Fluordesoxyglucose ([18F]FDG) durch.

Nicht-invasive PET/MR-Bildgebung in einem orthotopen Mausmodell des hepatozellulären Karzinoms

Organoide, die aus Patiententumoren erzeugt werden, werden orthotopisch in die Leber der Maus injiziert. Die Resektion von nicht-tumorösem Lebergewebe führt zu einer regenerativen Umgebung im Lebergewebe, in dem sich der Tumor befindet.

Ein von Patienten mit hepatozellulärem Krebs abgeleitetes Organoid-Xenotransplantat-Modell zur Untersuchung des Einflusses der Leberregeneration auf das Tumorwachstum

Das Mausmodell der partiellen 2/3 (66%) Hepatektomie ist in der Literatur gut beschrieben, aber ausgedehntere Hepatektomien, die das Small-for-Size-Syndrom nach Lebertransplantation nachahmen, wurden selten verwendet. Wir beschreiben eine erweiterte 78%ige Hepatektomie in einem Mausmodell, die bei gesunden Mäusen zu einer postoperativen Letalität von etwa 50% führt.

Erweiterte 78%-Hepatektomie in einem chirurgischen Mausmodell

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Bildgebende Pipeline, um die Morphologie hepatischer Stellatenzellen im intakten Lebergewebe zu visualisieren und zu modellieren. Dieser Ansatz kombiniert fluoreszierende Markierung von Fibroblasten mittels Mausgenetik, in situ leberperfusionsbasierte Gewebevorbereitung und eine modifizierte iDISCO-Gewebereinigungsmethode, um optische Transparenz zu erreichen.

Kartierung der Morphologie hepatischer stellater Zellen in Mausmodellen der Leberfibrose

Erfahren Sie die Entwicklung eines orthotopen hepatozellulären Karzinom-Modells bei männlichen C57BL/6-Mäusen mittels intrasplenischer Injektion und Leberfibrose-Technik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung tumorinduzierter Immunotoleranz.

Ein onkogenes Hepatozyten-induziertes orthotopisches Mausmodell von hepatozellulärem Krebs, der bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose entsteht (Video) | JoVE Journal

Ein onkogenes Hepatozyten-induziertes orthotopisches Mausmodell von hepatozellulärem Krebs, der bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose entsteht

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