Name: Ein onkogenes Hepatozyten-induziertes orthotopisches Mausmodell von hepatozellulärem Krebs, der bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose entsteht (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines orthotopen hepatozellulären Karzinom-Modells bei männlichen C57BL/6-Mäusen mittels intrasplenischer Injektion und Leberfibrose-Technik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung tumorinduzierter Immunotoleranz.

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Diese Arbeit wird unterstützt von NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O'Carroll, PI) und NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O'Carroll).

HINWEIS: Das gesamte Verfahren einschließlich tierischer Probanden wurde vom IACUC an der University of Missouri genehmigt. Alle Mäuse wurden nach den Kriterien des "Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren" human gepflegt. Das folgende Verfahren zur Zellisolierung und -impfung sollte in einer Kapuze durchgeführt werden. Alle Darsteller sollten die standardmäßige persönliche Schutzausrüstung für den Umgang mit Mäusen und Gewebe tragen.
1. Induktion von Leberfibrose und Zirrhose mit IP-Injektion von Kohlenstofftetrachlorid (CCl4)
HINWEIS: Siehe Abbildung 1. (CCl4 ist ein hochgefährliches Reagenz, es sollte sorgfältig und mit chemikalienbeständigen Handschuhen behandelt werden)
<ol><li>Erhalten Sie männliche C57BL/6J-Mäuse, die sechs bis acht Wochen alt sind (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>10% CCl4 (v/v) Lösung in Maisöl in einem Zentrifugenrohr vorbereiten. Bestimmen Sie das Gesamtvolumen basierend auf der Anzahl der zu injizierenden Mäuse (siehe Schritt 1.6).</li>
	<li>Verwenden Sie die geeignete Mäusehandhabungstechnik, um eine Maus für die Injektion auszuwählen.</li>
	<li>Halten Sie die Maus mit ihrer rückenden Seite (Bauch) manuell zurück.</li>
	<li>Reinigen Sie die Injektionsstelle an der Bauchwand der Maus, indem Sie mit 70% Alkohol schrubben.</li>
	<li>Injizieren Sie männliche C57BL/6J-Mäuse mit 160 l 10% CCl4-Lösung durch intraperitoneale (IP) Injektion mit einer 25-Spur-Einwegnadel.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Nadel nur durch die Bauchwand (ca. 4-5 mm) mit Abschrägung nach oben und leicht abgewinkelt bei 15-20 Grad eindringt.</li>
	<li>Injizieren Sie Mäuse zweimal pro Woche für insgesamt vier Wochen - jede Maus erhält insgesamt acht Injektionen. HINWEIS: Zwei Wochen nach der letzten Injektion sind behandelte Mäuse bereit für die ISPL-Impfung onkogener Hepatozyten von MTD2-Mäusen.</li>
</ol>2. Isolierung von Tag-transgenen Hepatozyten von MtD2-Mäusen der Linie
HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Lösungsrezepte.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>10x Ausgewogene Salzlösung von Earle ohne Ca oder Mg (EBSS ohne Ca oder Mg)</td>
			<td>4 g KCl 68 g NaCl 1.4 g NaH2PO4 H2o 10 g Dextrose Wasser zu 1 Liter hinzufügen, pH bis 4.32 Durchpassern des Filters</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lösung 1</td>
			<td>20 ml 10x EBSS ohne Ca oder Mg 44 g NaHCO3 1,33 ml 1,5 Mio. Hepes 10 ml von 10 ml EGTA Wasser zu 200 ml hinzufügen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lösung 2</td>
			<td>100 ml 10x EBSS 2,2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M Hepes Wasser zu 1 Liter hinzufügen</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,75% Kollagennaselösung</td>
			<td>15 mg Kollagenase Typ 1 20 ml Lösung 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Komplettes Medium</td>
			<td>2 RPMI 50 ml FBS 5 mL 100x Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Lösungsrezepte.
<ol><li>Besorgen Sie sich die Linie MTD2-Mäuse38, um als Quelle onkogener Hepatozyten zu dienen.</li>
	<li>Anästhetisieren Sie 5 Wochen alte MTD2-Mäuse mit 2,5% Isofluran. HINWEIS: Die richtige Anästhesisierung wird durch die Toe Pinch-Methode überprüft. Kurz gesagt, mit zwei Fingern, geben Sie der Maus Zehen / Fuß eine gute Quetschung. Wenn es keine Entzugsreaktion gibt, wird das Tier tief genug beurteilt, um mit der Operation zu beginnen.</li>
	<li>Wenn sie angemessen sediert sind, platzieren Sie Mäuse in eine Supine-Position und fixieren Sie die Extremitäten mit Klebeband, um eine ausreichende Exposition der Bauchoberfläche zu gewährleisten.</li>
	<li>Führen Sie einen Mittellinien-Laparotomie-Einschnitt mit einer Schere entlang der Länge der Linea alba groß genug, um eine ausreichende Exposition der Leber zu bieten.</li>
	<li>Verdrängen Sie den Darm nach links, um eine bessere Exposition der Leber und Portal Triade zu bieten.</li>
	<li>Sezieren Sie über der Leber, um die minderwertige Vena cava (IVC) zu belichten.</li>
	<li>Ligate die IVC über der Leber mit einer Arterienklemme.</li>
	<li>Zurück zur unteren Grenze der Leber, verwenden Sie eine Schmetterlingsnadel (siehe Materialien), um IV Zugang zur Portalvene zu erhalten. Fix Katheter von Hand.</li>
	<li>Sukzessive durchdringen Sie die Mausleber mit einer Injektionsspritze bei 8,9 ml/min mit 15 ml Lösung 1, 15 ml 0,75% Kollagennaselösung 2 und 15 ml Lösung 2 über den Katheter.</li>
	<li>Ernten Sie die durchnässte Leber, indem Sie die Tumormasse von MTD2-Mäusen in einem 50 ml konischen Rohr mit 10-15 ml PBS schneiden und einnehmen.</li>
	<li>ENTFERNEN Sie PBS und waschen Sie eine zusätzliche Zeit mit PBS; zentrifugieren Sie bei diesem Schritt nicht.</li>
	<li>Schneiden Sie die Leber in kleinere Stücke mit der Schere und dann wieder mit PBS 2x waschen, um restliches Blut zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 5 ml komplettes RPMI-Medium in das konische Rohr und kontinuierlich Hacken der Leber mit schere zu kleinen Stücken (<3 mm)-Gewebe sollte glatt durch eine 5 ml Pipette gehen.</li>
	<li>Fügen Sie ein vollständiges RPMI zu einem Endvolumen von 30 ml hinzu und suspendieren Sie die Leber mit einer 5 ml Pipette.</li>
	<li>Filtern Sie die Mischlösung mit einem 70-mm-Sieb in ein 50 ml konisches Rohr.</li>
	<li>Waschen Sie das Sieb mehrmals mit komplettem RPMI und stellen Sie das Endvolumen auf 50 ml ein, indem Sie zusätzliches RPMI-Medium hinzufügen.</li>
	<li>Drehen Sie die Suspension schnell durch Zentrifuge auf maximal 500 U/min; sobald die Geschwindigkeit auf 50 x gbeschleunigt wird, sollte die Zentrifuge gestoppt werden.</li>
	<li>Dekantieren Sie den Überstand und hängen Pellets in 20 ml PBS.</li>
	<li>Zählen Sie Zellen mit Trypan-Blauausschluss und einem Hämozytometer, und passen Sie dann die Zellkonzentration für die folgende Zellimpfung auf 2,5 x 106/ml an. HINWEIS: Die erwartete Ausbeute von 5 Gramm Tumorgewebe beträgt 80 Millionen Hepatozyten mit Lebensfähigkeit >95%.</li>
</ol>3. Impfung der Hepatozyten von MTD2-Mäusen in die Leber von wildlebenden Typ C57BL/6J-Mäusen durch ISPL-Injektion
<ol><li>Die aseptische Technik sollte in allen Verfahren</li>
	<li>Anästhetisieren Siedie CCl 4-behandelten männlichen C57BL/6J-Mäuse mit 2,5% Isofluran, die Mäuse sollten mit Augenschmiere behandelt werden, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.</li>
	<li>Bereiten Sie Spritzen mit 200 L Hepatozyten zur Injektion vor.</li>
	<li>Wenn ausreichend sediert, positionieren Sie Mäuse mit der linken Seite nach oben.</li>
	<li>Rasieren Sie die gesamte linke Flanke der Mäuse, dann schrubben Sie die Fläche, abwechselnd zwischen 70% Alkohol und Betadin dreimal.</li>
	<li>5 mg/kg Carprofen subkutaneouly vor dem chirurgischen Schnitt verabreichen.</li>
	<li>Machen Sie einen 1 cm Schnitt auf der linken Flanke parallel zur13. Rippe vom dorsalen Extrembeginnen direkt unterhalb des Wirbelsäulenmuskels.</li>
	<li>Identifizieren Sie die Milz, und exemiten Sie sie dann mit stumpfspitzen Zangen.</li>
	<li>Beschneiden Sie die Milz mit zwei mittelgroßen Titanclips. Platzieren Sie beide Clips zwischen der Milzarterie und der Vene, lassen Sie Raum zwischen den Clips, um sie später nach der Impfung zu schneiden. HINWEIS: Das Ziel ist es, den unteren Pol der Milz zu isolieren, um das Risiko der Aussaat zu reduzieren.</li>
	<li>Mit einer 27 G-Nadel in die untere Milz der Milz injizieren.</li>
	<li>Schneiden Sie den unteren Zweig des Pedikles (untere Splenic-Polgefäße) mit einem mittelgroßen Clip ab.</li>
	<li>Schneiden Sie die Milz zwischen den beiden zunächst platzierten Clips.</li>
	<li>Entfernen Sie den unteren Pol der Milz, die direkt mit Tumorzellen injiziert wurde.</li>
	<li>Verwenden Sie 3-0 Polyglactin 910 unterbrochenes Nähen, um die innere Muskelschicht zu schließen.</li>
	<li>Verwenden Sie sterilisierte Stahl-Wundclips, um die äußere Hautschicht zu schließen. HINWEIS: Stahlclips werden bevorzugt über Nähten, um zu vermeiden, dass Tiere Nähte auskauen und eine klaffende Wunde hinterlassen.</li>
	<li>5 mg/kg Carprofen subkutan nach der Naht verabreichen.</li>
	<li>Legen Sie alle erholenden Tiere auf ein temperaturgeregeltes Heizkissen und überwachen Sie genau, bis sie vollständig von der Anästhesie genesen sind.</li>
	<li>Geben Sie Mäusen nach der Operation freien Zugang zu Wasser. Wenn die Maus während der Operation dehydriert wird, verabreichen Sie subkutane Flüssigkeiten (<1 ml).</li>
	<li>Entfernen Sie Hautclips nach 7-10 Tagen nach der Operation.</li>
</ol>

<ol><li>O'Connor, S., Ward, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+-+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma - United States.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 59, 517-520 (2010).</li>
<li>Petrick, J., Kelly, S., Altekruse, S., McGlynn, K., Rosenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+of+Hepatocellular+Carcinoma+Incidence+in+the+United+States+Forecast+Through+2030%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+oncology%3A+official+journal+of+the+American+Society+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Future of Hepatocellular Carcinoma Incidence in the United States Forecast Through 2030.</a> Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 34, 1787-1794 (2016).</li>
<li>Greten, T., Lai, C., Li, G., Staveley-O'Carroll, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+and+Immune-based+Therapies+for+Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Targeted and Immune-based Therapies for Hepatocellular Carcinoma.</a> Gastroenterology. 156, 510-524 (2019).</li>
<li>Llovet, J., Zucman-Rossi, J., Pikarsky, E., Sangro, B., Schwartz, M., Sherman, M., Gores, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Disease+primers%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular Carcinoma.</a> Nature reviews. Disease primers. 2, 16018(2016).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+medicine+for+hepatocellular+carcinoma%3A+driver+mutations+and+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Precision medicine for hepatocellular carcinoma: driver mutations and targeted therapy.</a> Oncotarget. 8, 55715-55730 (2017).</li>
<li>Colombo, M., Maisonneuve, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+liver+cancer+mortality+on+a+global+scale%3A+still+a+long+way+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Controlling liver cancer mortality on a global scale: still a long way to go.</a> Journal of Hepatology. 67, 216-217 (2017).</li>
<li>Llovet, J., Burroughs, A., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 362, 1907-1917 (2003).</li>
<li>Parkin, D., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+world+cancer+burden%3A+Globocan+2000%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Estimating the world cancer burden: Globocan 2000.</a> International Journal of Cancer. 94, 153-156 (2001).</li>
<li>Thomas, M., Zhu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepocellular+carcinoma%3A+the+need+for+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Hepocellular carcinoma: the need for progress.</a> Journal of Clinical Oncology. 23, 2892-2899 (2005).</li>
<li>Llovet, J., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targeted+therapies+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Molecular targeted therapies in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology. 48, 1312-1327 (2008).</li>
<li>Bruix, J., Sherman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+hepatocellular+carcinoma%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Management of hepatocellular carcinoma: an update.</a> Hepatology. 53, 1020-1022 (2011).</li>
<li>Pang, T., Lam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+management+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Surgical management of hepatocellular carcinoma.</a> World Journal of Hepatology. 7, 245-252 (2015).</li>
<li>Llovet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+endpoints+of+clinical+trials+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institution%22%5BJournal%5D)">Design and endpoints of clinical trials in hepatocellular carcinoma.</a> Journal of the National Cancer Institution. 100, 698-711 (2008).</li>
<li>Mueller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunology+and+immunotherapy.+Realizing+the+promise.+Introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunology and immunotherapy. Realizing the promise. Introduction.</a> Science. 348, 54-55 (2015).</li>
<li>Gajewski, T., Schreiber, H., Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nature Immunology. 14, 1014-1022 (2013).</li>
<li>Ribas, A., Wolchok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+cancer+immunotherapy+and+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Combining cancer immunotherapy and targeted therapy.</a> Current Opinion in Immunology. 25, 291-296 (2013).</li>
<li>Postow, M., Callahan, M., Wolchok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+blockade+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%3A+Official+Journal+of+the+American+Society+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint blockade in cancer therapy.</a> Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 33, 1974-1982 (2015).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VISTA+is+an+inhibitory+immune+checkpoint+that+is+increased+in+ipilimumab+therapy+in+patients+with+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">VISTA is an inhibitory immune checkpoint that is increased in ipilimumab therapy in patients with prostate cancer.</a> Nature Medicine. 23, 551-555 (2017).</li>
<li>Hahn, A., Gill, D., Pal, S., Agarwal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+immune+checkpoint+cancer+therapy+after+PD-1+and+CTLA-4%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">The future of immune checkpoint cancer therapy after PD-1 and CTLA-4.</a> Immunotherapy. 9, 681-692 (2017).</li>
<li>Remon, J., Besse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+inhibitors+in+first-line+therapy+of+advanced+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint inhibitors in first-line therapy of advanced non-small cell lung cancer.</a> Current Opinion in Oncology. 29, 97-104 (2017).</li>
<li>Kudo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+blockade+in+hepatocellular+carcinoma%3A+2017+update%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint blockade in hepatocellular carcinoma: 2017 update.</a> Liver Cancer. 6, 1-12 (2017).</li>
<li>Kudo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+inhibition+in+hepatocellular+carcinoma%3A+Basics+and+ongoing+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint inhibition in hepatocellular carcinoma: Basics and ongoing clinical trials.</a> Oncology. 92, 50-62 (2017).</li>
<li>Breous, E., Thimme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+immunotherapy+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Potential of immunotherapy for hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Hepatology. 54, 830-834 (2011).</li>
<li>Sprinzl, M., Galle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facing+the+dawn+of+immunotherapy+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Facing the dawn of immunotherapy for hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Hepatology. 59, 9-10 (2013).</li>
<li>Liu, D., Staveley-O'Carroll, K., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-based+therapy+clinical+trials+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Cell+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune-based therapy clinical trials in hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Clinical Cell Immunology. 6, 376(2015).</li>
<li>Greten, T., Wang, X., Korangy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+of+immune+based+treatments+for+patients+with+HCC%3A+from+basic+science+to+novel+treatment+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Current concepts of immune based treatments for patients with HCC: from basic science to novel treatment approaches.</a> Gut. 64, 842-848 (2015).</li>
<li>Koster, B., de Gruijl, T., van den Eertwegh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+and+future+challenges+in+immune+checkpoint+inhibitory+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Recent developments and future challenges in immune checkpoint inhibitory cancer treatment.</a> Current Opinion in Oncology. 27, 482-488 (2015).</li>
<li>Johnson, D., Sullivan, R., Menzies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+inhibitors+in+challenging+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint inhibitors in challenging populations.</a> Cancer. 123, 1904-1911 (2017).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death-1+%28PD-1%29+checkpoint+blockade+in+combination+with+an+mTOR+inhibitor+restrains+hepatocellular+carcinoma+growth+induced+by+hepatoma+cell-intrinsic+PD-1%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death-1 (PD-1) checkpoint blockade in combination with an mTOR inhibitor restrains hepatocellular carcinoma growth induced by hepatoma cell-intrinsic PD-1.</a> Hepatology. 66, 1920-1933 (2017).</li>
<li>Heindryckx, F., Colle, I., van Vlierberghe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+mouse+models+for+hepatocellular+carcinoma+research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research.</a> International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+inCVAX%2C+in+situ+cancer+vaccine%2C+and+its+immune+response+in+mice+with+hepatocellular+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of inCVAX, in situ cancer vaccine, and its immune response in mice with hepatocellular cancer.</a> Journal of Clinical and Cellular Immunology. 7, 438(2016).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+radiofrequency+ablation+platform+in+a+clinically+relevant+murine+model+of+hepatocellular+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Development of a radiofrequency ablation platform in a clinically relevant murine model of hepatocellular cancer.</a> Cancer Biology and Therapy. 16, 1812-1819 (2015).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sunitinib+represses+regulatory+T+cells+to+overcome+immunotolerance+in+a+murine+model+of+hepatocellular+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Sunitinib represses regulatory T cells to overcome immunotolerance in a murine model of hepatocellular cancer.</a> Oncoimmunology. 7, 1372079(2017).</li>
<li>Staveley-O'Carroll, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+ligation+of+CD40+enhances+priming+against+the+endogenous+tumor+antigen+and+promotes+CD8%2B+T+cell+effector+function+in+SV40+T+antigen+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vivo ligation of CD40 enhances priming against the endogenous tumor antigen and promotes CD8+ T cell effector function in SV40 T antigen transgenic mice.</a> Journal of Immunology. 171, 697-707 (2003).</li>
<li>Avella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+established+hepatocellular+carcinoma+is+induced+by+chemoimmunotherapy+in+an+orthotopic+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Regression of established hepatocellular carcinoma is induced by chemoimmunotherapy in an orthotopic murine model.</a> Hepatology. 55, 141-152 (2012).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+chemoimmunotherapy+against+hepatocellular+cancer+in+a+novel+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Successful chemoimmunotherapy against hepatocellular cancer in a novel murine model.</a> Journal of Hepatology. 66, 75-85 (2017).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliposome+C6-ceramide+increases+the+anti-tumor+immune+response+and+slows+growth+of+liver+tumors+in+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Nanoliposome C6-ceramide increases the anti-tumor immune response and slows growth of liver tumors in ice.</a> Gastroenterology. 154, 1024-1036 (2018).</li>
<li>Held, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+antigen+expression+and+tumorigenesis+in+transgenic+mice+containing+a+mouse+major+urinary+protein%2FSV40+T+antigen+hybrid+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene.</a> EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).</li>
<li>Hanahan, D., Weinber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
</ol>

Es gibt keine zu deklarieren.

Mit diesem Protokoll haben wir ein zuverlässiges und reproduzierbares murines Modell von HCC etabliert, das die menschliche HCC-Initiierung und Progression imitiert. Klinisch, viele Risikofaktoren sukzessive induzieren Leberschäden, Leberfibrose, Zirrhose und die endk.-Phase von HCC. In unserem Protokoll wird die IP-Injektion von CCl4 verwendet, um zuerst Leberfibrose bei Wildtypmäusen zu produzieren, was es den nachfolgenden onkogenen Hepatozyten ermöglicht, die Tumoren bei der Einstellung von Leberfibrose zu...

Hepatozellulärer Krebs (HCC) ist die am schnellsten zunehmende Krebsart in den Vereinigten Staaten (US)1,2,3. Jedes Jahr werden ca. 850.000 neue Fälle diagnostiziert4,5 und 700.000 Patienten sterben an dieser tödlichen Krankheit6,7,8,9,10 und ist damit weltweit die zweithäufigste Todesursache im Zusammenhang mit Krebs. Die Verwaltung von HCC umfasst chirurgische Resektion, Transplantation, Ablation, Chemoembolisierung oder systemische Therapien, wie Sorafenib11. Früherkennung und Management mit chirurgischer Resektion oder Transplantation haben den höchsten Gesamtüberlebensvorteil4. Leider, die Mehrheit der Patienten in einem späteren Stadium anwesend und erfordern Management mit Ablation, Chemoembolisierung oder Sorafenib12. Sorafenib, ein Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitor (RTKI), wurde von der Food and Drug Administration im Jahr 2008 als einzige systemische medikamentöse Therapie zur Behandlung von nicht resezierbaren HCC zugelassen. Obwohl das Medikament nur eine bescheidene Erhöhung des Gesamtüberlebens bietet, von 7,9 auf 10,7 Monate13, es bot eine neue therapeutische Strategie, die verwendet werden könnte, um HCC zu verwalten.
Die Manipulation des Immunsystems zur Beseitigung etablierter Krebsarten ist ein schnell wachsendes Feld in der Krebsforschung14. Immun-Checkpoint-Studien haben erheblich fortgeschrittene immuntherapeutische Arzneimittelentwicklung in der Krebsbehandlung15,16. Die FDA genehmigte die Verwendung von Antikörpern (Abs) gegen zytotoxisches T-Lymphozyten-Antigen 4 (CTLA-4), programmiertes Zelltodprotein 1 (PD-1) und seinen Liganden PD-L1 zur Behandlung von Melanom, Lungenkrebs, Kopf- und Nackenkrebs und Blasenkrebs17, 18 , 19 , 20. Klinische Studien zur Monotherapie oder Kombinationstherapie mit einem oder mehreren Antikörpern gegen PD-1, PD-L1 oder CTLA-4 zur Behandlung fortgeschrittener HCC sind im Gange21,22,23und einige Studien haben positive Ergebnisse gezeigt. Im Jahr 2017 erteilte die FDA eine beschleunigte Zulassung für Anti-PD-1-Antikörper zur Behandlung von HCC-Patienten, die gegen Sorafenib resistenzen, aber die Gesamtansprechrate dieser Therapie beträgt nur 14,3%. Andere Strategien wurden zu diesem Zeitpunkt nicht in die klinische Praxis übersetzt24,25. Überwindung der tumorinduzierten tiefen Immuntoleranz zur Verbesserung der Immun-Checkpoint-Therapie26; Vorhersage der Wirksamkeit der Immun-Checkpoint-Therapie; Immunbedingte Nebenwirkungen zu verhindern; Optimierung der Verabreichung S-Route, Dosierung, und Häufigkeit; und die Suche nach effektiven Kombinationen der Therapien27,28,29 bleiben alle extrem herausfordernde Aufgaben.
Es gibt mehrere konventionelle Ansätze, die verwendet werden, um HCC in Mausmodellen zu induzieren und werden in Abhängigkeit von der speziellen Forschungsfrage des Forschersverwendet 30. Chemisch induzierte HCC-Mausmodelle mit genotoxischen Verbindungen imitieren verletzungsinduzierte Malignität. Xenograft-Modelle durch ektopische oder orthotopische Implantation von HCC-Zelllinien eignen sich für das Arzneimittelscreening. Eine Reihe von genetisch veränderten Mäusen wurden entwickelt, um die Pathophysiologie von HCC zu untersuchen. Transgene Mäuse, die virale Gene, Onkogene und/oder Wachstumsfaktoren exdrücken, ermöglichen die Identifizierung von Wegen, die an der Hepatocarcinogenese beteiligt sind. Aufgrund inhärenter Einschränkungen fassen diese Modelle nicht die typischen Immuneigenschaften des menschlichen HCC zusammen, was die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und die Entwicklung innovativer immuntherapeutischer Strategien erheblich behindert hat14 ,15. Kürzlich haben wir ein klinisch relevantes murines Modell entwickelt. Dieses neuartige Modell imitiert nicht nur die Menschliche HCC-Initiierung und Progression, sondern spiegelt auch die meisten typischen Merkmale menschlicher Krankheiten wider, einschließlich Immunfunktionsstörungen. Wir haben seine biologischen und immunologischen Eigenschaften charakterisiert. Unter Der Nutzung dieses neuartigen Modells haben wir verschiedene immuntherapeutische Strategien zur Behandlung von HCC31,32,33,34,35,36, 37. Diese einzigartige Plattform ermöglicht es uns, Mechanismen der tumorinduzierten Immunverträglichkeit zu untersuchen und proof-of-Concept-Therapiestrategien für HCC für eine eventuelle klinische Translation zu entwickeln.

<table><tbody><tr><td>Anästhesiegerät</td><td>VETEQUIP</td><td>IMPAC6</td><td>Anästhesiegerät für die Chirurgie</td></tr><tr><td>Schmetterlingsnadel</td><td>BD</td><td>8122963</td><td>Nadel für die Leberperfusion</td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäuse</td><td>Jackson Lab</td><td>000664&nbsp;</td><td>Mäuse, die in Prototol verwendet werden</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>CRESCENT CHEMICAL</td><td>20402</td><td>Carprofen zur Schmerzlinderung</td></tr><tr><td>Zellsieb&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>REF 431751</td><td>Cell Sieb, 70&micro; m, für die Isolierung von Hepatozyten</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-30R</td><td>Zentrifuge für die Zellisolierung</td></tr><tr><td>Clips&nbsp;</td><td>Teleflex Medical</td><td>REF 523700</td><td>Titan-Clips für Milzmikroskop</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Primovert&nbsp;</td><td>Mikroskop für die Zellbeobachtung</td></tr><tr><td>Mtd2 Mäuse</td><td>N/A</td><td></td><td>Geschenk von Dr. William A Gehalten am Roswell Park Cancer Institute im Jahr 2002, aufbewahrt in unserem Labor</td></tr><tr><td>Nadel</td><td>BD</td><td>REF 305109</td><td>BD precisionglide Nadel, 27G x 1/2 (0,4 mm x 13 mm)</td></tr><tr><td>Naht</td><td>ETHICON</td><td>J303H</td><td>beschichtetes VICRYL Nahtmaterial</td></tr><tr><td>SV40 T Ag Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab16879</td><td>anti-SV40 T-Antigen Antikörper für IHC</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>BD</td><td>REF 309626</td><td>1 mL TB-Spritze für die Zellinjektion</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>SIGMA</td><td>T 8154</td><td>Trypanblau Lösung für den Zellviabilitätstest</td></tr><tr><td>Wundclips</td><td>Reflex</td><td>reflex9, Art.-Nr. 201-1000</td><td>Edelstahl-Wickelclips für den Wundverschluss</td></tr></tbody></table>

ein onkogenes hepatozyten-induziertes orthotopisches mausmodell von hepatozellulärem krebs, der bei der einstellung von leberentzündungen und fibrose entsteht

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

Das Fehlen eines klinisch relevanten Tiermodells, das sich mit den typischen Immunmerkmalen von hepatozellulärem Krebs (HCC) befasst, hat die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und die Entwicklung innovativer immuntherapeutischer Strategien erheblich behindert. Um ein ideales Tiermodell zu entwickeln, das menschliche HCC rekapituliert, erhalten immunkompetente männliche C57BL/6J-Mäuse zunächst eine Tetrachlorsäure-Injektion (CCl4), um Leberfibrose zu induzieren, und erhalten dann histologisch-normale onkogene Hepatozyten von jungen SV40 T Antigen (TAg)-transgene Mäuse (MTD2) durch intrasplenische (ISPL) Inokulation. Androgen erzeugt in Empfänger männlichen Mäusen in der Pubertät initiiert TAg-Expression unter Kontrolle eines Leber-spezifischen Promotor. Dadurch werden die übertragenen Hepatozyten zu Krebszellen und bilden Tumormassen bei der Einstellung von Leberfibrose/Zirrhose. Dieses neuartige Modell imitiert die Initiierung und Progression des menschlichen HCC im Kontext von Leberfibrose/Zirrhose und spiegelt die typischsten Merkmale des menschlichen HCC einschließlich Immunfunktionsstörungen wider.

Onkogene Hepatozyten, die von TAg-transgenen Mäusen isoliert wurden (Abbildung 2), wurden in der Leber von Wildtypmäusen durch intra-splenische Injektion ausgesät (Abbildung 3). Die transplantierten Hepatozyten wuchsen erfolgreich und zuverlässig orthotopische HCC-Tumoren (Abbildung 4) mit tumorspezifischem Antigen SV40 TAg (Abbildung 5) bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose ( Abbildung1).
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Hier beschreiben wir die Entwicklung eines klinisch relevanten murinen Modells von Leberkrebs, das die typischen Immunmerkmale von hepatozellulärem Krebs (HCC) rekapituliert.

Ein onkogenes Hepatozyten-induziertes orthotopisches Mausmodell von hepatozellulärem Krebs, der bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose entsteht

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

Mit nur einem Modell, um ein hepatozelluläres Krebs-Massenmodell zu entwickeln könnte Menschen helfen, ihre tumor-induzierte Immunverträglichkeit und spezifische Behandlung-induzierte, alle Tumor-Immunreaktionen zu klären. Der orthotopische Tumor, der sich mit der Leberfibrose-Technik entwickelt, imitiert die klinischen Merkmale von menschlichem Leberkrebs. Diese Methode könnte ein nützliches Werkzeug in hepatozellululären Krebs immunologischen Studie.Die visuelle Demonstration dieser Methode kann die technisch anspruchsvolleren Schritte, wie z. B. die intrasplenische Injektion, veranschaulichen, die für eine erfolgreiche Ausführung dieses Protokolls unerlässlich sind. Als nächstes, manuell zurückhalten ein Männchen, sechs bis acht Wochen alt C57 schwarz 6 Maus dorsal-Seite nach oben. Verwenden Sie abwechselnd 70% Ethanol und Betadine Peelings, um die Injektionsstelle dreimal zu reinigen.Dann 160 Mikroliter Tetrachlorkohlenstoff per intraperitonealer Injektion an die Maus liefern und das Tier in seinen Heimischenkäfig zurückbringen. Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, in einem fünf Monate alten Simian-Virus 40 T Antigen transgene Maus, legen Sie die Ma

an-oncogenic-hepatocyte-induced-orthotopic-mouse-model-hepatocellular

Research

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JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Menschen Tumorxenotransplantaten in immundefizienten Mäusen sind wertvolle Werkzeuge, um Krebsbiologie zu studieren. Spezifische Protokolle subkutane und intra-Heterotransplantate aus menschlichen Leberzellkarzinom-Zellen oder Tumorfragmente zu erzeugen, werden beschrieben. Leberregeneration nach partieller Hepatektomie in Empfängermäuse induziert wird, als eine Strategie, um intra-Transplantation zu erleichtern präsentiert.

Generierung von subkutanen und Intrahepatische Menschenleberzellkarzinom Xenografts in immundefizienten Mäusen

Die Metastasierung von Krebs ist die Hauptursache der durch Krebs verursachten Todesfälle. Wir bieten eine eingehende Beschreibung der unser Überleben Chirurgie Methodik für die Festlegung eines "Patienten-like" orthotopen syngenen Mausmodellsystem zur Untersuchung der Mechanismen der Metastasierung bei soliden Organtumoren.

Ein &quot;Patient-Like&quot; Orthotope Syngene Maus-Modell der Leberzellkarzinom Metastasen

Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Methode, um humanisierte Mäuse mit menschlichem Immunsystem und Leberzellen zu etablieren. Dual rekonstituierte immundefizienten Mäuse, die durch intrasplenische Injektion von humanen Hepatozyten und CD34+ hämatopoetischen Stammzellen erreicht werden, sind anfällig für eine Infektion mit dem Humanimmundefizienzvirus-1 und rekapitulieren Leberschäden, wie in HIV-infizierte Patienten.

Etablierung des dualen humanisierten TK-NOG-Mausmodells für HIV-assoziierte Leberpathogenese

Wir beschreiben detailliert ein klinisch relevantes Tumormodell der Darmkrebslebermetastasen (CRLM) und den Einfluss der Leberischämie-Reperfusion (I/R) auf Tumorwachstum und Metastasierung. Dieses Modell kann helfen, die Mechanismen, die der chirurgieinduzierten Förderung des metastasierenden Wachstums der Leber zugrunde liegen, besser zu verstehen.

Murine Modell der metastasierenden Lebertumoren in der Einstellung der Ischämie Reperfusionsverletzung

Orthotopische humane Leber metastasierenuvealmelanom xenograft MausModelle wurden mit chirurgischen orthotopischen Implantationstechniken mit Patienten-abgeleiteten Tumorstück und Nadelinjektionstechniken mit kultivierten menschlichen uvealen Melanom-Zelllinien erstellt.

Generierung einer Leber orthotopischen Human Enuveal Melanom Xenograft Plattform bei immundefizienten Mäusen

Dieses Protokoll stellt ein biomimetisches 3D-Modell mit begleitendem fibrotischen Stromfach dar. Hergestellt mit physiologisch relevanten Hydrogelen in Verhältnissen, die die biophysikalischen Eigenschaften der stromalen extrazellulären Matrix imitieren, ein aktiver Mediator von zellulären Wechselwirkungen, Tumorwachstum und Metastasierung.

Ein biomimetisches Modell für Leberkrebs zur Untersuchung von Tumor-Stroma-Wechselwirkungen in einer 3D-Umgebung mit tunablen biophysikalischen Eigenschaften

Portalveneninjektion von Darmkrebs (CRC) Organoiden erzeugt stromareiche Lebermetastasen. Dieses Mausmodell der CRC-Lebermetastasierung stellt ein nützliches Werkzeug dar, um Tumor-Stroma-Interaktionen zu untersuchen und neuartige Stroma-gerichtete Therapeutika wie Adeno-assoziierte virusvermittelte Gentherapien zu entwickeln.

Portalveneninjektion von Darmkrebs-Organoiden zur Untersuchung der Lebermetastasierung Stroma

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erstellung orthotoper hepatozellulärer Karzinom-Xenotransplantate mit und ohne Leberarterienligatur vor und führen eine nicht-invasive Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Bildgebung der Tumorhypoxie unter Verwendung von [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) und [18 F]Fluordesoxyglucose ([18F]FDG) durch.

Nicht-invasive PET/MR-Bildgebung in einem orthotopen Mausmodell des hepatozellulären Karzinoms

Organoide, die aus Patiententumoren erzeugt werden, werden orthotopisch in die Leber der Maus injiziert. Die Resektion von nicht-tumorösem Lebergewebe führt zu einer regenerativen Umgebung im Lebergewebe, in dem sich der Tumor befindet.

Ein von Patienten mit hepatozellulärem Krebs abgeleitetes Organoid-Xenotransplantat-Modell zur Untersuchung des Einflusses der Leberregeneration auf das Tumorwachstum

Das Mausmodell der partiellen 2/3 (66%) Hepatektomie ist in der Literatur gut beschrieben, aber ausgedehntere Hepatektomien, die das Small-for-Size-Syndrom nach Lebertransplantation nachahmen, wurden selten verwendet. Wir beschreiben eine erweiterte 78%ige Hepatektomie in einem Mausmodell, die bei gesunden Mäusen zu einer postoperativen Letalität von etwa 50% führt.

Erweiterte 78%-Hepatektomie in einem chirurgischen Mausmodell

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Bildgebende Pipeline, um die Morphologie hepatischer Stellatenzellen im intakten Lebergewebe zu visualisieren und zu modellieren. Dieser Ansatz kombiniert fluoreszierende Markierung von Fibroblasten mittels Mausgenetik, in situ leberperfusionsbasierte Gewebevorbereitung und eine modifizierte iDISCO-Gewebereinigungsmethode, um optische Transparenz zu erreichen.

Kartierung der Morphologie hepatischer stellater Zellen in Mausmodellen der Leberfibrose

Erfahren Sie die Entwicklung eines orthotopen hepatozellulären Karzinom-Modells bei männlichen C57BL/6-Mäusen mittels intrasplenischer Injektion und Leberfibrose-Technik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung tumorinduzierter Immunotoleranz.

Ein onkogenes Hepatozyten-induziertes orthotopisches Mausmodell von hepatozellulärem Krebs, der bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose entsteht (Video) | JoVE Journal

Ein onkogenes Hepatozyten-induziertes orthotopisches Mausmodell von hepatozellulärem Krebs, der bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose entsteht

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