Name: Konfokale Live Imaging von Shoot Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Pflanzenarten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Erfahren Sie die konfokale Live-Bildgebung von Sprossapikalmeristemen verschiedener Pflanzenarten. Diese effiziente Methode ermöglicht hochaufgelöste Visualisierung zellulärer Strukturen ohne aufwendige Fixierung.

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Die Autoren erkennen Purdue Bindley Bioscience Center Imaging Facility für den Zugriff auf die Laser-scanning-confocal Mikroskop und für die technische Unterstützung, und die Autoren dankbar für die Hilfe von Andy Schaber in Purdue Bindley Imaging Facility. Diese Tätigkeit wurde von der Purdue University im Rahmen der AgSEED Kreuzung Mittel zur Förderung der Landwirtschaft und ländliche Entwicklung Indianas finanziert.

(1) Medien und Bildgebung Gerichte-Vorbereitung
<ol><li>MS Teller: 0,5 x Murashige & Skoog MS mittlere, 1 % Agar in entionisiertem Wasser hinzufügen und dann justieren pH bis 5.8 mit Kalilauge (Optional: Fügen Sie 1 % Saccharose für langfristige Pflanzenbau). Autoklaven und gießen Sie Platten.</li>
	<li>Imaging-Gerichte: füllen Sie Kunststoff Petrischalen (6 cm breit, 1,5 cm tief) auf 0,5-0,8 cm mit 1,5 % flüssige Agarose.</li>
</ol>(2) Pflanzenwachstum
<ol><li>
Arabidopsis Wachstum<ol>
<li>Sterilisierte Saat auf MS Teller und Platten unter 4 ° C für zwei Tage. Verschieben Sie dann MS-Platten in ein kurzer Tag (8 h Licht / dunkel 16 h), bei 22 ° C für zwei Wochen.</li>
		<li>Transplantation Sämlinge zu Boden und wachsen sie in einer kurzen Tage (8 h Licht / dunkel 16 h) bei 22 ° C für vier Wochen.</li>
		<li>Übertragen Sie Pflanzen auf Dauerlicht bei 22 ° C, den Übergang von der vegetativen zur reproduktiven Phase und für die Belichtung der Blütenstand SAMs zu induzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tomaten und Soja Wachstum<ol>
<li>Inkubieren Sie die Samen mit nassem Filterpapier unter 28 ° C bedeckt, bis sie Keimen.</li>
		<li>Transplantation Sämlinge zu Boden und wachsen sie in einem langen Tag (16 h Licht / dunkel 8 h) bei 25 ° C für eine Woche oder länger für die vegetative SAMs-Bildgebung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Dissektion des Shooting apex
<ol><li>Dissektion des Blütenstandes Shooting apex<ol>
<li>Geschnitten Sie die Blütenstand Shooting Spitze zusammen mit 1-2 cm Hauptstamm aus verschraubten Arabidopsis -Pflanzen mit einer Rasierklinge. Halten Sie den basalen Teil des Haupttriebes und entfernen Sie möglichst viele ältere Blume Organe wie möglich aus den Hauptstamm durch sezieren, die fruchtbaren mit Schmuck Pinzette. Achtung: Vermeiden Sie schneiden Finger bei der Verwendung einer Rasierklinge. Entsorgen Sie gebrauchte Rasierklingen zu einer richtigen Scharfbehälter.</li>
		<li>Halten Sie den beigefügten Stiel des Apex Shooting mit Schmuck Zange oder Finger auf dem Gebiet der Stereomikroskop, weiter, den Rest der Blüten zu entfernen, bis fast die ganze SAM von den Okularen betrachtet werden kann. Entfernen Sie fruchtbaren eindeutig an der Kreuzung des Haupttriebs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissektion des vegetativen Shooting apex<ol>
<li>Zum Anzeigen der vegetativen SAMs aus Tomaten oder Soja sezieren, die Keimblätter, Blätter und Wurzeln der Pflanzen.</li>
		<li>Halten Sie die Hypocotyle der Pflanzen unter dem Stereomikroskop und weiter zu sezieren Sie, die Leaf Primordia deckt die vegetativen SAMs mit Schmuck Pinzette.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Färbung
<ol><li>Um Zellen in SAMs direkt sichtbar zu machen, verwenden Sie frisch zubereitete Propidium Jodid (PI) Lösung, um Zellwände zu beflecken. Lösen Sie PI-Pulver in sterilen, deionisiertes Wasser auf, 1mL PI Färbelösung bei der Konzentration von 1 mg/mL und speichern Sie die PI-Lösung in Microcentrifuge Schlauch mit Aluminiumfolie abgedeckt.</li>
	<li>Pipette 50 µL-PI-Lösung in einem sauberen und leere Petrischale und Dip die gesamte seziert schießen Apex in Farbstoff für 2 min. Spülen gefärbten Shooting Apex zweimal in sterilen, deionisiertes Wasser. Tauchen Sie bei der Färbung die ganze Blütenstand SAM oder vegetativen SAM in die PI-Lösung, die einheitliche Färbung zu erreichen.</li>
</ol>5. die Bildsammlung
Hinweis: für diese Methode, alle die SAMW sind abgebildet mit einem aufrechten confocal Mikroskop und mit 20 x Objektiv Wasser eintauchen. Wie in anderen Protokollen9,12,13,15beschrieben, ist es auch möglich, Bild mit einem inversen Mikroskop SAMs. Darüber hinaus kann die live Bildgebung mit verschiedenen Marken von konfokalen Mikroskopen mit der gleichen Probe vorbereitenden Maßnahmen erreicht werden. In dieser Studie sind die bildgebenden Schritte im Detail exemplarisch beschrieben.
<ol><li>Stechen Sie ein Loch in der Mitte ein bildgebendes Gericht mit Pinzette und halten Sie gefärbten Shooting Apex im Medium aufrecht.</li>
	<li>Steril, deionisiertes Wasser komplett eintauchen die Probe füllen Sie die bildgebende Schüssel ein. Aus dem Stereo-Mikroskop betrachten, gefangen Pipette rauf und runter, um Luftblasen zu entfernen um die Meristem. Dann stellen Sie den Winkel des Vorbaus im Agar um sicherzustellen, dass die SAM direkt oberhalb von vollständig zu sehen ist.</li>
	<li>Ort der bildgebenden Gericht auf der Probe-Bühne des confocal Mikroskop. Heben Sie Probe Mikroskoptisch zu lassen, die Spitze der Linse Dip ins Wasser und senken Sie Wasser eintauchen Objektiv.</li>
	<li>Öffnen Sie die confocal Mikroskop-Software und suchen Sie die SAM im Hellfeld in die Okulare. Bewegen Sie der SAM Probe direkt unter das Objektiv durch die Justage der XY-Regler, dann konzentrieren Sie sich auf die SAM aus Okulare durch vorsichtig anpassen des Z-Controllers.</li>
	<li>Die Übernahme-Funktion in der konfokalen Mikroskop-Software zu betreiben (siehe Tabelle der Materialien), Start der Live-Modus , um die Probe aus dem Computer-Bildschirm anzeigen, und richten Sie alle Parameter für die Laser-scanning-Experiment.<ol>
<li>Wenn Sie die Parameter anpassen, Reichweitenanzeige Funktion festlegen, ob das Signal oder nicht gesättigt ist.</li>
		<li>Optional, wendet die Wiederverwendung Funktion um die Parameter-Einstellungen aus der ausgewählten konfokale Datei neu zu laden. Hinweis: Parameter Bildgebung vorgeschlagen: Laser-Linie (Anregung): 515 nm oder 561 nm; Emission 570-650 nm; Lochkamera: 1 luftig Einheit (AU); Gewinn: 600-750-Scan-Modus: Rahmen; Rahmenhöhe: 512 X 512 oder 1024 X 1024; Scan-Geschwindigkeit: 7 bis Max; Abtastrichtung: Bi-Richtung; Durchschnittlichen Anzahl: 2-4; Im Durchschnitt Methode: bedeuten; Bit-Tiefe: 16-Bit; Scan-Intervall: 0,5-1 µM. Weiter, all diese Parameter basierend auf der Art verschiedene Pflanzenproben und bildgebenden Bedürfnisse zu optimieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Bildbearbeitung
<ol><li>Zur Visualisierung von optischen orthogonal und quer Schnittansichten, verwenden Sie die gleiche kommerzielle Software für die Bildbearbeitung Erwerb. Öffnen Sie die Originaldatei konfokale, ortho Menü, wählen Sie ortho. Wählen Sie dann entweder X-Position, y-Position und z position des Bildes, und speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien.<ol>
<li>Wählen Sie optional 3D Abstandsfunktion die räumliche Distanz zwischen zwei Punkten zu definieren, die aus dem Stapel der konfokalen Bilder ausgewählt wurden.</li>
		<li>Alternativ können Sie Fidschi/Bild J, das offene Ressource Bild Verarbeitung-Paket, die orthogonal und quer Schnittansichten zu visualisieren.</li>
		<li>Öffnen Sie die Originaldatei konfokale mit Fidschi, klicken Sie auf Menü "Bild", wählen Sie Stapel und dann Draufsichten.</li>
		<li>XY, YZund XZ Ebenen in die mittlere Position auswählen und als Bilder im TIFF-Format speichern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zur Visualisierung einer transparente 3D-Projektion, verwenden Sie die gleiche Software.<ol>
<li>Öffnen Sie die Originaldatei konfokale, klicken Sie auf 3D Menü, und wählen Sie Transparent , erstellen Sie eine Projektionsansicht 3D.</li>
		<li>Klicken Sie optional auf 3D Menü, wählen Sie aussehenund dann Transparenz , drei Parameter der einschließlich Schwelle, Rampe und maximale Transparenz der 3D Projektion Bild.</li>
		<li>Klicken Sie auf 3D Menü, wählen Sie aussehen, und Licht , die Helligkeit des 3D Bildes einzustellen.</li>
		<li>Exportieren Sie die projizierten Bilder und speichern Sie sie als TIFF-Dateien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zur Visualisierung von 3D Beihilfehöchstintensität Projektion, öffnen Sie die konfokalen Dateien mit der gleichen Software zu, und klicken Sie auf das 3D-Menü.<ol>
<li>Wählen Sie 3D Menü und maximale.</li>
		<li>Alternativ können Sie Fidschi/Bild J, um eine maximale Intensität 3D Projektion zu visualisieren.</li>
		<li>Öffnen Sie die Originaldatei konfokale mit Fidschi, klicken Sie auf Menü "Bild" und wählen Sie Stapel aus.</li>
		<li>3D Projekt auswählen und als Bilder im TIFF-Format speichern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zur Visualisierung der Tiefe Blick auf die 3D-Bilder-Codierung, verwenden Sie die gleiche Software.<ol>
<li>Im 3D Menü und wählen Sie im Erscheinungsbild.</li>
		<li>Wählen Sie spezielle und Tiefe Kodierung.</li>
		<li>Alternativ können Sie Fidschi/Bild J, um die Tiefe Ansicht-Codierung zu visualisieren.</li>
		<li>Öffnen Sie die konfokalen Dateien zu, klicken Sie auf Menü "Bild", wählen Sie Hyperstack.</li>
		<li>Wählen Sie Temporal - Farbcode und als Bilder im TIFF-Format speichern. Hinweis: Die Tiefe Codierung Z-Stapel kann auch durch das Plugin Z-Code-Stack für Fidschi erreicht werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zur Visualisierung von 3D Drehung Ansicht wie gezeigt (Film 1 und Film 2), die gleiche Software verwenden (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Öffnen Sie die konfokalen Dateien, klicken Sie auf 3D Menüund wählen Sie Serie.</li>
		<li>Wählen Sie Serie zu machen, und wählen Sie eine der vier Optionen einschließlich X umdrehen, umdrehen y, Start- und Enddatumund Positionsliste.</li>
		<li>Speichern Sie die Render-Serie als AVI-Dateien.</li>
		<li>Alternativ können Sie Fidschi/Bild J die 3D-Drehung Ansicht zu visualisieren.</li>
		<li>Öffnen Sie die Originaldatei konfokale mit Fidschi, klicken Sie auf Menü "Bild"und wählen Sie Stapel aus.</li>
		<li>Wählen Sie 3D Projekt aus und speichern Sie als AVI-Format Videos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+cell+division+patterns+in+developing+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic control of cell division patterns in developing plants.</a> Cell. 88 (3), 299-308 (1997).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+arabinosyltransferases+controls+shoot+meristem+size+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato.</a> Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).</li>
<li>Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+variation+in+maize+kernel+row+number+is+controlled+by+the+FASCIATED+EAR2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus.</a> Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).</li>
<li>Je, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+maize+organ+primordia+via+FASCIATED+EAR3+regulates+stem+cell+proliferation+and+yield+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits.</a> Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).</li>
<li>Ping, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dt2+is+a+gain-of-function+MADS-domain+factor+gene+that+specifies+semideterminacy+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean.</a> Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).</li>
<li>Vaughan, J. G., Jones, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+angiosperm+inflorescence+apex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the angiosperm inflorescence apex.</a> Nature. 171, 751(1953).</li>
<li>Sijacic, P., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+from+live-imaging+in+shoot+meristem+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel insights from live-imaging in shoot meristem development.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).</li>
<li>Tax, F. E., Durbak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meristems+in+the+movies%3A+live+imaging+as+a+tool+for+decoding+intercellular+signaling+in+shoot+apical+meristems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems.</a> Plant Cell. 18 (6), 1331(2006).</li>
<li>Grandjean, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+cell+division%2C+cell+growth%2C+and+differentiation+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).</li>
<li>Heisler, M. G., Ohno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).</li>
<li>Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+to+study+cell+division+orientation+in+the+Arabidopsis+shoot+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).</li>
<li>Prunet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+Imaging+of+developing+Arabidopsis+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55156(2017).</li>
<li>Prunet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+imaging+of+Arabidopsis+flower+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds.</a> Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).</li>
<li>Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+reveals+oriented+cell+divisions+associated+with+morphogenesis+at+the+shoot+apex+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131, 4225-4237 (2004).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Shoot+Meristems+on+an+Inverted+Confocal+Microscope+Using+an+Objective+Lens+Inverter+Attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 773(2017).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAIRY+MERISTEM+with+WUSCHEL+confines+CLAVATA3+expression+to+the+outer+apical+meristem+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers.</a> Science. 361 (6401), 502-506 (2018).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+plant+stem+cell+function+by+conserved+interacting+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators.</a> Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stem+cell+maintenance+by+transcriptional+cross-regulation+of+related+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases.</a> Development. 142 (6), 1043(2015).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEAFY+Controls+Auxin+Response+Pathways+in+Floral+Primordium+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation.</a> Science Signaling. 6 (270), ra23(2013).</li>
<li>Truernit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-mount+imaging+of+three-dimensional+tissue+organization+and+gene+expression+enables+the+study+of+phloem+development+and+structure+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschreiben wir eine einfache bildgebende Methode, die für die Untersuchung von Shoot Sprossapikalmeristem Meristeme aus unterschiedlichen Werken mit geringfügigen Änderungen angewendet werden kann öffnen einen neuen Weg um die Meristem-Verordnung an den vegetativen und reproduktiven Stadien in Modellpflanzen zu studieren und Pflanzen. Im Gegensatz zu die SEM und histologische Färbung Methoden helfen dieses Protokolls Oberflächenansicht und interne Zellstrukturen von SAMs, ohne die Notwendigkeit für arbeitsintensive...

Die Pflanze Meristem enthält einen Pool von undifferenzierten Stammzellen und kontinuierlich erhält die Orgel Pflanzenwachstum und Entwicklung1. Während der postembryonic Entwicklung stammen fast alle oberirdischen Gewebe einer Pflanze aus schießen Sprossapikalmeristem Meristem (SAM). In Kulturen sind die Aktivität und die Größe des SAM und seine abgeleiteten floral Meristeme viele agronomischen Eigenschaften wie Shooting Architektur, Obstbau und Samen Ertrag fest zugeordnet. Beispielsweise führt eine vergrößerte SAM in Tomate, eine Zunahme der schießen und Blütenstand Verzweigungen und damit Ergebnisse bei der Schaffung von zusätzlichen Blüte und Frucht Organe2. Bei Mais führt eine Zunahme SAM Größe zu einer höheren Ausgangszahl und Gesamtausbeute3,4. In Soja Meristem Unbestimmtheit ist auch eng verbunden mit der Shooting-Architektur und5.
Die Morphologie und Anatomie von SAMs können durch verschiedene Methoden, einschließlich der histologischen Schnitt/Färbung und Rasterelektronenmikroskopie (SEM)6, Scannen charakterisiert werden, die beide Meristem-Forschung durch die Bereitstellung von stark fortgeschrittenen haben die Schnittansicht oder eine dreidimensionale (3D) Oberflächenansicht von SAMs. Beide Methoden sind zeitaufwendig, an denen mehrere experimentelle Schritte von der Probenvorbereitung für die Datenerfassung, jedoch und diese Methoden hängen vor allem von örtlich festgelegten Proben. Jüngste Fortschritte in der Laser-scanning-Technik der konfokalen Mikroskopie haben diese Grenzen überwinden und uns ein mächtiges Werkzeug, um die Zellstruktur und Entwicklungsprozess des pflanzlichen Geweben und Organen7,8zu untersuchen. Durch optische anstatt physische Gewebe strukturierendes, konfokale Mikroskopie ermöglicht die Sammlung eine Reihe von Z-Stapel Bilder und die anschließende 3D-Rekonstruktion der Probe durch Bildanalyse-Software.
Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Untersuchung sowohl innen und Oberflächenstrukturen des lebendigen SAMs aus verschiedenen Pflanzenarten mit Laser-scanning-konfokalen Mikroskopie, wodurch potentiell Forscher, die experimentell zu erreichen Prozesse innerhalb von 20 Minuten. Anders als bei anderen veröffentlichten Methoden für live konfokale Abbildung von Arabidopsis Blütenstand SAMs9,10,11,12,13,14, 15 und Arabidopsis Blumen12,13, hier zeigen wir, dass dieses Protokoll ist sehr effizient für das Studium nicht nur den Blütenstand Meristeme der Modell-Arten, sondern auch die vegetativen schießen Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Kulturen, wie Tomaten und Soja. Diese Methode setzt nicht auf transgene fluoreszierenden Marker und kann potenziell angewendet werden, um das Shooting Meristeme aus vielen verschiedenen Arten und Sorten zu studieren. Darüber hinaus führen wir auch einfache Bildverarbeitung Schritte zum Anzeigen und analysieren von verschiedenen SAMs in einer 3D-Ansicht. Zusammengenommen wird diese einfache Methode Forscher besser zu verstehen, die Struktur und Entwicklungsprozess des Meristeme von Modellorganismen und Kulturen erleichtern.

<table><tbody><tr><td>Agar Phyto</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>DSA20300-1000</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4955</td><td>Dumont #5SF Superfeine Pinzette Inox-Spitze Größe .025 x .005 mm, zum Präparieren von Sprossspitzen.</td></tr><tr><td>LSM 880 aufrechtes konfokales Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog MS medium</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>DSM10200-50</td><td></td></tr><tr><td>Plan APO 20x/1.1 Wassertauchlinse</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen aus Kunststoff 100 mm X 15 mm</td><td>CELLTREAT Scientific Produkte</td><td>229694</td><td>Verwendung als Herstellung von MS-Platten</td></tr><tr><td>Petrischalen aus Kunststoff60 mm X 15</td><td>CELLTREAT Scientific Produkte</td><td>229665</td><td>Verwendung als Bildgebungsschalen</td></tr><tr><td>Vermehrungsmischung</td><td>Sungro Gartenbau</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Acros Organics</td><td>440300250</td><td>1 mg/ml Lösung in Wasser, um die Zellwände zu färben</td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>PERSONNA</td><td>62-0179</td><td>Zum Schneiden von Triebspitzen von Pflanzen</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Zen schwarz</td><td>Zeiss</td><td>Bilderfassungssoftware</td><td></td></tr></tbody></table>

konfokale live imaging von shoot sprossapikalmeristem meristeme aus verschiedenen pflanzenarten

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Die schießen Sprossapikalmeristem Meristem (SAM) Funktionen wie einem konservierten Stammzell-Reservoir und es erzeugt fast alle oberirdischen Gewebe während der postembryonic Entwicklung. Die Aktivität und Morphologie von SAMs bestimmen wichtige agronomische Merkmale, wie schießen Architektur, Größe und Anzahl der Geschlechtsorgane, und vor allem Kornertrag. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Analyse der Morphologie der Oberfläche und die internen Zellstruktur des lebendigen SAMs aus verschiedenen Arten durch Laser-scanning-confocal Mikroskop. Das gesamte Verfahren von der Probenvorbereitung für den Erwerb von dreidimensionalen (3D) Bilder mit hoher Auflösung erreicht werden kann, innerhalb von 20 Minuten. Wir zeigen, dass dieses Protokoll ist für das Studium nicht nur der Blütenstand SAMs die Modell-Arten, sondern auch die vegetativen Meristeme aus verschiedenen Kulturen, bietet eine einfache, aber leistungsstarkes Tool zur Untersuchung der Organisation und Entwicklung von hocheffizienten Meristeme über verschiedene Pflanzenarten.

Um die Effizienz unseres Protokolls zu bewerten und die Morphologie der Meristeme verschiedener Arten zu erkunden, haben wir die konfokale live-imaging-Experimente an der Blütenstand Meristem von Arabidopsis und die vegetative Meristeme aus ausgeführt. Tomaten und Soja. In dieser Studie, Arabidopsis Ökotyp Landsberg Erecta, Tomaten Sorte Micro-Tom und Sojabohnen Sorte worden Williams 82 als Beispiele benutzt.
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Dieses Protokoll stellt Informationen zum live-Bild und analysieren schießen Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Pflanzenarten mit Laser-scanning-konfokalen Mikroskopie.

Konfokale Live Imaging von Shoot Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Pflanzenarten

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Schießen Sie apikale Meristems steuern Pflanzenwachstum und Fortpflanzung. Diese Methode hilft uns, die Morphologie und die inneren Strukturen von Trieb-apikalen Meristems nicht nur in den Modellarten, sondern auch in verschiedenen Kulturen zu untersuchen. Diese Technik ist ein sehr effizientes Verfahren.Shoot apical Meristem kann direkt in einer hohen zellulären Auflösung ohne arbeitsintensive Probenfixierung und Gewebeschnitt Schritte visualisiert werden. Zunächst wachsen Arabidopsis, Tomaten- und Sojapflanzen, wie im Textprotokoll beschrieben. Schneiden Sie den Blütenstand Schießen Spitze aus den verschraubten Arabidopsis Pflanzen.Halten Sie den Basalteil des Hauptstamms und verwenden Sie Zangen, um so viele ältere Blütenorgane wie möglich aus dem Hauptstamm zu entfernen. Entfernen Sie weiterhin die restlichen Blumen im Bereich des Stereomikroskops, bis das schießende apikale Meristem von den Okularen aus betrachtet werden kann. Um den vegetativen Trieb apikalmer meristems von Tomaten oder Sojabohnen zu sehen, sezieren Sie die Kotyledonen, Blätter und Wurzeln aus der Pflanze.Halten Sie die Hypocotyle der Pflanze unter dem Stereomikroskop, und verwenden Sie Zangen, um die Blätter und Blattprimordien, die die vegetativen Trieb eapikalen Meristems bedecken, weiter zu sezieren. Pipette 50 Mikroliter Propidiumjodidlösung in einer sauberen und leeren Petrischale. Tauchen Sie die gesamte sezierte Triebspitze für zwei Minuten in Farbstoff.Tauchen Sie während des Färbevorgangs den gesamten Blütenstand ein, der apikale Meristem oder vegetative Trieb-Apische in die Propidiumjodidlösung schießt, um eine gleichmäßige Färbung zu erreichen. Spülen Sie den gefärbten Triebspitze zweimal in sterilem, entionisiertem Wasser. Nun durchbohren Sie ein Loch in der Mitte einer vorbereiteten bildgebenden Schale mit Zangen, und kleben Sie die gefärbte Triebspitze aufrecht in das Medium.Füllen Sie die bildgebende Schale mit sterilem, entionisiertem Wasser, um die Probe vollständig einzutauchen. Sehen Sie sich die Probe durch das Stereomikroskop an. Pipette nach oben und unten, um Luftblasen zu entfernen, die um das Meristem gefangen sind.Passen Sie dann den Winkel des Stiels im Agar an, um sicherzustellen, dass der Trieb-Apische Meristem von direkt von oben vollständig sichtbar ist. Platzieren Sie nun die Bildform auf der Probenstufe des konfokalen Mikroskops. Senken Sie die wassertauchende Linse, und heben Sie die Mikroskop-Probestufe, um die Linsenspitze ins Wasser tauchen zu lassen.Öffnen Sie die konfokale Mikroskop-Software, und verwenden Sie die Okularen, um den Schieß-Apischen Meristem im hellen Feld zu lokalisieren und zu fokussieren. Betreiben Sie die Erfassungsfunktion in der konfokalen Mikroskopsoftware. Starten Sie den Live-Modus, um das Beispiel vom Computerbildschirm aus anzuzeigen, und richten Sie alle Parameter für das Laserscanexperiment ein.Verwenden Sie beim Anpassen der Parameter die Funktion Bereichsanzeige, um zu definieren, ob das Signal gesättigt ist oder nicht. Die gleiche Software, die für die Bildaufnahme verwendet wurde, kann zur Visualisierung einer dreidimensionalen transparenten Projektion verwendet werden. Öffnen Sie die ursprüngliche konfokale Datei, klicken Sie auf das 3D-Menü, und wählen Sie Transparent aus, um eine 3D-Projektionsansicht zu generieren.Wählen Sie optional Transparenz aus, um drei Parameter der Projektion anzupassen, einschließlich Schwellenwert, Rampe und Maximum für die Transparenz des 3D-Bildes. Wählen Sie nun Licht aus, um die Helligkeit des 3D-Bildes anzupassen. Exportieren Sie die projizierten Bilder, und speichern Sie sie als TIFF-Dateien.Verwenden Sie dieselbe Software, um die Tiefencodierungsansicht der 3D-Bilder zu visualisieren. Klicken Sie erneut auf das 3D-Menü, und wählen Sie Aussehen aus. Wählen Sie Spezial aus, und wählen Sie Tiefencodierung aus.Exportieren Sie die projizierten Bilder, und speichern Sie sie als TIFF-Dateien. Dieses Bild aus dem orthogonalen Abschnitt durch die Mitte des Arabidopsis-Schießens zeigt, dass die horizontalen Wände in fast allen Zellen in mehreren Zellschichten mit Propidiumjodid befleckt sind. Ein Blick auf einen Querschnitt durch den Korpus des Blütenstandesschießens zeigt, dass die Zellen aus der XY-Ebene ebenfalls klar abgebildet sind.Die 3D-Projektionsansicht zeigt, dass das Blütenstand-Meristem eine kuppelartige Struktur bildet und von der sich entwickelnden Blütenprimordia umgeben ist. Dieses Bild aus dem orthogonalen Abschnitt durch die Mitte des Tomatentriebs apischen Meristem zeigt auch, dass die horizontalen Wände mit Propidiumjodid an mehreren Zellschichten gefärbt sind, obwohl das Propidiumiodidsignal aus dem tiefen Inneren etwas niedriger ist. Ein Bild aus einem Querschnitt durch die tiefen Schichten des vegetativen Trieb-Apischen Meristamms zeigt die Zellen der XY-Ebenen und die Grenze zwischen dem vegetativen Meristem und der Blattprimordia.Die 3D-Projektionsansicht kann darüber hinaus einen umfassenden Überblick über die Form und Organisation des vegetativen Meristes aus Tomaten bieten. Hier ist eine orthogonale Ansicht durch die Mitte des Sojabohnen-Schießens apikalmeristem und eine 3D-Projektion des gleichen Trieb apischen Meristem gezeigt. Das kuppelartige vegetative Meristem und seine abgeleiteten neuen Blattprimordien sind ebenfalls beobachtbar.Propidiumiodid kann leicht beschädigte oder abgestorbene Zellen färben, was die Qualität der Bilder stark beeinflussen wird, daher ist es wichtig, bei der Vorbereitung von apikalen Meristemproben zu vermeiden, dass es keine physischen Schäden verursacht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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