Neuartiges Protokoll zur Generierung physiologischer immunogener Dendritischer Zellen

Physiologische dendritische Antigen-präsentierende Zellen, phDC, sind die Immunmaster-Schalter, die antigenspezifische T-Zell-Immunität und Toleranz initiieren. Dieses Papier skizziert eine effiziente Methode zur Herstellung von PhDC. Die klinische Verwendung von dendritischen Zellen wird durch die nicht-physiologischen Zytokinmethoden behindert, die zu ihrer Herstellung verwendet werden.

Unsere Methode überwindet dieses Problem durch effiziente Thrombozytensignalisierung der Monozyten-DC-Umwandlung bei Menschen und Mäusen. Diese PhDC sind nicht abhängig von Zytokin-Bedingungen nicht verfügbar in vivo, so können sie starke klinische Anti-Tumor-T-Zell-Antworten bei Menschen und Mäusen mit etablierten Krebs erzeugen. Die artunabhängige Thrombozyteninitiierung der Monozyten-zu-PhDC-Reifung hat eine breite experimentelle Anwendbarkeit.

PhDC erlauben die Zerlegung der dendritischen Zellphysiologie, erleichtern die Induktion der therapeutischen Anti-Krebs-Immunität gegen immunogene Krebsarten und versprechen eine personalisierte antimikrobielle Impfung. Dieses experimentelle System ist neu, und mehrere Aspekte davon wie Beschichtung der Kunststoffkammer, Tumorzellbehandlung mit 8-MOP/UVA, Strömungsbedingungen und Freisetzung von Monozyten sind am besten visuell dargestellt. Die Demonstration des Verfahrens wird Eve Robinson, eine Technikerin aus meinem Labor sein.

Um periphere mononukleäre Blutzellen zu sammeln, richtete zunächst eine 15-Milliliter-Röhre mit vier Milliliter Lymphozyten-Isolationsmedium pro fünf bis zehn Mäuse blutete ein. Dann langsam Schicht Blut von tumortragenden Mäusen auf dem Medium gesammelt. Drehen Sie die Zellen bei 1 000-bis 1, 500-mal-G für 20 Minuten, um die PBMCs von roten Blutkörperchen zu trennen.

Am Ende der Zentrifugation, sammeln Sie die obere Plasmaschicht, so dass 0,5 Milliliter über dem buffy Mantel bleiben, und lagern bei vier Grad Celsius für die spätere Verwendung. Als nächstes sammeln Sie die buffy Schicht in einem sauberen 15-Milliliter-Rohr mit PBS bis 15 Milliliter gefüllt, und drehen Sie bei 250-mal-G in einer Standard-Gewebekultur Zentrifuge für 10 Minuten, um die PBMC zu sammeln. Am Ende der Zentrifugation, sorgfältig Pipette aus dem Überstand und flicken sie das Rohr, um das Pellet wieder aufzuhängen.

Fügen Sie dann zwei Milliliter ACK rote Blutkörperchen Lyse Puffer in die Röhre, um alle verbleibenden roten Blutkörperchen aus dem PBMC zu entfernen. Die PBMC 10 Minuten auf Eis bebrüten. Füllen Sie das Rohr mit PBS auf 15 Milliliter, und drehen Sie bei 250-mal-G in einer Standard-Gewebekultur Zentrifuge für 10 Minuten, um die PBMC zu sammeln.

Sorgfältig Pipetten aus dem Überstand und streichen Sie das Rohr, um das Pellet zu lösen. Das Pellet in 300 Mikroliter FBS wieder aufhängen. Um YUMM1.7 Tumorzellen pro Behandlungsgruppe vorzubereiten, setzen Sie zunächst das Tumorzellpellet in FBS bei 2,5 Millionen Zellen pro 300 Mikroliter wieder aus.

Wenn die Gewebekulturhaube ausgeschaltet ist, fügen Sie 8-Methoxypsoralen für eine Endkonzentration von 100 Nanogramm pro Milliliter zur YUMM1.7 Tumorzellsuspension hinzu. Als nächstes mischen Sie die Zellen, wickeln Sie den Zellbehälter in Folie und brüten bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Um eine 12-Well-Gewebekulturplatte vorzuschichten, fügen Sie einen Milliliter FBS zu einem Brunnen für jede Behandlungsgruppe von fünf Mäusen hinzu und kühlen Sie die Platte bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.

Nach 20 Minuten, unter einer Gewebekulturhaube, FBS aus den Brunnen entfernen und 300 Mikroliter Methoxypsoralen-exponierte Tumorzellen pro Brunnen hinzufügen. Dann setzen Sie die zellhaltige Platte der vorgewärmten ultravioletten Lichtquelle A für eine Gesamtbestrahlung von vier Joule pro Quadratzentimeter aus. Um 8-Methoxypsoralen/UVA-behandelte Tumorzellen aus jedem Brunnen zu sammeln, wirbeln Sie die Platte und die Pipette sorgfältig, um eine vollständige Zellerholung zu gewährleisten.

Um für jede Behandlungsgruppe von fünf Mäusen einen Transimmunisierungsplattendurchgang durchzuführen, kombinieren Sie 300 Mikroliter des entsprechenden PBMC und 300 Mikroliter 8-Methoxypsoralen/UVA-behandelte Tumorzellen in einem 1,5-Milliliter-Konikonröhre und mischen die Zellen. Öffnen Sie anschließend die Ein- und Ausstiegsschläuche der TI-Platte. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, um die TI-Schläuche mit FBS zu füllen, und schließen Sie die Klemmen, während der Schlauch gefüllt wird, um FBS in den Schläuchen zu behalten.

Trennen Sie die Spritze. Legen Sie eine P1000 Pipettenspitze sicher in die TI-Plattenaufnahme. Halten Sie die Platte in einem 45-Grad-Winkel und füllen Sie die Platte langsam mit PBMC und Tumorzellenmischung, wodurch Blasen vermieden werden.

Entfernen Sie die Pipettenspitze aus der Aufnahme, bevor Sie den Pipettenkolben loslassen. Geben Sie die verbleibenden Zellen in die 1,5-Milliliter-Konustube zurück. Inkubieren Sie die FBS-gefüllten Schläuche, die zellgefüllte TI-Platte und die 1,5-Milliliter-Konustube mit den verbleibenden Zellen im Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.

Nach der Inkubation die Klemmen loslassen und die TI-Schläuche durch Schwerkraft entleeren. Legen Sie dann eine P1000 Pipettenspitze mit dem Kolben in den Plattenanschluss ein, um die Zellen von der TI-Platte zu entfernen. Halten Sie die Platte in einem 45-Grad-Winkel und füllen Sie die P1000 Pipettenspitze.

Legen Sie die Zellen wieder in ihre ursprüngliche 1,5-Milliliter-Konustube. Um die TI-Platte zu betreiben, schließen Sie das Austrittsrohr an die Platte an und befestigen Sie die TI-Platte im plattenlaufenden System. Als nächstes, mit einer Ein-Milliliter-Spritze, erstellen Sie diese 600 Mikroliter PBMC und Tumor-Zell-Mix aus dem 1,5-Milliliter konischen Rohr.

Befestigen Sie die Spritze mit geöffneter Klemme am Eingangsrohr und füllen Sie sie langsam, bis die Flüssigkeit das Ende des Schlauches erreicht. Befestigen Sie das freie Ende des Eingangsrohres an der TI-Platte und laden Sie das restliche Volumen vorsichtig weiter. Schließen Sie die Eingangsklemme, wenn Sie fertig sind.

Lösen Sie die Ein-Milliliter-Spritze und schließen Sie den Eingangsschlauch an die Spritzenpumpe an. Sichern Sie den Austrittsschlauch an einem sauberen 1,5-Milliliter konischen Rohr für die Zellsammlung. Stellen Sie den Spritzenpumpendurchfluss auf 0,09 Milliliter pro Minute ein.

Neigen Sie die TI-Platte mit einer TI-Plattenlaufplattform um etwa 30 Grad zur Spritzenpumpenseite. Lösen Sie die Klemme vorsichtig an den Eingangsschläuchen. Starten Sie die Spritzenpumpe und beobachten Sie sorgfältig, wie die TI-Platte gefüllt wird.

Sobald die TI-Platte vollständig gefüllt ist, kippen Sie sie beim Leeren etwa 30 Grad in die entgegengesetzte Richtung. Wenn sich alle Zellen in der Flüssigkeit im 1,5-Milliliter-Konus-Sammelrohr befinden, stoppen Sie die Pumpe. Um die TI-Platte zu waschen, trennen Sie den Eingangsschlauch von der Spritzenpumpe und schließen Sie ihn an eine Ein-Milliliter-Spritze an, die mit 600 MikroliterFBS gefüllt ist.

Füllen, bis FBS vollständig geladen ist. Trennen Sie dann die Spritze und befestigen Sie den Schlauch an der Spritzenpumpe. Stellen Sie den Spritzenpumpendurchfluss auf 0,49 Milliliter pro Minute ein.

Lösen Sie die Eingangsklemme, und führen Sie die TI-Platte, die Die Wäsche in der gleichen 1,5-Milliliter konischen Rohr sammeln. Flick oder tippen Sie die TI-Platte sanft die ganze Zeit, um beim Lösen und Eluieren von anhaftenden Zellen zu helfen, wie die Platte leert. Trennen Sie die Sammlung 1,5-Milliliter konische Rohr von der TI-Platte Setup.

Drehen Sie das Sammelrohr in der Banktop-Mikrofuge bei 250-mal-G für acht Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Um über Nacht eine Ko-Inkubation von PBMC mit Antigen durchzuführen, setzen Sie zunächst das PBMC- und Tumorzellpellet in zwei Millilitern klarem RPMI, ergänzt mit 15% autologem Mausserum, wieder auf. Dann behandelten Plattenzellen in einer 35-Millimeter-Nicht-Gewebekultur sterile Schale und brüten über Nacht unter Standard-Gewebekulturbedingungen.

Am nächsten Tag alle anhaftenden Zellen vorsichtig von der Unterseite der Schale mit einem Tissue-Kultur-Schaber lösen. Drehen Sie die Schale beim Schaben, um eine gleichmäßige Zellsammlung zu gewährleisten. Sammeln Sie die Zellen in einer 15-Milliliter-Röhre.

Fügen Sie zwei Milliliter PBS in die Schale, und wiederholen Sie den Abkratzschritt, sammeln Sie die Zellen in die gleiche Röhre. Spülen Sie die 35-Millimeter-Schale mit einem Milliliter PBS, und fügen Sie die Spülung in das gleiche Rohr. Drehen Sie bei 250-mal-G in einer Standard-Gewebekulturzentrifuge für 10 Minuten, um die Zellen zu sammeln.

Sorgfältig Pipetten aus dem Überstand, dann ziehen Sie das Rohr, um das Pellet wieder aufzuhängen. Die Therapie zeigte eine Reduktion des YUMM1.7 Tumorwachstums bei mehr als 100 behandelten versus kontrollierbaren Mäusen, wie in den kumulativen Tumorwachstumsdaten von neun unabhängigen Experimenten über zwei Jahre beobachtet. Die repräsentativen Tumorwachstumskurven für einzelne Tiere in einem Experiment vermitteln ein Gefühl der Variabilität im System.

Wenn entweder Monozyten oder Thrombozyten aus der PBMC-Fraktion aufgebraucht sind oder wenn der Plattendurchgang weggelassen wird, wird die therapeutische Wirkung nicht mehr beobachtet. Die Behandlung ist unwirksam, wenn entweder die Immunzellen oder eine Antigenquelle fehlen, oder in Gegenwart eines nicht übereinstimmenden Antigens, wie YUMM1.7-Tumoren, die mit MC38-Dickdarmkarzinomzellen behandelt werden. Für ein immunisierendes Ergebnis ist es auch wichtig, eine PBMC-Exposition gegenüber 8-Methoxypsoralen zu vermeiden.

Die FACS-Analyse der Veränderung der angegebenen Marker aus entsprechenden IgG-Kontrollen in menschlichen CD11c+Zellen zwischen entweder frisch isoliertem PBMC, TI-behandeltem PBMC, TI-behandeltem PBMC ohne Plattendurchgang, erschöpften Thrombozyten vor dem Plattendurchgang oder beides der oben genannten, zeigte, dass die DC-Aktivierung vom Vorhandensein von Thrombozyten im PBMC und von TI-Plattendurchgang abhängt. Die TI-aktivierten menschlichen DCs können entweder Peptid-Antigene oder Antigene aus ganzen 8-Methoxypsoralen-exponierten menschlichen Tumorzellen effektiv verarbeiten und kreuzpräsentieren, um menschliche antigenspezifische T-Zelllinien in In-vitro-Assays in einer TI- und Thrombozytenabhängigen Weise zu aktivieren. Die Spezifität der T-Zell-Antworten hängt von der Quelle der verarbeiteten Antigene ab.

Bei der Induktion der Anti-Krebs-Immunität muss die Apoptose jeder Krebszelllinie titriert werden, um die Immunogenität zu maximieren. Da die induzierte Immunität spezifisch für die Immunisierung von Antigenen sein wird, wird eine detaillierte Zerlegung jedes Systems möglich sein. Jeder experimentelle oder klinische Krebs und jede antimikrobielle Reaktion werden einzigartig informativ sein.

Jeder einzelne menschliche Krebs hat seine eigene Reihe von tumorspezifischen Antigenen. Das PhDC führt die notwendige Sortierung und Darstellung von Tumorantigenen durch, ohne dass eine vorherige Laboridentifikation erforderlich ist. Bitte beachten Sie, dass 8-MOP- und UVA-Licht krebserregend sind.

Verwenden Sie geeignete Schutzausrüstung und befolgen Sie die Sicherheitsverfahren bei der Handhabung von 8-MOP und bei der Arbeit mit UVA-Lichtquellen.