Name: Grenzflächenphysikalische Strukturen von Polymeren und Biomakromolekülen, die über sum frequency generation Vibrational Spectroscopy aufgedeckt werden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Entdecken Sie die Grenzflächenphysik von Polymeren und Biomakromolekülen mittels Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Diese nicht-invasive optische Methode ermöglicht die Untersuchung von Kettenkonformationen und sekundären Strukturänderungen an verschiedenen Grenzflächen.

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Diese Studie wurde vom State Key Development Program for Basic Research of China (2017YFA0700500) und der National Natural Science Foundation of China (21574020) unterstützt. The Fundamental Research Funds for the Central Universities, ein Projekt, das von der prioritären akademischen Programmentwicklung der Jiangsu-Hochschuleinrichtungen (PAPD) und des Nationalen Demonstrationszentrums für experimentelle biomedizinische Technik finanziert wird Auch die Bildung (Southeast University) wurde sehr geschätzt.

1. SFG experimentell
<ol><li>Verwenden Sie ein kommerzielles Picosecond SFG-System (Tabelle der Materialien), das einen grundlegenden 1064 nm Strahl mit einer Pulsbreite von 20 ps und einer Frequenz von 50 Hz, basierend auf einem Nd:YAG-Laser, bietet.</li>
	<li>Konvertieren Sie den basisgebischen 1064 nm-Strahl in einen 532 nm-Strahl und einen 355 nm-Strahl mit Hilfe von zweiten und dritten harmonischen Modulen. Führen Sie den 532 nm-Strahl direkt als Eingangslichtstrahl und erzeugen Sie den anderen Eingangs-Mittelinfrarotstrahl (IR) über den Frequenzbereich von 1000 bis 4000 cm-1 durch die optische parametrische Erzeugung (OPG)/optische parametrische Verstärkung (OPA)/ Differenzfrequenzgenerierung (DFG).</li>
	<li>Legen Sie die Einfallswinkel von zwei Eingangsstrahlen auf 53° (IR) bzw. 64° (sichtbar) gegenüber der Oberflächennormale fest.</li>
	<li>Um die Polymergrenzflächenstrukturen (entweder Film/Substrat-Schnittstelle oder Film/die andere mittlere Schnittstelle) zu erkennen, verwenden Sie ssp (s-polarisierte Summenfrequenzstrahl, s-polarisierter sichtbarer Strahl und p-polarisierter Infrarotstrahl) und ppp Polarisationskombinationen.</li>
	<li>Um die Grenzflächenproteinsekundärstrukturen und Wasserstrukturen, die die DNA umgeben, zu erkennen, wurden neben ssp und ppp auch chirale Spp- und psp-Polarisationskombinationen verwendet.</li>
	<li>Um sicherzustellen, dass die Proben nicht beschädigt wurden, steuern Sie die Infrarot- und sichtbaren Pulsenergien auf 70 bzw. 30 mJ. Ein Schaltplan des SFG-Prozesses mit dem Energiepegeldiagramm wurde in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 zeigt das SFG-System in unserem Reinraum.</li>
</ol>2. Fresnel-Koeffizienten
<ol><li>Verwenden Sie rechtwinklige Prismen als Substrate für alle hier diskutierten Experimente. Es gibt zwei Schnittstellen für einen Polymerfilm auf dem festen Substrat, d.h. Polymeroberfläche in Luft und Polymer/Substrat-Schnittstelle. Beide können SFG-Signale erzeugen, da die Inversionssymmetrie an beiden Schnittstellen unterbrochen ist. Daher ist ein gesammeltes SFG-Spektrum ein gestörtes. Die lokalen Feldkoeffizienten oder die Fresnel-Koeffizienten an den beiden Schnittstellen können jedoch durch Variation der Einfallswinkel oder der Filmdicke nacheinander oder gleichzeitig31,32einstellbar werden. Dies bietet uns die Möglichkeit, das SFG-Schwingungssignal von nur einer Schnittstelle aus zu sondieren. Hier wurde der PHEMA-Film auf dem CaF2 Prisma als Beispiel9genommen.</li>
	<li>Wie in Abbildung 3gezeigt, verwenden Sie die rechtwinklige Prismengeometrie, um die SFG-Signale zu erkennen, die aus der unteren PHEMA-Folie erzeugt werden. Die SFG-Ausgangsintensität im reflektierten Modus wird als <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq1.jpg" style="opacity: 0.9;">(1) wobei <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> der effektive nichtlineare Anfälligkeitstensor zweiter Ordnung bezeichnet wird. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq2.jpg" style="opacity: 0.9;">besteht aus drei Teilen, nämlich der Prisma/Polymer-Schnittstelle, der Polymer-/Bodenmittelschnittstelle (unteres Medium enthält Gas, flüssigkeit oder fest.) und dem nicht resonanten Hintergrund, wie in der folgenden Gleichung dargestellt. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq3.jpg" style="opacity: 0.9;">(2) Hier könnte das untere Medium Luft, Wasser oder etwas anderes sein. F stellt den entsprechenden Fresnel-Koeffizienten dar, der für die lokale Feldkorrektur verantwortlich ist.</li>
	<li>Wenden Sie in diesem Fall ein Dünnschichtmodell an, um die Fresnel-Koeffizienten zu berechnen. Hier werden nur kurze Berechnungsverfahren vorgestellt.<ol>
<li>Für die Prisma/Polymer-Schnittstelle <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq4.jpg" style="opacity: 0.9;">(3) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq5.jpg">(4) <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq6.jpg">(5) Die Bedeutung der einzelnen dargestellten Parameter wird unten dargestellt.<ol>
<li>
I bezeichnet die Strahlfrequenz.</li>
			<li>
t und ts bezeichnen die Gesamttransmissionskoeffizienten und können als <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq7.jpg" style="opacity: 0.9;">(6) <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq8.jpg">(7)</li>
			<li>
tp12 und ts12 bezeichnen die linearen Transmissionskoeffizienten des Lichtstrahls an der Prisma/Polymer-Schnittstelle.</li>
			<li>
rp23 und rs23 bezeichnen die linearen Reflexionskoeffizienten des Lichtstrahls an der Polymer-/Mittelschnittstelle.</li>
			<li>
• stellt die Phasendifferenz zwischen einem reflektierenden Strahl und seinem sekundären Reflexionsstrahl dar, nachdem er sich über den Polymer-Dünnfilm ausbreitet und dann zurück reflektiert, der als <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq9.jpg" style="opacity: 0.9;">(8)</li>
			<li>
stellt die Wellenlänge des Lichtstrahls dar und d ist die Polymerschichtdicke.</li>
			<li>
Die Einfallswinkel an der Prisma-Polymer-Schnittstelle bzw. der Polymer-/Medium-Schnittstelle stellen die Einfallswinkel dar.</li>
			<li>
n1 und n2 stellen die Brechungsindizes des Prismas bzw. der Polymerfolie dar.</li>
			<li>
n12 stellt die Brechungsindizes der Polymergrenzflächenschichten für das Prisma/Polymer dar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Für die Polymer/Medium-Schnittstelle <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq10.jpg">(9) <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq11.jpg">(10) <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq12.jpg">(11)<ol>
<li>
- stellt die Phasendifferenz der elektrischen Lichtfelder an zwei Schnittstellen dar.</li>
			<li>Da die Pulsbreite für unsere Eingangsstrahlen 20 ps beträgt, kann der Fehler aus der Zeitverzögerung, die mit dem Dispersionseffekt verbunden ist, vernachlässigt werden.</li>
			<li>Der Ausdruck einer solchen Phasendifferenz für den Ausgang SFG, den sichtbaren Eingang und die Eingangs-Infrarotstrahlen kann separat als <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq13.jpg">(12) <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq14.jpg">(13) <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq15.jpg">(14) 
			 </li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Aus der obigen Diskussion, für das Prisma-Polymer-Film-Medium (1-2-3) System, drücken Sie die gesamten Fresnel-Koeffizienten für das Prisma/Polymer und Polymer/Medium-Schnittstellen als die folgenden Gleichungen, für ssp- und ppp-Polarisationskombinationen aus. . Natürlich gelten beide Schnittstellen als azimutal isotrop.<ol>
<li>Für die Prisma/Polymer-Schnittstelle werden die Ausdrücke der gesamten Fresnel-Koeffizienten für ssp- und ppp-Polarisationskombinationen wie folgt dargestellt. <ol>
<li>Für sspist die Gleichung <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq16.jpg">(15)</li>
			<li>Und für pppist die Gleichung <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq17v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(16) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq18v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(17) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq19v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(18) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq20v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(19) 
			 </li>
			<li>
t10 und t01 bezeichnen die linearen Transmissionskoeffizienten an den Luft-Prisma- bzw. Prismen-/Luftschnittstellen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Für die Polymer/Medium-Schnittstelle werden die Ausdrücke der gesamten Fresnel-Koeffizienten für ssp- und ppp-Polarisationskombinationen wie folgt beschrieben. <ol>
<li>Für sspist die Gleichung <img alt="Equation 21" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq21.jpg" style="opacity: 0.9;">(20)</li>
			<li>Für pppsind die Gleichungen <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq22v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(21) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq23v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(22) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq24v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(23) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq25v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(24) 
			    
			 </li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Nach der Berechnung der Fresnel-Koeffizienten unter Verwendung des Sandwichmodells zeichnen Sie sie in Abhängigkeit von der Filmdicke, wie in Abbildung 4dargestellt. HINWEIS: In diesem Fall gibt es einen Dickenbereich zum Sammeln des SFG-Signals von der CaF2 Prisma/PHEMA-Schnittstelle mit vernachlässigbarem Beitrag von der anderen Schnittstelle, der etwa 150 nm beträgt. Ebenso kann eine geeignete Dicke für die Detektion der PHEMA/Bodenmittelschnittstelle mit vernachlässigbarem Beitrag aus der CaF2 Prisma/PHEMA-Schnittstelle gewählt werden.</li>
</ol>3. Chirale SFG Polarisationskombination
<ol><li>Für die normale achirale Schnittstelle verwenden Sie häufig die C-V-Symmetrie in Bezug auf den Ensembledurchschnitt33, 34. Mit der Operation der Inversionssymmetrie können die nichtlinearen Anfälligkeits-Tensorkomponenten ungleich Null abgeleitet werden, die cxxz, cxzx, czxx, cyyz, cyzy, czyy und czzz (die bestehende Begriffe können weiter reduziert werden, wenn von einer isotropen Schnittstelle ausgegangen wird, d.h. x und y sind identisch). Bei der chiralen Schnittstelle wird die Situation jedoch anders sein. Die chirale Schnittstelle besitzt die C-Symmetrie, nur die Rotationssymmetrieoperation ist zulässig. In diesem Fall werden neben den normalen achiralen Begriffen mehr nichtlineare Anfälligkeiten zweiter Ordnung ungleich Null sein, was als chirale Begriffe bezeichnet werden kann, nämlich czyx, czxy und cyzx unter Berücksichtigung nicht-elektronischer Begriffe. Resonanz. Daher können mit psp, pps und spp Polarisationskombinationen chirale SFG-Spektren gesammelt werden33,34.</li>
</ol>4. Probenvorbereitung
<ol><li>Vorbereitung von PHEMA-Folie<ol>
<li>PHEMA-Pulver (siehe Materialtabelle) in wasserfreiem Ethanol auflösen, um die Lösung mit 2 Gew. bzw. 4 Gew.-% herzustellen.</li>
		<li>Vor der Abscheidung der PHEMA-Folien die CaF2 Rechtwinkelprismen zunächst in das Tolululuus-Lösungsmittel einweichen und dann mit Ethanol und Reinstwasser (18,2 cm) waschen.</li>
		<li>Anschließend setzen Sie die Substrate (CaF2 Rechtwinkelprismen) Sauerstoffplasma aus, um mögliche organische Verunreinigungen durch Plasmareiniger zu entfernen (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Schalten Sie zuerst den Plasmareiniger ein und legen Sie die Substrate hinein.</li>
			<li>Schalten Sie dann die Vakuumpumpe ein, um den Reiniger zu saugen. Geben Sie den Sauerstoff darin ein.</li>
			<li>Stellen Sie schließlich 4 Minuten für die Reinigung ein. Danach die sauberen Substrate für die sequenzielle PHEMA-Folienvorbereitung aufbewahren.</li>
			<li>Dann bereiten Sie die PHEMA-Filme auf den CaF2 Prismen mit einem Spincoater vor (siehe Materialtabelle). Passen Sie die Folienstärken durch die Lösungskonzentration und Spingeschwindigkeit an.<ol>
<li>Immobilisieren Sie das CaF2 Prisma auf der Saugscheibe des Spincoaters.</li>
				<li>Lassen Sie einen Tropfen der zuvor vorbereiteten PHEMA-Lösung bei 1.500 Rpm für 1 min auf die sauberen Substrate (Foliendicke 2 Gewand% für 100 nm und 4 Gew.-% für 200 nm).</li>
			</ol>
</li>
			<li>Alle vorbereiteten PHEMA-Folien im Vakuumofen bei 80 °C über Nacht anneal.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von Seidenfibroin (SF) HINWEIS: Das von Kaplan et al.35 vorgeschlagene Protokoll wurde angenommen.<ol>
<li>7,5 g Seidenkokons von B. mori in das kochende Natriumcarbonat (Na2CO3, 0,02 M) wässrige Lösung (3 L) für 30 min. Entfernen Sie die faserige SF in einen sauberen Behälter.</li>
		<li>Waschen Sie die erhaltene faserige SF dreimal unter Rühren mit entionisiertem Wasser, um die Sericinmoleküle zu entfernen und nur die SF-Moleküle in der faserigen Probe zu lassen.</li>
		<li>Die faserige SF-Probe über Nacht bei 60 °C im Vakuumofen trocknen.</li>
		<li>Anschließend die degummed faserige SF-Probe in einer wässrigen Lithiumbromidlösung (LiBr, 9,3 m) auflösen (1 g SF wurde in 4 ml LiBr-Lösung gelöst) und bei 60 °C für 2 h unter Rühren inkubieren.</li>
		<li>Dialyze die SF-Lösung gegen entionisiertes Wasser (3.500 Da Dialysebeutel) für 3 Tage, um die gelöste LiBr zu entfernen. Wechseln Sie dreimal täglich neues entionisiertes Wasser. Schließlich die verarbeitete SF-Lösung bei 4 °C für spätere SFG-Experimente aufbewahren.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von kurzkettigem Oligonukleotid-Duplex<ol>
<li>Bestellen Sie die einsträngige Oligonukleotidprobe mit ihrer 3'-End-modifizierten durch Cholesterin-Triethylenglykol (Chol-TEG) (5'-GCTTCCGAAGGTCGA-3') von einem Handelsunternehmen (siehe Materialtabelle) sowie der komplementären. Für jeden einzelnen Strang 10 nmol des Probenpulvers in 0,5 ml Reinstwasser auflösen. Mischen Sie sie dann zu der Duplex-Oligonukleotidlösung (10 nmol/mL).</li>
		<li>Mischen Sie 2 mg 1,2-Dipalmitoyl-Sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC) und 2 mg deuterated DPPC (d-DPPC) und lösen Sie sie in 1 ml Chloroform auf, um die Lipidlösung vorzubereiten.</li>
		<li>Herstellung der DPPC &amp; d-DPPC Monolayer durch einen Langmuir-Blodgett (LB) Trog<ol>
<li>Befestigen Sie das rechtwinklige CaF2 Prisma an einem hausgemachten Probenhalter mit einer Prismenfläche, die senkrecht in die wässrige Umgebung des LB-Trogs getaucht ist.</li>
			<li>Anschließend die vorbereitete gemischte Lipidlösung auf die Wasseroberfläche injizieren, bis der Oberflächendruck einen bestimmten Wert unter 34 mN'merreichthat.</li>
			<li>Verwenden Sie nach dem Abschalten des Oberflächendrucks zwei Teflonbarrieren, um die Lipidmonoschicht im Verhältnis 5 mm/min zu komprimieren, bis ein Oberflächendruck von 34 mN'm'1 erreicht ist.</li>
			<li>Heben Sie das Prisma mit einer Lipid-Monoschicht mit einer Geschwindigkeit von 1 mm/min vertikal aus dem Wasser.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zubereitung der anderen Lipidmonoschicht<ol>
<li>Um die Montage des Duplexoligonukleotids und der Lipidmoleküle über die hydrophobe Wechselwirkung (Cholesterin und eine Lipidalkylkette) zu erleichtern, mischen Sie die Duplex-Oligonukleotidlösung mit der Lipidlösung in einem Molverhältnis von 1:100 (Oligonukleotid Lipid).</li>
			<li>In jizieren Sie die gemischte Lipid- und Duplex-Oligonukleotid-Lösung in einen hausgemachten Teflonbehälter auf die Wasseroberfläche, bis ein Oberflächendruck von 34 mNm1 erreicht ist.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Schließlich setzen Sie die Lipid-Monoschicht an der Unterseite des Prismas in Kontakt mit der Lipid-Monoschicht mit eingelegten Duplex-Oligonukleotiden auf der Wasseroberfläche, um die letzte Probe für die SFG-Messung zu bilden.</li>
	</ol></li>
	<li>Lorentz-Gleichung<ol>
<li>Verwenden Sie die Lorentz-Gleichung, um die SFG-Spektren anzupassen, um die Schwingungsinformationen für einen bestimmten Schwingungsmodus zu extrahieren. <img alt="Equation 26" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq26.jpg" style="opacity: 0.9;">(25) wobei <img alt="Equation 27" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq27.jpg"> die Intensität des qth-Vibrationsmodus, die <img alt="Equation 28" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq28.jpg"> Resonanzfrequenz, <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq29.jpg"> die Halbbreite bei halbmaximaler <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq30.jpg"> (HWHM) und die Scanfrequenz des einfallenden IR-Strahls darstellt.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Wir haben nichts zu verraten.

Um die strukturellen Informationen von molekularer Ebene aus zu untersuchen, hat SFG seine inhärenten Vorteile (z.B. Monolayer- oder Submonolayer-Empfindlichkeit und Grenzflächenselektivität), die zur Untersuchung verschiedener Schnittstellen, wie z. B. der fest/fest Flüssigkeit, Feststoff/Gas, Flüssigkeit/Gas, Flüssigkeit/Flüssigkeitsschnittstellen. Obwohl die Wartung der Geräte und die optische Ausrichtung noch zeitaufwändig sind, ist der Gewinn insofern erheblich, als die detaillierten molekularen Informationen an den...

Die Entwicklung der Summenfrequenzerzeugung (SFG) Schwingungsspektroskopie kann auf die Arbeit von Shen et al. vor dreißig Jahren1,2zurückdatiert werden. Die Einzigartigkeit der Grenzflächenselektivität und Submonolayer-Empfindlichkeit macht die SFG-Schwingungsspektroskopie von einer großen Anzahl von Forschern aus den Bereichen Physik, Chemie, Biologie und Materialwissenschaft usw. geschätzt3,4 ,5. Derzeit wird ein breites Spektrum wissenschaftlicher Fragen im Zusammenhang mit Oberflächen und Schnittstellen mit SFG untersucht, insbesondere für komplexe Schnittstellen in Bezug auf Polymere und Biomakromoleküle, wie z.B. die Kettenstrukturen und die strukturelle Entspannung an der vergrabene Polymerschnittstellen, die Proteinsekundärstrukturen und die Grenzflächenwasserstrukturen9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26.
Für Polymeroberflächen und -schnittstellen werden Dünnschichtproben in der Regel durch Spin-Beschichtung hergestellt, um die gewünschten Oberflächen oder Schnittstellen zu erhalten. Das Problem ergibt sich aus der Signalstörung der beiden Schnittstellen der vorbereiteten Filme, was zu Unannehmlichkeiten bei der Analyse der gesammelten SFG-Spektren27,28,29führt. In den meisten Fällen ist das Schwingungssignal nur von einer einzigen Schnittstelle, entweder Film/Substrat oder Film/das andere Medium, wünschenswert. Eigentlich ist die Lösung für dieses Problem ganz einfach, nämlich die Lichtfelder an der wünschenswerten Schnittstelle experimentell zu maximieren und die Lichtfelder an der anderen Schnittstelle zu minimieren. Daher müssen die Fresnel-Koeffizienten oder die lokalen Feldkoeffizienten über das Dünnschichtmodell berechnet und in Bezug auf die experimentellen Ergebnisse3,9,10,11, 12,13,14,15,30.
Unter Berücksichtigung des obigen Hintergrunds könnten einige polymere und biologische Schnittstellen untersucht werden, um die Grundlagenforschung auf molekularer Ebene zu verstehen. Im Folgenden, unter Deriddrei grenzflächenfragen als Beispiele: Sondierung Poly(2-Hydroxyethylmethacrylat) (PHEMA) Oberfläche und vergrabene Schnittstelle mit Substrat9, Bildung von Seidenfibroin (SF) Sekundärstrukturen auf der Polystyrol (PS) Oberfläche und Wasserstrukturen, die das Modell Kurzketten-Oligonukleotid Duplex16,21umgeben, zeigen wir, wie die SFG-Schwingungsspektroskopie hilft, die grenzflächenförmigen molekularen Strukturen im Zusammenhang mit der zugrunde liegenden Wissenschaft aufzudecken.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC)&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipide, Inc.</td><td>850355P-1g</td><td></td></tr><tr><td>Wasserfreies Ethanol</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>100092680</td><td>&ge; 99,7%</td></tr> <tr><td>CaF2-Prisma</td><td>Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid wasserfreies</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10005817</td><td>&ge; 96,0%</td></tr><tr><td>deuteriertes DPPC (d-DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860345P-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Elektromagnetischer Ofen</td><td>Zhejiang Supor Co., Ltd</td><td>C21-SDHCB37</td><td></td></tr><tr><td>Langmuir-Blodgett (LB) durch</td><td>KSV NIMA Co., Ltd.</td><td>KN 2003</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumbromid wasserfrei</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>20056926</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Synthesesystem</td><td>Millipore</td><td></td><td>Reinstwasser</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Chengdu Mingheng Wissenschaft & Technology Co., Ltd</td><td>PDC-MG</td><td>Sauerstoff-Plasmareinigung</td></tr><tr><td>Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (PHEMA)</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>192066 Sicherheitsdatenblatt</td><td>Mw = 300 000</td></tr><tr><td>Polystyrol</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>330345 MSDS</td><td>Mw = 48 kDa und Mn = 47 kDa</td></tr><tr><td>Seidenkokons</td><td></td><td></td><td>Von Bombyx mori</td></tr><tr><td>Einzelner komplementärer Strang des Oligonukleotids</td><td>Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.</td><td>H03596</td><td>5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'Einzelstrang</td></tr> <tr><td>des Oligonukleotids</td><td>Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.</td><td>H04936</td><td>&nbsp; 3&Cent;-Ende modifiziert durch Cholesterin-Triethylenglykol(Chol-TEG) (5&Cent;-GCTTCCGAAGGTCGA-3&Cent;)</td></tr><tr><td>Natriumcarbonat wasserfreies</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10019260</td><td>&ge; 99,8%</td></tr><tr><td>Spin-Coater</td><td>Institut für Mikroelektronik der Chinesischen Akademie der Wissenschaften</td><td>KW-4A</td><td>Für die Herstellung von Folien&nbsp;</td></tr><tr><td>Stufenprofilmessgerät</td><td>Veeco</td><td>DEKTAK 150</td><td>Für die Messung der Schichtdicke</td></tr><tr><td>Schwingungsspektroskopie-System zur Summenfrequenzerzeugung (SFG)</td><td>EKSPLA</td><td></td><td>Ein kommerzielles Pikosekunden-SFG-System</td></tr></tbody></table>

grenzflächenphysikalische strukturen von polymeren und biomakromolekülen, die über sum frequency generation vibrational spectroscopy aufgedeckt werden

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Als nichtlineare optische Spektroskopie zweiter Ordnung wurde die SUM-Frequenzerzeugung (SFG) in der Untersuchung verschiedener Oberflächen und Schnittstellen weit verbreitet eingesetzt. Diese nicht-invasive optische Technik kann die lokalen molekularen Informationen mit Monolayer- oder Submonolayer-Empfindlichkeit versorgen. Wir bieten hier experimentelle Methoden an, wie die vergrabene Schnittstelle sowohl für Makromoleküle als auch für Biomakromoleküle selektiv erkannt werden kann. Vor diesem Hintergrund werden grenzflächenförmige Sekundärstrukturen von Seidenfibroin und Wasserstrukturen um Modell-Kurzketten-Oligonukleotid-Duplex diskutiert. Erstere zeigt eine Kettenüberlappung oder räumliche Einschließungswirkung und letztere zeigt eine Schutzfunktion gegen die Ca 2+-Ionen, die sich aus dem chiralen Wirbelsäulenüberbau von Wasser ergeben.

Im Fresnel-Koeffiziententeil des Protokollabschnitts haben wir gezeigt, dass es theoretisch möglich ist, selektiv nur eine einzige Schnittstelle gleichzeitig zu erkennen. Hier haben wir experimentell bestätigt, dass diese Methode grundsätzlich korrekt ist, wie in Abbildung 5 und Abbildung 6dargestellt.
Abbildung 5 zeigt die vergrabene Grenzflächen-PHEMA-Struktur nach Wassereinbruch mit einem PHEMA-Hydroge...

Die umfassende Nutzung der SUM-Frequenzerzeugung (SFG) kann dazu beitragen, die Kettenkonformationsreihenfolge und den sekundären Strukturwandel an Polymer- und Biomakromolekülschnittstellen aufzudecken.

Grenzflächenphysikalische Strukturen von Polymeren und Biomakromolekülen, die über sum frequency generation Vibrational Spectroscopy aufgedeckt werden

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Summenfrequenzerzeugungs-Schwingungsspektren sind ausgestattet, um Schnittstellen mit Grenzflächenselektivität zu untersuchen. Die Fresnel-Koeffizientenmethode kann jedoch helfen, den Interferenzeffekt zu beheben, wenn eine andere Schnittstelle vorhanden ist. Der Hauptvorteil von SFG ist die Grenzflächenselektivität und submonolayer Empfindlichkeit.Diese nichtinvasive optische Technik eignet sich für die Investition verschiedener Schnittstellen wie Fest-Flüssig-, Fest-Fest-, Flüssig-, Gas- und Flüssiggasschnittstellen. Wir empfehlen, dass Anfänger viel Übung beim Betrieb des SFG-Systems mit Hilfe von Experten für Optik und SFG bekommen. Es gibt keine Verknüpfungen.SFG wurde nicht allgemein als leistungsfähige Technik anerkannt, daher möchten wir mehr Publikumsinteresse wecken und mehr Forscher ermutigen, diese Technik anzuwenden. Zunächst etwa fünf Milliliter einer zwei- oder 4-prozentigen Lösung von Poly-2-Hydroxyethylmethacrylat oder PHEMA in wasserfreiem Ethanol zubereiten. Bewahren Sie die Lösung drei Tage vor der Verwendung im Labor auf.Als nächstes tauchen Sie vier IR-Grade Calciumfluorid rechtwinklig Prisma in analytischen Grad wasserfreies Toluen für mindestens 12 Stunden. Dann tauchen Sie die Prismen in 30 Milliliter Ethanol ein und wischen Sie die Oberflächen mit entfettender Baumwolle für ca. 10 Minuten ab. Spülen Sie das Prisma zwei Minuten lang mit reinem Ultrawasser und trocknen Sie es mit Stickstoffgas.Als nächstes legen Sie die Prismen in einen Sauerstoffplasmareiniger und evakuieren Sie die Kammer. Behandeln Sie die Prismen vier Minuten lang mit Sauerstoffplasma und bewahren Sie sie in der Kammer auf, bis sie verwendet werden. Die Filmpräparation sollte innerhalb einer Stunde nach der Plasmabehandlung erfolgen.Um die Barriereschnittstelle selektiv zu erkennen, ist es in dieser Studie von großer Bedeutung, die passende Foliendicke nach dem berechneten Ergebnis des Fresnal-Koeffizientenmodells zu wählen. Wenn Sie bereit sind, die PHEMA-Folien vorzubereiten, fixieren Sie ein sauberes Prisma in einem Prismahalter auf einem Spincoater und tragen Sie einen Tropfen der Lösung von PHEMA in Ethanol auf das Prisma auf. Führen Sie den Spincoater bei 1, 500 U/min für eine Minute aus, um den PHEMA-Film vorzubereiten.Mantel Sie zusätzliche plasmabehandelte Prismen auf die gleiche Weise mit PHEMA. Die Folien in einem Vakuumofen, der mindestens 10 Stunden lang auf 80 Grad Celsius eingestellt ist, annealen. Um das Experiment durchzuführen, platzieren Sie die PHEMA-beschichtete Fläche des Prismas in entionisiertem Wasser.Warten Sie 10 bis 20 Minuten und werten Sie dann die Grenzflächen-PHEMA-Struktur an den Wasser- und Prismenschnittstellen mit einer Frequenzgenerierungsspektroskopie aus. Während des Betriebs des FGS-Systems lassen Sie den Lichtstrahl nicht direkt in Ihre Augen kommen. Um mit der Zubereitung der Seidenfibroinlösung zu beginnen, erhitzen Sie drei Liter 0,02 molförmiges wässriges Natriumcarbonat zum Kochen.7,5 Gramm Bombyx mori Seidenkokons in dieser Lösung unter Rühren 30 Minuten kochen. Die faserige Materie in einen sauberen Behälter geben und dreimal in zwei bis drei Liter entionisiertes Wasser rühren, um die unerwünschten Sericinmoleküle abzuwaschen. Die faserige Materie in einem Vakuumofen bei 60 Grad Celsius mindestens 15 Stunden trocknen.Als nächstes lösen Sie ein Gramm trockenes, degummed SeideFibroin in vier Milliliter von 9,3 Mol wässrigem Lithiumbromid. Rühren Sie die Lösung bei 60 Grad Celsius für zwei Stunden. Dann legen Sie die Seidenfibroin-Lösung in eine 3, 500 Dalton Dialysetasche.Dialyze die Lösung gegen einen Liter deionisiertes Wasser für drei Tage, das Wasser dreimal pro Tag wechseln. Sobald die Dialyse abgeschlossen ist, lagern Sie die Seidenfibroin-Lösung bei vier Grad Celsius. Als Nächstes verwenden Sie die zuvor beschriebenen Methoden, um ein Calciumfluorid-Prisma zu reinigen und es mit einem dünnen Polystyrolfilm aus einer 3,5 Gewichts-Polystyrollösung zu beschichten.Setzen Sie das polystyrolbeschichtete Prisma in Kontakt mit der Seidenfibroinlösung und untersuchen Sie die Polystyrol-Seidenfibroin-Schnittstelle mit der SFG-Spektroskopie. Um mit der Vorbereitung des Oligonukleotid-Duplex zu beginnen, lösen Sie 10 Nanomole des entsprechenden einsträngigen Oligonukleotids in 0,5 MilliliterR Reinstwasser auf. Gleiches gilt für das kostenlose Oligonukleotid.Kombinieren Sie die Lösungen, um eine 10 Nanomol pro Milliliter Duplex-Oligonukleotid-Lösung zu erhalten. Dann kombinieren Sie zwei Milligramm DPPC, zwei Milligramm deuterated DPPC, und ein Milliliter Chloroform, um die Lipidlösung zu erhalten. Als nächstes behandeln Saubere und Plasma ein Calciumfluorid-Prisma wie zuvor beschrieben.Befestigen Sie dieses Prisma am Probengriff eines Langmuir-Blodgett-Trogs. Füllen Sie den Trog mit entionisiertem Wasser und senken Sie eine Fläche des Prismas mit einem Millimeter pro Minute in den Trog. Mehrere Mikroliter der Lipidlösung auf die Wasseroberfläche injizieren und warten, bis sich der Oberflächendruck bei etwa 12 Millinewton pro Meter stabilisiert.Dann beginnen Sie, die Lipid-Monolayer mit fünf Millimetern pro Minute zu komprimieren. Wenn der Oberflächendruck 34 Millinewton pro Meter erreicht, hebt das Prisma von der Trog um einen Millimeter pro Minute. Als nächstes 500 Mikroliter einer Mischung aus der Duplex-Oligonukleotid-Lösung und der Lipidlösung im Eins-100-Molaren-Verhältnis vorbereiten.Dann ersetzen Sie den Langmuir-Blodgett-Trog durch einen zylindrischen Polytetrafluorethylenbehälter, der mit entionisiertem Wasser gefüllt ist. Injizieren Sie das Oligonukleotid-Lipidgemisch auf das Wasser, bis der Oberflächendruck 34 Millinewton pro Meter erreicht. Setzen Sie die lipid monolayer beschichtete Fläche des Prismas in Kontakt mit der Lipidoligonukleotid-Mischung, um die endgültige Probe zu bilden.Bewerten Sie die chiralen und achiralen Wasserschwingungssignale mit FSG-Spektroskopie. In diesem ersten Beispiel zeigte die Schnittstelle zwischen PHEMA-Hydrogelen und dem Calciumfluorid-Prisma deutliche scharfe Spitzen im SFG-Spektrum. Dies wurde auf die glatte Schnittstelle zwischen Calciumfluorid und dem Hydrogel zurückgeführt.Die Schnittstelle zwischen dem Hydrogel und dem umgebenden Wasser hatte breitere, weniger intensive Merkmale, da Wassermoleküle in den Großteil des Hydrogels diffundieren konnten. Hier bei der Seidenfibroinkonzentration über der kritischen überlappenden Konzentration wurden an der Lösungspolystyrol-Schnittstelle chirale Sekundärstrukturen nachgewiesen, es sei denn, Methanol wurde als induzierendes Mittel zugesetzt. Unterhalb der kritischen überlappenden Konzentration wurden chirale SFG-Signale auch ohne Zugabe von Methanol erkannt, was darauf hindeutet, dass geordnete Sekundärstrukturen an der Lösungspolystyrol-Schnittstelle ohne Unterstützung gebildet wurden.In der Duplex-Oligonukleotid verankerten Lipid-Doppelschichtprobe, die die Calciumionenkonzentration variierte, hatte keine signifikante Wirkung auf das chirale Wassersignal, das in erster Linie der späteren Hydratation der chiralen Wirbelsäule in der Mollrille entspricht. Im Gegensatz dazu wirkte sich die Kalziumkonzentration stark auf die achiralen Wassersignale aus, die in erster Linie der Wasserschicht entsprechen, die die Duplexkette und die Doppelschicht umgibt. Über all dies deutete darauf hin, dass die chirale Wirbelsäule der Wasserschicht das Oligonukleotid vor Kalziumionen schützen könnte.Die Berechnung des Fresnel-Koeffizienten und die Auswahl einer geeigneten Foliendicke können Interferenzprobleme lösen. Wenn Multireflexion und Brechung als die richtige elektrische Feldverteilung an den Schnittstellen betrachtet werden, kann eingestellt werden. Es gibt alternative Methoden, die verwendet werden können, um dünne Folien mit gewünschten Dicken wie Stufenbeschichtung und die chemische Dampfabscheidung vorzubereiten.Die Erkennung der Oberflächen- und Grenzflächenstrukturen im Zusammenhang mit Haftung, Wittling, Reibung und anderen Eigenschaften kann Forschern helfen, die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen und neue funktionelle Materialien zu entwickeln. Diese Methode kann auch auf andere Systeme angewendet werden, bei denen unterschiedliche Schnittstellen untersucht werden müssen. Das Medium, das Sie sich wünschen, muss jedoch transparent sein.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen und Beispiele für die Probenvorbereitung, Datenerfassung und Datenanalyse zur Charakterisierung synthetischer Polymere mit unterschiedlicher Dispersion und Endgruppen unter Verwendung der matrixgestützten Laserdesorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie.

MALDI-ToF MS-Methode zur Charakterisierung von synthetischen Polymeren mit unterschiedlicher Dispersität und Endgruppen

Entdecken Sie die Grenzflächenphysik von Polymeren und Biomakromolekülen mittels Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Diese nicht-invasive optische Methode ermöglicht die Untersuchung von Kettenkonformationen und sekundären Strukturänderungen an verschiedenen Grenzflächen.

Grenzflächenphysikalische Strukturen von Polymeren und Biomakromolekülen, die über sum frequency generation Vibrational Spectroscopy aufgedeckt werden (Video) | JoVE Journal

Grenzflächenphysikalische Strukturen von Polymeren und Biomakromolekülen, die über sum frequency generation Vibrational Spectroscopy aufgedeckt werden

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