Name: Vorhersage In Vivo Nutzlasten Lieferung mit einem Blut-Hirnschranke Tumor in einer Petrischale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie ein in vitro Modell der Blut-Hirn-Tumor-Schranke mit murinen und humanen Zellen erstellen. Diese Methode ermöglicht die Vorhersage der Arzneimittelzufuhr zu ZNS-Tumoren und reduziert den Bedarf an Tierversuchen.

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Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der finnischen Krebs-Organisationen, Jane & Aatos Erkko Foundation, und Sigrid Juselius Foundation (p.l. und V.L.J.), den Schweizerischen Nationalfonds (Advanced Postdoc.Mobility gewähren keine: P300PB_164732, s. (K.), die Orion Forschungsgemeinschaft (s.k.), der Maud Kuistila Memorial Foundation (s.k.) und der Academy of Finland (TERVA 2017 gewähren keine: 314 498). Biomedicum Bildtrommel (Helsinki) wird für die Bereitstellung der Mikroskopie imaging zentrale Einrichtung anerkannt.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der Aufstieg des Begriffs interpatient Tumor Variabilität verjüngt die Forschung über personalisierte Krebs Medizin21. Diese Variabilität ist auch ein Markenzeichen der Tumoren des zentralen Nervensystems. Aufgrund der Unberechenbarkeit des Tumors Ansprechen auf die Chemotherapie ergänzt die schützende Wirkung der BBB für Drug-Delivery und insgesamt stellt große Herausforderungen in Patientenversorgung22. Um eine effektivere Therapien zu entwickeln, ist es oft notwendig, Bildschirm große Bibliotheken mit neuer Moleküle. Um die Antitumor-Wirkung und die Fähigkeit der neuen therapeutischen führt, erreichen die Tumor-Website bewerten, ist die beste Option der präklinischen Studie über Patienten gewonnenen Zellen in Vivo in murinen Avatare Patienten implantiert. Aufgrund der praktischen (, Zeit, Mensch und Anlage Finanzmittel) und ethischen Gründen (3R-Prinzip bei der Verwendung von Versuchstieren) ist die Entwicklung von solch eine große in-vivo Screening-Plattform oft nicht möglich, und daher die zellbasierte assays bleiben Sie ein Modell der Wahl23. Der Hauptgrund für die Auswahl der etablierte Zelllinien und Primärzellen zu vermeiden soll die Reproduzierbarkeit und reduzieren den Einsatz von Versuchstieren, die Hauptquelle für die Isolierung und die Etablierung von murinen Primärkulturen sind. Die Methoden hier präsentieren konnte fest Einhaltung der 3Rs effizient Nanopartikel aus eine weitere präklinische Untersuchungen auf das Kriterium für ihre Unfähigkeit, das Modell BBTB überqueren verwerfen. Hier beschreiben wir als Proof of Principle Erkenntnisse bei der Entwicklung und Validierung von der BBTB. Wir konnten in-vivo, in vitro Befunde bestätigen zum Beispiel bei der Messung der passive Diffusion von einem 376 Da Natrium-Fluorescein.
Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen beschreibt die Vorbereitung von Endothelzellen cocultured mit Astrozyten bilden eine Blut-Hirn-Tumor-Barriere-ähnliche Oberfläche in einer in-vitro-Setup. Sobald ein physischer Kontakt zwischen diesen beiden Zelltypen besteht, weist die endotheliale Zellschicht Ähnlichkeiten mit der BBB (z. B. eine Zelle Oberflächenexpression von tight Junction-Proteinen und relativ geringen Durchlässigkeit). Interessanterweise schien die murine BBTB Mimik besonders ähnlich Na-Fl Permeabilität Werte für denen, die mit der in-vivo Maus BBB Permeabilität Messungen24bereitzustellen. Daher wird die Leistung des BBTB Mimik direkt auf die Wahl der Zellen verwendet, um die Barriere bilden verknüpft werden. Die bEND3 endothelial Zellen stammen aus dem Gehirn und sind dafür bekannt, bei der Bildung von Barrieren bei der Astrozyten25cocultured erfolgreich zu sein. Jedoch verwenden die verewigt HIFko Astrozyten26 wir die BBTB Mimik zu erzeugen. Aufgrund ihrer mangelnden Hypoxie-induzierbare Faktor dieser Astrozyten produzieren keine VEGF-A, ist die Quintessenz in der BBTB Mimik-Stabilisierung, die hier beschrieben. Astrozyten haben als Modulatoren der BBB Permeabilität, zum Beispiel durch die Freisetzung von VEGF-A in Reaktion auf Neuroinflammation27identifiziert. Aktivierung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (VEGFRs) ist Schlüsselregulator der endothelialen/vaskulären Permeabilität sowohl in Vitro28 und in-vivo-29. Aktivieren Sie deshalb VEGF-A Ergänzungen im Medium der VEGFR2 auf die Endothelzellen, die die Phosphorylierung von Adherens Junction Proteinen wie VE-Cadherin30induziert. Der Verlust der endothelialen Zell-Zell-Kontakte generiert hochpermeablen Blutgefäße. Ebenso entstehen die starken Mitogene Eigenschaft und unbekannter Zusammensetzung des fetalen bovine Sera in die Zelle Kultur Assays verwendet große Probleme in der Barriere Stabilisierung und Assay Reproduzierbarkeit.
Menschlichen Nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) werden manchmal verwendet, um BBB in Vitro31bilden; Sie deutlich unterscheiden sich jedoch von dem Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen, wie z. B. die hCMEC/D3 Zelle Zeile32, in Bezug auf die Genexpression und Barriere-bildenden Eigenschaften. Die relativ höhere Durchlässigkeit, die Werte, die mit den HuAR2T Zellen gewachsen allein im Vergleich zu den bEND3 wurden jedoch durch coculturing sie mit menschlichen primäre Astrozyten stark reduziert. Obwohl die Endothelzellen erforderlich sind, um die Zellwand zu bilden, ist es klar, dass die Astrozyten haben eine ebenso wichtige Rolle für die BBTB Bildung und Stabilisierung zu spielen.
Wenn diese Gleichung Patienten abgeleitet Gliom Kugeln hinzugefügt wurden, rekapitulierte die Maus BBTB Mimik einige der Features der murinen Xenotransplantate, wie die Droge Verbreitung durch das Gehirn Gefäßsystem und den Tumor Zelle targeting. Die hier besprochenen BBTB Mimik gelang, beispielsweise spiegeln das in-vivo Verhalten, wenn wir mehrere Nanopartikel mit unterschiedlichen Durchmessern gezeigt. Um die Parallelität zwischen der in-vitro und in vivo Modellen zu veranschaulichen, verwendet wir die zuvor beschriebenen mesoporösen Silikat Nanopartikel33 mit Zelle durchdringenden Eigenschaften34 konjugiert, das Tumor-targeting Peptid CooP auf ihre surface20. Die CooP-targeting-Peptid Häuser zu invasiven Tumorzellen durch die spezifische Bindung an der Mamma abgeleitet Wachstums-Inhibitor (MDGI). Verschiedene Krebsarten, einschließlich Gliomen, sind im Vergleich zum normalen Gewebe35, wodurch der CooP eine sehr effiziente Tumor-targeting glyko-zu einer Steigerung der Lieferung eines Nutzlast20MDGI überexprimiert. Die Nanopartikel verwendet hier haben bisher gezeigt, dass in der Anwesenheit von (27547955) diffundieren haben, und wenn mit Taxol funktionalisiert, diese Nano-Ladungen erfolgreich bei der Verringerung der Gliom Wachstum in präklinischen Modellen36. Die Zugabe von Polyethylenglykol (PEG) Rückstände an der Oberfläche der Nanopartikel auch beibehalten ihre statischen Aufladung für positive Werte (um + 4 mV), so dass bessere Interaktion mit der neurovaskuläre Einheit37 und erhöht auch ihre Stabilität im Umlauf. In den dargestellten Daten war 3 kDa PEG, NP110s, konjugiert, während NP350s mit 10 kDa PEG beschichtet wurden. Führte jedoch erhöht Molekulargewicht PEG auch eine deutliche Zunahme der Nanopartikel-Durchmesser, damit ihre körperlichen Fähigkeiten, die BBB zu überqueren. Daher haben wir geprüft ob die Abmessungen der Partikel ihrer Passage durch die BBTB verhindert und ob diese Beobachtungen in-vivo gespiegelt werden könnte.
Im Einklang mit den zuvor veröffentlichten Beobachtungen, beobachteten wir, dass NP110s durch in-vitro-BBTB und der BBB von Mäusen mit intrakraniellen Tumoren, während NP350s beibehalten auf der luminalen Seite der BBTB Mimik und in den Blutgefäßen des Bedarfs der Mäuse. Diese ähnliche Ergebnisse empfehlen die BBTB Modell vorhergesagt die in-vivo Fähigkeit von Nanopartikeln zu überqueren die BBB und das Gehirn erreichen.
Die Relevanz von Zellmodellen der BBB wird häufig diskutiert, auch für die zentrale Bereitstellung von Nanopartikeln38. Wir zeigen hier, dass primäre Astrozyten und Endothelzellen, beide als als die wichtigsten in-vitro-Tools durch verewigt und/oder kommerziell erhältlichen Zellen ersetzt werden können größere Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Die nächste Generation von in-vitro-BBB-Fließbildern könnte durch die Einbeziehung der mikrofluidischen Geräte, so dass schön geformten neurovaskuläre Einheiten, die strukturell den tatsächlichen BBB12,14 ähnelnentwickelt werden. Solche Modelle sind jedoch derzeit nicht geeignet für den Hochdurchsatz-Screening von Molekülen an Gliome, aufgrund technischer Einschränkungen bei der Nachbereitung der Lieferung14geliefert. Es ist in der Tat schwierig, die physiologische Komplexität der BBB in einer Petrischale zu erfassen, und das mögliche Fehlen einiger Rezeptoren/Proteine, bekannt durch die BBB ausgedrückt werden kann die Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen. Ein weiteres Argument betrifft die große Variabilität in der Genexpression zwischen in-vivo und in vitro Bedingungen sowie aus einer Zelllinie zu einem anderen, besonders wenn man bedenkt Endothelzellen. Allerdings könnte auch argumentieren, dass die neurovaskuläre Einheit keine einheitliche Entität in der Gehirn-39 ist. Wissenschaftlicher Forschung in der Biologie hat eine humane Ära erreicht, wo der Tierschutz, ethische Verantwortung und die Kosten der Verwendung von tierischer Lebens gelten stets vor der Gestaltung ein Experiment. Daher, um den Austausch von Tieren zu unterstützen, eine wachsende Zahl von Studien zeigen, dass das Bewusstsein für die Grenzen der Modelle und die sorgfältige Auswahl von Zellmodellen, die Barriere zu etablieren – mit Betonung auf die Astrozyten – garantieren eine Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen in einer Schale gewonnen und in der Tier-Modelle40. Mit der hier beschriebenen Methodik bekommen wir einen Schritt näher zur Verringerung der Zahl der Versuchstiere zu screening-Zwecken des BBB Transcytosis für potenzielle Therapeutika verwendet.

Die neurovaskuläre Einheit besteht aus Neuronen und Astrozyten der BBB, durch komplizierte Verbindungen zwischen Perizyten, Astrozyten und Endothelzellen der zugehörigen Basalmembran bilden das Gehirn Microvasculature1gebildet. Diese engen Zellwand gebildet durch kontinuierliche, nonfenestrated Schiffe fein reguliert die Bewegung von Ionen und Moleküle (einschließlich Hormone, Nährstoffe oder Drogen), sondern auch der zirkulierenden Zellen1. Die besonders niedrige Transcytosis durch die BBB hoch Molekulargewicht Moleküle, wie therapeutische Antikörper, Wirkstoff-Konjugate oder Nanocompounds, schränkt drastisch die Fortschritte in der Arzneimittelforschung für neurologische Krankheiten, einschließlich maligne Gliome2. In der Tat, oral oder intravenös gelieferte Chemotherapien erreichen das Gehirn Parenchym oft bei unzureichend niedrigen Konzentrationen induzieren eine antitumor-Wirkung oder sind einfach nicht in der Lage, überqueren Sie die BBTB um die neoplastischen Zellen3erreichen. Einige präklinische und klinische Studien haben nicht behandelte die Frage der BBTB Penetration aber haben versucht, die BBTB vorübergehend, stören zum Beispiel mit fokussierten Ultraschall4,5, oder um es durch die direkte in Situ zu umgehen Lieferung von Drogen6. Jedoch konnten keine dieser Techniken die unvermeidlichen Tumor Erweiterung entgegenzuwirken oder Rückfall. Daher sollte bei der Entwicklung neuartiger antiglioma Therapien die Diffusion durch die BBTB als einer der kritischen Aspekte für die erfolgreiche Durchführung der Therapeutika7betrachtet werden.
Aufgrund der sehr komplexen Natur der Zelle Interaktionen innerhalb der BBTB scheinen in vivo Studien bei Labortieren die offensichtliche Wahl, wenn im Laufe der Moleküle aus Blut zum Gehirn zu studieren. High-Skala in-vivo-Methoden sind jedoch relativ komplex zu etablieren und erlauben daher, nicht das Hochdurchsatz-Screening von Molekülen in einer angemessenen Zeit zu einem vernünftigen Preis. Noch wichtiger ist, hat Tierversuche zu folgen die 3R ethische Richtlinie definiert als i) verfeinern, Ii) zu reduzieren, und für den aktuellen Kontext relevant, Iii) ersetzen durch alternative Protokolle (z. B. in Vitro/in-Silico-Methoden). Daher neu zu in-vitro-BBTB erscheint als eine interessante und attraktive Möglichkeit, aber sie stellt auch eine komplexe Aufgabe, die von verschiedenen Einschränkungen in Frage gestellt. Viele Versuche, neu dieses komplexeste Fach mit kultivierten Primärzellen oder Zell-Linien von Hunde, Schweine, murine und auch menschlichen Ursprungs (wie Rahman Et Al.8 und Helms Et Al.9überprüft) veröffentlicht worden. Diese Modelle verfügen über dreidimensionale mikrofluidischen Systemen10, BBB-on-a-Chip11,12, und eine Vielzahl von Varianten, basierend auf der klassischen Ko-Kulturen in fügt Systeme. Aktuelle mikrofluidischen und Chip-Systeme sind jedoch entweder nicht geeignet für schnelle, Hochdurchsatz-Droge-Validierung Studien13,14 oder sind derzeit nicht kompatibel mit dem Studium der Drug-Delivery Hirntumoren. Darüber hinaus zeigte die Überprüfung der 155 veröffentlichten Modellen mit Primärzellen, induzierbaren pluripotente Stammzellen (iPSC) oder kommerzielle Zelllinien alle Co kultiviert auf Einsätze einen Trend für interstudy Diskrepanz in ihren Messungen und/oder Schlussfolgerungen8. Dieser Mangel an Korrelationsfaktoren Reproduzierbarkeit konnte mit i) normalisierten Kulturbedingungen, zum Beispiel korreliert werden mit der optionalen Beschichtung mit Basalmembran Matrixproteine in der Zelle Kulturgefäß, (Ii) eine erhöhte Anzahl von Subkultur und Nutzung der Serum-haltigen Medien, beide große Fahrer genetische und phänotypische Modifikationen der Zelle Linien15, oder Iii) die Schwierigkeit, das richtige Gleichgewicht zwischen den Astroglial und endotheliale Komponenten in einer Petrischale reproduzierbar neu zu erstellen. Obwohl die Verwendung von verewigt Zellen oder kommerzielle Zelle Linien um eine in-vitro-Modell der BBB fehlen einige der Eigenschaften im Vergleich zu ähnlichen Modellen, die nur Primärzellen verwenden zu etablieren, in dem beschriebenen Verfahren zeigen wir, dass die richtige Kombination von Exponaten Zellen eine sehr vergleichbarer Leistung zu veröffentlichten Studien in anderen Modellen von Referenz16,17. Schließlich, das Fehlen eines robusten und reproduzierbare Modells, im Laufe der therapeutischen Ausrichtung von Hirntumoren durch die BBTB Verbindungen zu studieren hat uns motiviert, die hier beschriebenen Methoden zu entwickeln.
Denn Ziel war es, das Modell zu nutzen, um die in-vivo Lieferung von Nanopartikeln in präklinischen Tiermodellen vorherzusagen, validiert wir zuerst das BBTB Modell durch die Verwendung von Einsätzen mit murinen endothelial Zellen in Kontakt mit murinen Astrozyten. Darüber hinaus haben wir auch das Modell, um bestimmte menschliche Zelllinien verwenden optimiert. Einmal stabilisiert, sind die Zelle Barrieren Kulturen mit Patienten abgeleitet Glioblastom Kugeln oder kommerzielle Gliom-Zell-Linien übertragen. Danach können die Transcytosis von Nanopartikeln und Tumor Zelle gezielt visualisiert durch konfokale Mikroskopie und quantifiziert durch das Sammeln von Proben im Laufe der Zeit. Wichtig ist, könnte erzielten Ergebnisse mit den BBTB Mimik zuverlässig dem Verhalten der in-vivo, unterstützen die Verwendung des mimischen vor dem BBTB Nanopartikel die präklinische Validierung Vorhersagen.

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bEND3</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>Kultiviert in: DMEM (1 g/l Glukose) ergänzt mit 10 % FBS, 5 mL L-Glutamin und 5 mL Penicillin/Streptomycin</td></tr><tr><td>HIFko immortalisierte Maus-Astrozyten</td><td>Isoliert in Dr. Gabriele Bergers Labor</td><td>https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td><td>Kultiviert in: BME-1 ergänzt mit 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM Natriumpyruvat, 3 g D-Glucose und 5 mL Penicillin/Streptomycin</td></tr><tr><td>HuAR2T</td><td>Isoliert in Dr. Dagmar Wirth Lab</td><td>https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184</td><td>Kultiviert in: EBM-2 mit SupplementMix</td></tr><tr><td>normale humane primäre Astrozyten</td><td>Lonza</td><td>CC-2565</td><td>Kultiviert in: ABM mit SingleQuots</td></tr><tr><td>Material und Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 17 mm Schale, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische Pipette</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>170361</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>ABM Basalmedium, 500 mL</td><td>Lonza</td><td>CC-3187</td><td>Für primäre menschliche Astrozyten. ABM+: enthält alle Zusatzstoffe aus der Ergänzungsmischung. ABM-: alle Additive außer rhEGF und FBS</td></tr>, <tr><td>Accutase Cell Detachment Solution</td><td>, Corning</td><td>25-058-CI</td><td></td></tr>, <tr><td>AGM SingleQuots, Supplements und Growth Factors</td><td>, Lonza</td><td>CC-4123</td><td></td></tr>, <tr><td>B27 Supplement</td>, <td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>für GBM, + und - mittel</td></tr><tr><td>, Basalmedium, Eagle</td>, <td>ThermoFisher, Scientific</td><td>21010046</td>, <td>BME-1</td></tr>, <tr><td>Corning, Costar TC-behandelte 6-Well-Platten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3506</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Zellkultureinsätze mit Polyestermembran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3452&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>löst sich in 50 mL BME-1 und Sterilfilter auf, bevor es dem Medium zugesetzt</td></tr> wird <tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td>Spezifisch für die Kultur der von Patienten abgeleiteten Kügelchen, die in unserem Labor isoliert wurden, kann für andere Gliom-Zelllinien</td></tr><tr><td>variieren EBM-2 Wachstumsmedium SupplementMix</td><td>PromoCell</td><td>c-39216</td><td>EBM+: enthält alle Zusatzstoffe aus dem Supplement-Mix. EBM-: alle Zusatzstoffe außer VEGF-A und FBS</td></tr><tr><td>Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2)</td><td>PromoCell</td><td>c-22211</td><td>EBM+: enthält alle Zusatzstoffe aus der Ergänzungsmischung. EBM-: alle Additive außer VEGF-A und FBS</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualifiziert, hitzeinaktiviert, EU-zugelassen, Südamerika Herkunft</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 Well-Platten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Greiner 655090</td><td>schwarze Polystyrol-Wells mit flachem Boden (mit mikroklarem Boden)</td></tr><tr><td>Menzel-Gl&auml; ser 0,9 cm runde Borosilikat-Deckgläser</td><td>Thermo Scientific</td><td>10313573</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tabletten</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td>eine Tablette pro Liter dH2O, dann die Lösung durch Autoklavieren von</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysinhydrobromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Human EGF</td><td>Peprotech</td><td>GMP100-15</td><td>für GBM+ medium</td></tr><tr><td>Rekombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>für GBM+</td></tr> <tr><td>mittelstark<>Immunfluoreszenz</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 60 mm Objektträger-Deckglas</td><td>ORSAtec</td><td>0224601-D</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 und 594 Sekundärantikörper</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Verdünnung: 1/500</td></tr><tr><td>Anti-Claudin-5 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab15106</td><td>Verdünnung: 1/150</td></tr><tr><td>Anti-GFAP Antikörperklon GF5</td><td>Abcam</td><td>ab10062</td><td>Verdünnung: 1/150</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD31&nbsp; Antikörper Klon MEC 13.3</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>Verdünnung 1/800</td></tr><tr><td>Anti-SV40 T-Antigen Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab16879</td><td>Verdünnung: 1/150</td></tr><tr><td>Anti-Zonula Occludens-1</td><td>Abcam</td><td>ab96587</td><td>Verdünnung: 1/200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>TOCRIS</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Fluormount Wässriges Eindeckmedium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Rot DND-99</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L7528<</td><td></td></tr><tr><td>stark>Tierverfahren</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm gebogene Präparierschere</td><td>World Precision Instruments</td><td>14394</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 25 G Nadeln</td><td>Becton Dickinson</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette (12,5 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>503283</td><td>für die Dissoziation von Geweben</td></tr><tr><td>Intramedic Polyethylen-Schlauch PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminol vet 50 mg/mL</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>Ketamin</td></tr><tr><td>Netzbetriebener Mikrobohrer</td><td>World Precision Instruments</td><td>503599</td><td></td></tr><tr><td>Menzel-Gl&auml; ser 0,5 cm runde Borosilikat-Deckgläser</td><td>Thermo Scientific</td><td>11888372</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bulldog Klemme</td><td>World Precision Instruments</td><td>14119</td><td></td></tr><tr><td>Physiologische Kochsalzlösung</td><td>Mustela</td><td>Sterile Einzeldosisfläschchen 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medizinprodukt Klasse</td><td></td></tr><tr><td>Rochester-Oschner Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>501709</td><td></td></tr><tr><td>Rompun vet 20 mg/mL</td><td>Intervet</td><td>Vnr148999</td><td>Xylazin</td></tr><tr><td>Stereotaxie-Adapter</td><td>World Precision Instruments</td><td>502063</td><td></td></tr><tr><td>Sugi Sponge Points</td><td>Kettenbach</td><td>31603</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16 Fluoreszenz-Stereo-Zoom-Mikroskop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega Mikroplatten-Reader</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 digitale sCMOS-Kamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Universal 320 Tischzentrifuge&nbsp;</td><td>Hettich</td><td>Kat. Nr. 1401</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS LSM 880 mit Airyscan Konfokalmikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vorhersage in vivo nutzlasten lieferung mit einem blut-hirnschranke tumor in einer petrischale

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Hochselektiver naturgemäß, die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist essentiell für das Gehirn-Homöostase in physiologischen Bedingungen. Jedoch in Zusammenhang mit Hirntumoren schirmt die molekulare Selektivität der BBB auch der neoplastischen Zellen durch die Blockierung der Lieferung von peripher verabreichten Chemotherapien. Die Entwicklung neuartiger Medikamente (einschließlich Nanopartikel) malignen Hirntumoren im Idealfall Ausrichtung erfordert den Einsatz von präklinischen Tiermodellen, Transcytosis und Antitumor-Wirkung des Medikaments zu studieren. Um das 3R-Prinzip entsprechen (zu verfeinern, zu reduzieren und ersetzen) zu verringern die Zahl der Versuchstiere im Versuchsaufbau und Hochdurchsatz-Screening von eine große Bibliothek von Antitumormittel durchführen, entwickelten wir ein reproduzierbares in-vitro-Mensch und murine Mimik der Blut-Hirn-Tumor-Schranke (BBTB) mit dreischichtigen Kulturen von Endothelzellen Astrozyten und Patienten abgeleitet Glioblastom Sphären. Für höhere Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit wurden kommerzielle Zelllinien oder verewigt Zellen in maßgeschneiderten Bedingungen zur die Bildung einer Barriere, die ähnlich der tatsächlichen BBB ermöglichen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um ein BBTB Mimic durch Kultivierung endotheliale Zellen in Kontakt mit Astrozyten bei bestimmten Zelldichten auf Einsätze zu erhalten. Diese BBTB Mimik kann beispielsweise für die Quantifizierung und konfokale Bildgebung der Nanopartikel Passage durch die Endothelzellen und astrocytic Barrieren, zusätzlich zu der Bewertung der Tumor Zelle Ausrichtung innerhalb des gleiche Tests verwendet werden. Darüber hinaus zeigen wir, dass die gewonnenen Daten verwendet werden können, um das Verhalten von Nanopartikeln in präklinischen Tiermodellen. In einer breiteren Perspektive dieses in-vitro-Modell an anderen neurodegenerativen Erkrankungen für die Bestimmung der Passage von neuen therapeutischen Molekülen durch die BBB angepasst werden konnte und/oder ergänzt werden mit Gehirn Organellen, die Wirksamkeit von direkt zu bewerten Medikamente.

Konfokale Bildgebung der murinen BBTB Mimik zeigt den Ausdruck und die zellulären Lokalisation der tight Junction Proteinen Zonula Occludens-1 (ZO-1) und Claudin-5 in bEND3. Kontakte zwischen den Endothelzellen und Astrozyten induziert eindeutig die Verlegung des ZO-1 und Claudin-5 auf die endotheliale Zell-Zell-Kontakte im Vergleich zu den bEND3 Monokulturen (Abbildung 1). Mit Immunfluoreszenz-Färbung um die GFAP-mit dem Ausdruck Astrozyten im Gehirn-Seite der Membran sichtbar zu machen, ist es möglich, zu beobachten und studieren der astrocytic Prozesse und Ende-Füße Kontakt mit den endothelialen Zellen durch die Membran (Abbildung 1E ). Die Astrozyten und Endothelzellen Kontakte sind dafür bekannt, zu fördern und zu stabilisieren, die Verschärfung der zellulären Barriere und geringere Permeabilität Werte des BBB19zugeordnet sind. Gemäß jener, beobachten wir einen deutlichen Rückgang der Durchlässigkeit der Maus BBTB Mimik für die Na-Fl von 27,63 (± 3,45) x 10-6 cm/s bei Monokulturen, 6,74 (± 3,01) x 10-6 cm/s wenn Co mit Hypoxie-induzierbaren kultiviert k.o.-Faktor (HIFko) Astrozyten (Tabelle 1). Die verewigt HuAR2T bilden hochpermeablen cellular Barrieren (104.92 ± 27,1 x 10-6 cm/s, Tabelle 1). Ähnlich wie das Mausmodell gemessen wir deutlich geringer Durchlässigkeit der BBTB Na-FL, nämlich (± 14.32PA) 47,4 x 10-6 cm/s, wenn die HuAR2T Zellen zusammen mit den menschlichen primäre Astrozyten (Tabelle 1) kultiviert wurden.
In murinen und menschlichen BBTB Mimik induziert die Anwesenheit der Patienten abgeleitet Glioblastom Sphären eine leichte Erhöhung der Permeabilität Werte im Vergleich zu den endothelialen Zellen-Astrozyten Ko-Kulturen allein (Tabelle 1). Dieses Phänomen wird mit mehreren beobachtet, aber nicht alle Patienten Gliom Kugel Modelle. Dies ist möglicherweise aufgrund der VEGF-A, die von einigen dieser Patienten-abgeleitete Zellen abgesondert wird.
Um die Durchlässigkeit von der in-vitro-BBTB Mimik bei der in-vivo BBB vergleichen, abgebildet wir die Echtzeit-Diffusion des Na-Fl durch ein kranialen Fenster in nackten Mäusen implantiert. Verwenden eine Fluoreszenz Stereomikroskop, verzeichnete Na-Fl Diffusion aus der Blutgefäße Kapillaren aus den wichtigsten pial Blutgefäße vor, während und nach der systemische Injektion der Sonde (Abbildung 2). Messungen der differenziellen Fluoreszenz-Werte aus dem zirkulierenden Blut und Gehirn kortikale Parenchym im Laufe der Zeit konnten wir zur Berechnung der ungefähren Permeabilität Werte der nackte Maus's BBB für Na-Fl (5,57 ± 2.19 x 10-6 cm/s, Tabelle 1).
Um zu veranschaulichen, wie diese BBTB Mimik zur Visualisierung der Passage von Verbindungen aus Blut seitlich auf die Gehirn-Seite verwendet werden kann, verglichen wir die Transcytosis Ø 110 nm (NP110) und Ø 350 nm (NP350) Nanopartikel gezielt Patienten abgeleitet Glioblastom Sphären. In-vitro-Ergebnisse wurden dann im Vergleich zu den in-vivo Transcytosis. Im dargestellten Beispiel Nanopartikel waren mit Tumor-targeting Peptid CooP20 Oberfläche beschichtet und geladen mit dem fluoreszierenden Farbstoff (FITC) um die Visualisierung zu erleichtern. Wir mit der Bezeichnung der Zellen unter Verwendung des lysosomalen Farbstoffs und counterstained mit DAPI 24 h nach der Zusatz der FITC Nanopartikel auf der Blut-Seite von der BBTB imitieren und erwarb konfokale Mikrographen auf verschiedenen Ebenen (z. B. der Blut-Seite, die Membran, die Gehirn-Seite und die Patienten Glioblastom-Sphären) (Abb. 3A). Das NP110-assoziierten Fluoreszenzsignal colocalized mit den Lysosomen in den Endothelzellen Astrozyten und Tumorzellen. Darüber hinaus wurden die NP110s erkannten zwischendurch die Endothelzellen und Astrozyten, durch die Membranporen des Einsatzes (Abb. 3A).
Im Laufe der NP110s wurde durch die Messung der Fluoreszenz von Proben von Blut und Gehirn Seite quantifiziert. Diese Durchlässigkeit Werte wurden im Vergleich zu denen für die Nanopartikel der ermittelten ø 350 nm (NP350). Die Ergebnisse zeigen, dass nur NP110 die BBTB Mimik (Abb. 3 b) überqueren konnte. NP350 blieb auf der Blut-Seite des BBTB Mimik, die geringere Durchlässigkeit Werte für diese Nanopartikel führte.
Um die Relevanz der BBTB Mimik im Vergleich zu den in-vivo Modellen zu markieren, wurden nackt Mäuse mit NP110 oder NP350 Nanopartikeln beschichtet mit Tumor-targeting Peptid CooP und konjugiert mit roten Fluoreszenzfarbstoff (TRITC) für den Nachweis intravenös injiziert. Gewebe zu mehreren Zeitpunkten erhoben ergab, dass nach 8 h, BBB-durchlässigen Nanopartikel in Anwesenheit, während die nonpermeable dies haben diejenigen, die im Umlauf waren vor allem von den Körperkreislauf in-vivo gelöscht wurden. Daher, wir sammelten die Gehirne und beziffert die Zahl der Nanopartikel pro Quadratmillimeter 8 h Steroidtherapie. Im Einklang mit der in-vitro-Ergebnisse, NP110, aber nicht NP350 dies erfolgreich in das Gehirn Parenchym (Abbildung 3). Hohe Vergrößerung Bildgebung des Standortes Nanopartikel im Gehirn zeigten, dass NP110 war homogen in der Anwesenheit von außerhalb der Blutkapillaren verteilt und erfolgreich auf die implantierten Glioblastom-Zellen (Abbildung 3D) verwaltet. Trotz den gleichen Tumor gezielt Abstimmungsunterlagen (CooP) ausstellen, NP350 konnte in der Anwesenheit von Leber und wurde nur innerhalb der luminalen Seite des Gehirns Blutgefäße (Abbildung 3E), ähnlich wie die in-vitro-. erzielten Ergebnisse gefunden
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg"> Abbildung 1: Beschreibung der Blut-Hirn-Tumor-Schranke (BBTB) Modell. (A) schematische Darstellung der Standorte der verschiedenen Zelltypen. (B) Darstellung der einfügen-Platzierung auf dem 6-Well-Platte-Cover und die Aussaat Technik für die Astrozyten auf der Gehirn-Seite des Einsatzes's-Membran. (C) Abbildung der 6-Well-Platte Platzierung ermöglicht die Astrozyten Adhäsion. (D) Immunfluoreszenz Mikrographen der tight Junction Proteinen Zonula Occludens-1 (ZO-1, obere Reihe, rot) und Claudin-5 (untere Reihe, grün). Die Proteinexpression ist im Vergleich zu der murine Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen (bEND3) auf der Seite Blut allein BBTB kultiviert, als eine Monokultur (linke Spalte) oder mit murinen verewigt HIFko Astrozyten (rechte Spalte). Zellkerne sind mit DAPI (blau) counterstained. (E) Immunfluoreszenz Schliffbild zeigt die glial fibrillary saure Protein (GFAP, rot) in HIFko Astrozyten Gehirn seitlich der BBTB kultiviert. Die hohe Vergrößerung Bild zeigt Astrozyten Prozesse und Ende-Füße (Pfeile) Kontaktaufnahme mit den endothelialen Zellen durch die Membran Poren (rechte Abbildung). Die Identität des HIFko Astrozyten wurde überprüft, durch Immunfluoreszenz-Färbung des simian Virus 40 große T Antigens (SV40 großen T, grün) für die Verewigung der Zellen verwendet. Endothelzellen express der Astroglia weder das SV40 großen T und daher teilweise durch den transparenten, gegenüberliegenden Seite der Membran als nur DAPI gefärbten Zellen (gestrichelte Linien) beobachtet werden. Zellkerne sind mit DAPI (blau) counterstained. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg"> Abbildung 2: Intravitalen live Bestimmung der Maus BBB Permeabilität. (A) Vorbereitung des Katheters implantierbare kaudalen Vene. (1) Werkzeuge und Ausrüstung sind die folgenden: (ein) ein PE20 Polyethylenschlauch (b) zwei 25 G Nadeln (c), Rochester-Ochsner Zange und (d) eine kleine Bulldogge Klemme. (2) A 25 G Nadel wird durch mehrere Torsionen entfernt mit Hilfe der Zange und (3) sorgfältig in das Rohr eingesetzt. (4) die andere Seite des Rohres ist mit einem anderen 25 G Nadel verbunden. (B) Leitlinien für die Katheter-Implantation und Positionierung der Natrium-Fluorescein-Lösung durch die Rute Vene einer Maus ziehen. Die eingekreiste Bereich zeigt den Bereich, wo ein Tropfen Cyanacrylat-Klebstoff platziert wird, um den Katheter zu sichern. Die Bulldog-Klemme wird verwendet, um den Katheter zu behandeln und entfernt, sobald der Katheter befestigt ist. (C) repräsentative Darstellung und Quantifizierung Methode zur Bestimmung der Natrium-Fluorescein Permeabilität Werte. Vor der Natrium-Fluorescein-Infusion (linke Spalte) bemisst sich der Autofluoreszenz/Blank innerhalb einer Region of Interest (ROI) auf das Gehirn (Abdeckung, weißes Rechteck) und Blutgefäß Bereiche (untere Panel, rotes Rechteck) platziert. Während der Natrium-Fluorescein-Infusion (rechte Spalte) wird die Fluoreszenzintensität in beiden ROIs, so dass die Berechnung der BBB Permeabilität gemessen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg"> Abbildung 3: Vorhersage von Intrazerebrale Transcytosis von Nanopartikeln durch BBB in-vivo mit dem in-vitro-Modell BBTB. (A) grafische Darstellung des BBTB Assays mit repräsentativen konfokale Bilder auf den angegebenen verschiedenen Ebenen des murinen BBTB Modells erhalten. Nanopartikel von 110 nm im Durchmesser (NP110) und konjugierten, FITC (grün) wurden hinzugefügt, um das Blut Seite der BBTB Zellen wurden mit der lysosomalen Sonde (LT-99, rot) gekennzeichnet.  (1) Endothelial Zellen, (2) Endothelial Transcytosis der Nanopartikel durch die Poren der Membran (weiße gestrichelte Linie), (3) Astrozyten, und (4) Patienten Glioblastom Kugeln auf die Grafik identifiziert und entsprechenden konfokale Mikrographen (rechts). Lysosomale Kapselung der Nanopartikel (Pfeile) schlägt aktive Transcytosis durch die Endothelzellen und Astrozyten Schichten der BBTB. (B) Quantifizierung der angegebenen Nanopartikel Durchlässigkeit durch in-vitro-BBTB (n = 6). (C) Quantifizierung der angegebenen Nanopartikel Dichte im Hirngewebe Abschnitte, 8 h nach der kaudalen Vene Infusion der nackte Mäuse (n = 3). (D) konfokale Mikrographen zeigt die Verteilung der Ø 110 nm Nanopartikel (rote NP110) in murine Gehirn Gewebeschnitten beschriftet mit einem Anti-Maus CD31 Antikörper (grün). Der Pfeil markiert die Nanopartikel Transcytosis (linken). Nanopartikel gesammelt um die Gehirn-Tumor-Zellen (Tumor, rechts) aufgrund der CooP-targeting Peptid präsentiert auf ihrer Oberfläche. Keine signifikante Homing wird in das Hirngewebe (Gehirn) beobachtet. (E) konfokale Mikrographen zeigen die Verteilung der ø 350 nm Nanopartikel (rote NP350) in murine Gehirn Gewebe Abschnitte mit der Bezeichnung mit einem Anti-Maus CD31 Antikörper (grün). Pfeilspitzen, die NP350s, die in das Lumen der Blutgefäße beibehalten wurden und waren nicht in der Lage, BBB, wahrscheinlich aufgrund ihrer größeren Durchmesser im Vergleich zu NP110s. Zellkerne zu überqueren sind counterstained mit DAPI (blau). P &lt; 0,01. P-Werte wurden mit einem zweiseitigen, nichtparametrische Mann-Whitney U-Test berechnet. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>murine BBTB Mimik</td>
			<td>bEND3</td>
			<td>bEND3 + HIFko als</td>
			<td>bEND3 + GB</td>
			<td>bEND3 + HIFko als + GB</td>
			<td>In-vivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Durchlässigkeit (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.63</td>
			<td>6.74</td>
			<td>26,8</td>
			<td>10,83</td>
			<td>5.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>3.45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7.99</td>
			<td>2.65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>menschliche BBTB Mimik</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T + hIAs</td>
			<td>HuAR2T + GB</td>
			<td>HuAR2T + hIAs + GB</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Durchlässigkeit (10-6 cm/s)</td>
			<td>104.92</td>
			<td>47,4</td>
			<td>89.08</td>
			<td>48.24</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.1</td>
			<td>14.32PA</td>
			<td>10.21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Werte der Natrium-Fluorescein (Na-Fl) Durchlässigkeit (in Zentimetern pro Sekunde) ermittelt in-vitro- in den angegebenen Kokultur Systemen und in-vivo in den nude Mäusen NMRI. Daten aus einem repräsentativen Experiment (n = 3 Mäuse).

Drug targeting zu Tumoren des zentralen Nervensystems ist eine große Herausforderung. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um eine in-vitro-Mimik der Blut-Hirn-Tumor-Schranke mit murinen und/oder menschlichen Zellen zu produzieren und ihre Relevanz für die Vorhersagbarkeit des zentralen Nervensystems Tumor targeting in vivo zu diskutieren.

Vorhersage In Vivo Nutzlasten Lieferung mit einem Blut-Hirnschranke Tumor in einer Petrischale

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Um neuartige Medikamente und Verbindungen zu entwickeln, die auf Tumore im zentralen Nervensystem abzielen, ist die Zugänglichkeit und der Durchgang durch die Blut-Hirn-Schranke sehr wichtig. Obwohl die Zytotoxizität der Verbindungen leicht durch Inkubation der Zellen mit den therapeutischen Molekülen gemessen werden kann, sagt es nicht wirklich etwas über die tatsächliche Lieferung an die Tumorstelle im Gehirn aus. Um dieses Problem anzugehen, haben wir das folgende Protokoll entwickelt, das beschreibt, wie man die Blut-Hirn-Tumorbarriere in vitro auf einer Schale nachbilden kann.Die Verwendung von verewigten Zellen murinen oder menschlichen Ursprungs macht diesen Test sehr flexibel. Es kann auch leicht skaliert werden, um Dutzende von Verbindungen mit hoher Reproduzierbarkeit zu überprüfen. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode sowohl die Quantifizierung als auch die Visualisierung der Durchgangs- und Targeting-Fähigkeit der Verbindungen, bevor sie mit präklinischen Modellen fortfährt.Daher ersetzt unsere Methode teilweise die Tiermodelle durch die verwendung der vorgefertigten Zelllinien. Die Einbeziehung von vom Patienten abgeleiteten Hirntumorzellen assays the patient heterogenity, während die Verwendung von verewigten Zellen, um die Blut - Hirn-Schranke zu etablieren, die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse gewährleistet. Insgesamt bietet dieses Blut-Hirn-Schrankenmodell ein wirklich interessantes Werkzeug, um die Drogendiffusion oder die Lieferung von Drogenfahrzeugen zu assayen.Die visuelle Demonstration der Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Seeding der Zellen auf der gegenüberliegenden Seite des Inserts eine Manipulation erfordert, die in anderen Protokollen, die ähnliche Einstellungen verwenden, nicht oft beschrieben wird. Zum Beispiel, die Haftung von Astrozyten zu erhalten, wenn der Einsatz auf den Kopf gestellt wird, profitiert sehr von der visuellen Darstellung. Waschen Sie unter einer sterilen Zellkulturhaube die kultivierten Astrozyten vorsichtig mit fünf Millilitern steriler PBS.Verwenden Sie eine Vakuumpumpe, um die PBS vorsichtig zu entsorgen, und fügen Sie zwei Milliliter Zelldissoziationsreagenz für fünf Minuten hinzu, um die Zellen zu lösen. Fügen Sie dann 10 Milliliter steriles vollständiges Astrozytenzellkulturmedium in das Gefäß ein, um die Aktivität des Zelldissoziationsreagenzes zu hemmen. Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um die abgetrennten Zellen aus dem Gefäß in ein steriles 15-Milliliter-Rohr zu übertragen.Zentrifuge bei 250 mal g für drei Minuten bei Raumtemperatur. Legen Sie in der Zwischenzeit die Einsätze fest. Verwenden Sie sterile Zangen, um die Einsätze mit der Gehirnseite auf den Deckel einer sterilen Sechs-Brunnen-Platte zu legen.Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, entsorgen Sie den Überstand vorsichtig aus der Zellsuspension und setzen Sie das Astrozytenpellet in einem Milliliter ABM-plus wieder auf, indem Sie das Pellet bis zu fünfmal sanft an die Rohrwand pfeifen. Zählen Sie dann die Zellen, und passen Sie die Zellsuspensionsdichte auf 150 000 Zellen in 400 Mikroliter ABM-plus pro Einsatz an. Legen Sie die Zellsuspension in die Mitte der Gehirnseite der Membran des Einsatzes und verteilen Sie sie vorsichtig mit Kapillarkraft mit einer sterilen Pipettenspitze.Wenn die Gehirnseite der Einsätze noch hoch ist, legen Sie die Sechs-Well-Platte wieder auf die Einsätze. Legen Sie die Platte und Einsätze, mit der Gehirnseite nach oben, in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um die Zellhaftung zu ermöglichen. Danach kehren Sie die Sechs-Well-Platte wieder in ihre reguläre Position zurück, mit den Einsätzen nun Blut seite oben.Fügen Sie Medium hinzu, und setzen Sie die Inkubation wie im Textprotokoll beschrieben fort. Waschen Sie unter einer sterilen Zellkulturhaube die kultivierten Endothelzellen sorgfältig mit fünf Millilitern sterilem PBS. Verwenden Sie eine Vakuumpumpe, um die PBS vorsichtig zu entsorgen, und fügen Sie zwei Milliliter Zelldissoziationsreagenz für fünf Minuten hinzu, um die Zellen zu lösen.Fügen Sie dann 10 Milliliter steriles vollständiges Endothelzellkulturmedium in das Gefäß ein, um die Aktivität des Zelldissoziationsreagenzzuführens zu hemmen. Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um die abgetrennten Zellen aus dem Gefäß in ein steriles 15-Milliliter-Rohr zu übertragen. Zentrifuge bei 250 mal g für drei Minuten bei Raumtemperatur.Danach entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Endothelzellpellet in einem Milliliter EBM-plus wieder auf, indem Sie die Zellsuspension bis zu fünfmal an der Rohrwand abpfeifen. Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Zellsuspensionsdichte auf 200.000 Zellen in 2,5 Milliliteren endotheliale Zellkultur ohne Serum und vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor A pro Einsatz an. Rufen Sie die Platte mit den Einsätzen ab.Entsorgen Sie das Medium vorsichtig von der Blutseite und ersetzen Sie es durch die 2,5 Milliliter Endothelzellsuspension. Dann kehren Sie die Platte zum Inkubator zurück und lassen Sie sie über Nacht, damit die Endothelzellen an der Membran haften. Am nächsten Tag bereiten Sie eine Sechs-Brunnen-Platte vor, indem Sie drei Milliliter vorgewärmtes ABM-Minus auf jeden Brunnen übertragen.Mit sterilen Zangen die Einsätze behandeln, um das endotheliale Komplettemedium vorsichtig von der Blutseite zu entsorgen, und legen Sie den Einsatz in die neue Platte, die ABM-minus enthält. Fügen Sie dann 2,5 Milliliter EBM-minus hinzu. Lassen Sie die Einsätze im Inkubator mit minimalen körperlichen Störungen oder Temperaturschwankungen für fünf Tage.Ersetzen Sie am Tag der Übertragung das Medium. Zur Immunfluoreszenz-Bildgebung legen Sie bis zu vier runde sterile Borosilikat-Abdeckungen in jeden Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte, die zwei Milliliter Poly-D-Lysin enthält. Bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren.Verwenden Sie in der Zwischenzeit eine sterile serologische Pipette, um die Tumorkugeln vorsichtig aus dem Zellkulturgefäß in ein 15-Milliliter steriles Rohr zu übertragen. Zentrifugieren Sie die Tumorkugeln drei Minuten lang mit 250 mal g. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Kugeln vorsichtig in einem Milliliter GBM-minus wieder auf.Zählen Sie die Zellen, und passen Sie die Zelldichte auf etwa 10.000 Kugeln oder 100.000 Zellen pro Milliliter GBM-minus an. Als nächstes entsorgen Sie das Poly-D-Lysin aus den Brunnen und spülen Sie die Brunnen dreimal mit sterilem PBS ab. Säen Sie jeden Brunnen der Platte mit drei Millilitern der Tumorsphäroidsuspension, und übertragen Sie die Einsätze mit dem BBTB-Mimik auf die Tumorzellsuspension.Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, damit die Blut- und Hirntumorseiten des Assays ins Gleichgewicht kommen. Ersetzen Sie am nächsten Tag die Medien in der Blutseite durch EBM-minus, ergänzt durch die Moleküle, Medikamente oder Nanopartikel von Interesse. Sammeln Sie die Proben im Laufe der Zeit für die direkte Quantifizierung wie zuvor beschrieben.Sammeln Sie zunächst 100 Mikroliter des Mediums sowohl von der Blut- als auch von der Hirnseite der BBTB-Mimik und übertragen Sie sie jeweils auf eine separate flachsbeinige, schwarze 96-Well-Platte für nachfolgende Fluoreszenzmessungen. Als nächstes bereiten Sie eine 50-Mikromolar-Lösung von Natriumfluorescein in EBM-minus vor, um sicherzustellen, dass 2,5 Milliliter pro Brunnen vorbereitet werden. Diese Lösung auf 37 Grad Celsius vorwärmen und die Medien von der Blutseite der Einsätze durch Medien ersetzen, die diese Natriumfluoresceinlösung enthalten.Starten Sie einen Timer, sobald das Medium ausgetauscht wird. Sammeln Sie vorsichtig 100 Mikroliter Medien von der Blut- und Gehirnseite der Einsätze in fünf Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten. Übertragen Sie jede Probe in getrennte Brunnen der entsprechenden schwarzen, 96-Well-Platte.Verwenden Sie einen Plattenleser, um die Fluoreszenz aus den gesammelten Proben zu quantifizieren. Verdünnen Sie zunächst den Lysosomenfluoreszenzfarbstoff auf die entsprechende Arbeitskonzentration in vorgewärmtem Medium. Fügen Sie dies zu den Zellen hinzu und brüten Sie bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 45 Minuten.Dann spülen Sie die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS ab. Entsorgen Sie die PBS, und fügen Sie drei Milliliter eiskaltes 4%Paraformaldehyd in die Brunnen und 2,5 Milliliter in den Einsatz. 10 Minuten auf Eis bebrüten.Danach entsorgen Sie das Paraformaldehyd und spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS ab. Entfernen Sie die PBS, und vereiteln Sie die Zellkerne mit einer DAPI-Lösung in einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter in destilliertem Wasser. Sieben Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Entfernen Sie dann die DAPI, und waschen Sie die Membranen dreimal mit destilliertem Wasser. Schneiden Sie die Membran vorsichtig, entfernen Sie das destillierte Wasser und legen Sie es auf einen Tropfen Montagemedium auf einem Glasmikroskopschlitten. Fügen Sie einen weiteren Tropfen des Montagemediums auf der anderen Seite der Membran hinzu und bedecken Sie es sorgfältig mit einem Borosilikat-Abdeckungsglas.In dieser Studie wurden Endothelzellen mit Astrozyten kokultiviert, um eine Blut-Hirn-Tumor-Barriere-ähnliche Schnittstelle in einem In-vitro-Setup zu bilden. Die konfokale Bildgebung der murinen BBTB-Mimik zeigt die Expression und zelluläre Lokalisation der engen Knotenproteine Zonula occludens-1 und claudin-5 in bEND3. Kontakte zwischen den Endothelzellen und Astrozyten führen eindeutig zur Verlagerung dieser beiden Proteine in die endotheliale Zell-zu-Zell-Kontakte im Vergleich zu den bEND3-Monokulturen.Mit Hilfe der Immunfluoreszenzfärbung zur Visualisierung der GFAP-exezierenden Astrozyten an der Hirnseite der Membran ist es möglich, die astrozytären Prozesse und Endfüße zu beobachten und zu untersuchen, die die Endothelzellen durch die Membran kontaktieren. Um die Permeabilitätswerte der in vitro BBTB-Imitiden mit der In-vitro-Blut-Hirn-Schranke zu vergleichen, wird die Echtzeitdiffusion von Natriumfluorescein durch ein Schädelfenster abgebildet, das bei Nacktmäusen implantiert wurde. Mit Hilfe eines Fluoreszenz-Stereomikroskops wird die Natriumfluoresceindiffusion aus den Kapillaren des Blutgefäßes, die sich aus den hauptpialen Blutgefäßen ergeben, vor, während und nach der systemischen Injektion der Sonde aufgezeichnet.Die Transzytose von Nanopartikeln, die auf von Patienten abgeleitete Glioblastomkugeln abzielen, wird dann verglichen, um zu veranschaulichen, wie diese BBTB-Mimik verwendet werden kann, um den Übergang von Verbindungen von der Blutseite zur Gehirnseite zu visualisieren. Das NP110-assoziierte Fluoreszenzsignal lokalisiert mit den Lysosomen in den Endothelzellen, Astrozyten und Tumorzellen. Darüber hinaus werden NP110s zwischen den Endothelzellen und Astrozyten nachgewiesen, die durch die Membranporen des Inserts gehen.Der Durchgang von NP110s wird durch Messung der Fluoreszenz von Proben quantifiziert, die sowohl von der Blut- als auch von der Gehirnseite gesammelt wurden, und diese Werte werden mit den ermittelten Nanopartikeln verglichen, die 350 Nanometer betragen. Wie man sieht, sind nur NP110s in der Lage, die BBTB-Mimik zu kreuzen, während NP350 auf der Blutseite blieb, was zu niedrigeren Durchlässigkeitswerten für diese Nanopartikel führte. Behandeln Sie den Einsatz mit Vorsicht, und verteilen Sie vorsichtig die Astrozytenzellsuspension auf der Gehirnseite des Inserts ohne direkten Kontakt der Membran.Jede Beschädigung der Membran führt zu Leck. Diese Methode kann angepasst werden, um die Frage nach der Hirnabgabe von peripher verabreichten Nutzlasten zu beantworten. Durch die Verwendung verschiedener Inserts mit größeren Membranporen ist es auch möglich, die Zellextravasation zu untersuchen.Diese Technik kann durch die Verwendung verschiedener Zelltypen geändert werden, um andere zelluläre Barrieren zu imitieren. Es ebnet auch den Weg zu einer verantwortungsvolleren und ethischeren Forschung, mit dem Ziel, die Zahl der Labortiere zu reduzieren, die für die Validierung von Krebsmedikamenten verwendet werden. Bitte beachten Sie, dass Paraformaldehyd eine sehr giftige Chemikalie ist und entsprechend behandelt werden sollte.Achten Sie auch auf ein scharfes Skalpell, um die Membranen aus den Einsätzen zu extrahieren.

predicting-vivo-payloads-delivery-using-blood-brain-tumor-barrier

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Beginnen Sie mit einem Mausmodell des Glioblastoms, einem invasiven Hirntumor.An der Tumorperipherie bleibt die Blut-Hirn-Schranke (BHS) intakt, wobei Endothelzellen Tight Junctions bilden, die den molekularen Eintritt regulieren.Die Maus ist mit einer am Kopf angebrachten optischen Faser ausgestattet, um Laserlicht zu liefern.Verabreichen Sie einen Infrarotlaser mit geringer Intensität, der die Haut und den Schädel durchdringt, um das Gehirn zu erreichen.Der Laser regt molekularen Sauerstoff...

Laserinduzierte Störung der Blut-Hirn-Schranke für die Verabreichung von Liposomen in ein Mausmodell des Glioblastoms

In diesem Video beschreiben wir ein umfassendes Protokoll zur Etablierung eines In-vitro-Modells, das die Blut-Hirn-Tumor-Schranke nachahmt. Das Modell verspricht, die Verabreichung von Therapeutika für die Behandlung von Hirntumoren zu verstehen.

Blut-Hirn-Tumor-Schranke oder BBTB-Modell: Eine Anpassung des Blut-Hirn-Schranken- oder BHS-Modells zur Bewertung der Verabreichung von Therapeutika an den Tumor

Dieses Video beschreibt einen Permeabilitätsassay zur Bewertung der Permeabilität der in vitro Blut-Hirn-Schranke mit Natriumfluoresceinmolekülen.

Assay zur Nachahmbarkeit der Blut-Hirn-Schranke: Ein In-vitro-Assay zur Beurteilung der Durchlässigkeit von BHS-Nachahmung gegenüber Tracermolekülen

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

Das Gehirn ist ein einzigartiger Ort mit Eigenschaften, die nicht gut durch in vitro-oder Eileiter Analysen dargestellt. Orthotopen Mausmodellen mit reproduzierbaren Lage und Wachstumseigenschaften zuverlässig mit intrakraniellen Injektionen mit einem stereotaktischen Fixierung Instrument und eine Niederdruckspritzenpumpe erzeugt werden.

Erstellen Anatomisch genaue und reproduzierbare intrakranielle Xenografts der Menschen Hirntumoren

Wir führen ein Protokoll zur Messung der Echtzeit-Arzneimittel- und Strahlungsreaktion von metastasierenden Zellen des Brustkrebsgehirns in einem organotypischen Gehirnschnittmodell ein. Die Methoden bieten einen quantitativen Assay, um die therapeutischen Wirkungen verschiedener Behandlungen auf Hirnmetastasen von Brustkrebs in einer Ex-vivo-Weise innerhalb der Mikroumgebungsschnittstelle des Gehirns zu untersuchen.

Ein Ex-vivo-Gehirnschnittmodell zur Untersuchung und Bekämpfung des metastasierenden Tumorwachstums von Brustkrebs im Gehirn

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Etablierung eines menschlichen Blut-Hirn-Schranken-Modells (BBB). Die Endothelzellen und Perizyten werden auf jeder Seite eines Einsatzfilters (Blutkompartiment) ausgesät, und Astrozyten werden in der unteren Vertiefung (Gehirnkompartiment) ausgesät. Das charakterisierte Modell wurde für Nanopartikeltransportexperimente verwendet.

Ein Dreifachkulturzellsystem, das die menschliche Blut-Hirn-Schranke modelliert

Die Verwendung eines immunkompetenten, autochthonen Tumormodells, das von häufigen Patientenmutationen angetrieben wird, für präklinische Tests ist für immuntherapeutische Tests von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Generierung von Hirntumor-Mausmodellen unter Verwendung der elektroporationsbasierten Verabreichung von Plasmid-DNA, die häufige Patientenmutationen repräsentieren, und liefert so ein genaues, reproduzierbares und konsistentes Mausmodell.

Modellierung von Hirntumoren in vivo unter Verwendung der elektroporationsbasierten Verabreichung von Plasmid-DNA, die die Mutationssignaturen von Patienten repräsentiert

Die Blut-Hirn-Schranke ist eine große Hürde bei der Bereitstellung von Therapien für das Glioblastom, eine Krankheit, für die es keine Heilung gibt. Hier berichten wir über eine in vivo bildgesteuerte therapeutische Nanoplattform für Eisenoxid, die diese physiologische Barriere aufgrund ihrer Größe umgehen und sich im Tumor anreichern kann.

Nanopartikel-Verabreichung einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell

Die Entwicklung von orthotopen pädiatrischen Hirntumormodellen erfordert akribische Präzision, bei der Krebszellen mit einem stereotaktischen Gerät präzise implantiert werden. Die hier vorgestellte Methodik beschreibt die Schritte bei der Vorbereitung von Hirntumorzellen, der Durchführung intrakranieller Injektionen und der Implementierung eines postoperativen Überwachungssystems zur Beurteilung der Hirntumortransplantation.

Etablierung von orthotopen patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen für Hirntumoren mit Hilfe eines stereotaktischen Geräts

Erfahren Sie, wie Sie ein in vitro Modell der Blut-Hirn-Tumor-Schranke mit murinen und humanen Zellen erstellen. Diese Methode ermöglicht die Vorhersage der Arzneimittelzufuhr zu ZNS-Tumoren und reduziert den Bedarf an Tierversuchen.

Vorhersage In Vivo Nutzlasten Lieferung mit einem Blut-Hirnschranke Tumor in einer Petrischale

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