Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

3D-Einzelmolekül-Tracking kann die subzellulären Lokalisierungen und Bewegungsverhalten einzelner Proteine bestimmen. Die Beobachtung der Bewegung eines Proteins in einer lebenden Zelle liefert wichtige Einblicke in die Interaktion mit Bindungspartnern in seiner heimischen Umgebung. Die hier vorgestellte Methode bietet einen allgemeinen Rahmen für die Analyse von Tracking-Daten mit einzelnen Molekülen, um die diffusiven Zustände biologischer Moleküle aufzulösen.

Es kann sowohl auf 2D- als auch auf 3D-Trajektorien angewendet werden, die auf beliebig geformte Zellvolumen beschränkt sind. Nach der Ablagerung von fluoreszierender Perle in einem vorgefertigten Agarose-Pad, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, legen Sie es auf einen Mikroskopdeckel-Slip und befestigen Sie den Deckelschlupf am Mikroskopprobenhalter. Der Probenhalter wird dann auf ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop montiert.

Dann initialisieren Sie die grafische Benutzeroberfläche des Mikroskops; hier wird kundenspezifische Software in MATLAB zur Instrumentensteuerung verwendet. Initialisieren Sie die Kamerasoftware HCImage Live. Legen Sie auf der Registerkarte Aufnahme unter dem Abschnitt Kamerasteuerung die Belichtungszeit auf 0,03 Sekunden fest, und klicken Sie dann auf Live, um einen Live-Feed der Kamera zu starten.

Klicken Sie auf die entsprechende Schaltfläche Laser öffnen auf der GUI-Schnittstelle, um den Laser zu entsperren und die fluoreszierenden Perlen auf dem Agarose-Pad zu erregen. Zeigen Sie die Fluoreszenzemission auf der Kamera im Livestream-Modus an. Passen Sie die X- und Y-Positionen der Mikroskopstufe an, indem Sie auf die XY-Positionspfeile unter dem Abschnitt Mikro-Positionierungsstufe der Benutzeroberfläche klicken, um mindestens eine fluoreszierende Perle in der Mitte des Sichtfeldes zu positionieren.

Ändern Sie ggf. die Schrittgröße, indem Sie auf das Dropdown-Feld unter den Pfeilen klicken. Passen Sie als nächstes die Z-Position der Mikroskopstufe an, indem Sie auf die Z-Positionspfeile unter dem Abschnitt Nano-Positionierungsstufe klicken. Legen Sie die Ausrichtung der Doppelhelix-Punkt-Spread-Funktion der fluoreszierenden Perle vertikal fest.

Diese vertikale Ausrichtung wird als Ausgangspunkt in der Z-Kalibrierung definiert. Scannen Sie 30 Schritte über und unter der Start-Z-Position in 50 Nanometer-Schritten. Zeichnen Sie 10 Frames bei jedem Schritt mit einer Belichtungszeit von 0,03 Sekunden auf.

Um die automatisierte Datenerfassung zu starten, klicken Sie unter Z-Kalibrierung auf Gehen. Zentrifugieren Sie einen Milliliter hitzegeschockter Yersinia enterocolitica Kultur bei 5.000-facher Schwerkraft für drei Minuten bei Raumtemperatur, entfernen Sie dann die Kultur und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das Pellet dreimal mit einem Milliliter M2G-Medien.

Nach der endgültigen Spülung, setzen Sie die pelletierten Bakterien in 250 Mikroliter M2G-Medien. Als nächstes fügen Sie fluoreszierende Perlen als Treuhandmarker zu verwenden. Die fluoreszierende Perlenlösung sollte so hinzugefügt werden, dass es nur ein bis zwei Perlen pro Sichtfeld gibt, wenn man sie im Mikroskop betrachtet.

Mischen Sie die Suspension vorsichtig durch Wirbeln, um alle aggregierten Zellen zu trennen und 1,5 Mikroliter der Suspension auf ein 1,5 bis 2%Agarose-Pad aus M2G zu legen, dann das Pad invertieren und auf einen ozongereinigten Mikroskopdeckel legen. Fügen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Mikroskopobjektiv und legen Sie den Probenhalter auf die Mikroskopstufe und sichern Sie ihn an Ort und Stelle. Initialisieren Sie die grafische Benutzeroberfläche, um die Kamera, die Probenphase und die Anregungslaser des Mikroskops zu steuern, und initialisieren Sie dann die Kamerasoftware.

Legen Sie auf der Registerkarte Aufnahme unter dem Abschnitt Kamerasteuerung die Belichtungszeit auf 0,025 Sekunden fest, und klicken Sie dann auf Live, um einen Live-Feed der Kamera zu starten. Passen Sie die X- und Y-Positionen der Mikroskopstufe an, indem Sie auf die XY-Positionspfeile unter dem Abschnitt Mikropositionierstufe klicken, um die Probe zu scannen und ein Sichtfeld mit einer entsprechend dichten Population von Bakterienzellen zu finden. Um den Datendurchsatz zu maximieren, sollte die Zelldichte auf dem Abdeckzettel so hoch wie möglich sein, ohne dass sich die Zellen überlappen oder berühren.

Das Sichtfeld sollte auch mindestens eine fluoreszierende Perle als Treuhandmarker enthalten, damit die Stufenverschiebung gemessen werden kann, während die Daten erfasst werden. Passen Sie als nächstes die Z-Position der Mikroskopstufe an, indem Sie auf die Z-Positionspfeile unter dem Abschnitt Nano-Positionierungsstufe klicken, so dass die doppelhelixischen Punkt-Spread-Funktionslappen der fluoreszierenden Perlen vertikal sind. Gehen Sie dann zu Sequenz und wählen Sie Scan-Einstellungen aus.

Ändern Sie die Anzahl der Frameanzahl in 20.000. Wählen Sie als Nächstes einen Speicherzielordner aus, indem Sie auf die Schaltfläche mit drei Punkten klicken. Klicken Sie schließlich auf Start, um bis zu 20.000 Kamerabilder mit einer kurzen Belichtungszeit von 0,025 Sekunden zu sammeln.

Wenn Sie fertig sind, blockieren Sie die Laserbeleuchtung, indem Sie auf die entsprechende Schaltfläche Laser schließen in der grafischen Benutzeroberfläche klicken. Dann sammeln Sie 200 Bilder mit dunklen Bildern mit der gleichen Belichtungszeit. Aktivieren Sie das Kästchen neben Thorlabs LED und klicken Sie dann auf Mirror Up umschalten. Dies schaltet das LED-Licht über der Probe ein und schaltet das Mikroskop vom Fluoreszenzweg auf den Phasenkontrastweg um.

Initialisieren Sie die Datenerfassungssoftware auf dem Phasenkontrastpfad und drücken Sie die Schaltfläche Start/Stop Live Display, um einen Live-Feed von der Kamera anzuzeigen. Klicken Sie dann auf Erfassen und Gehe, um das Bild zu speichern, um ein Phasenkontrastbild der Zellen im aktuellen Ansichtsfeld zu sammeln. Passen Sie die fluoreszierende Perle für den Einsatz als Treuhandmarker an.

Suchen und Passen aller Lokalisierungen und aller Kamerarahmen mithilfe der Vorlagenschwellenwerte, wie im Textprotokoll beschrieben. Klicken Sie im Abschnitt Lokalisieren von DHPSF SM in der Easy-DHPSF-GUI auf Ausführen, um einzelne Molekülsignale anzupassen, und klicken Sie dann auf OK in den folgenden Popupfenstern, um die Standardeinstellungen beizubehalten. Die Software findet einmolekulare Fluoreszenzsignale, die der Doppelhelix-Punkt-Spread-Funktion ähneln und dann versuchen, sie mit einem Doppel-Gauß-Modell zu passen.

Während das Skript ausgeführt wird, wird der Benutzer eine Anzeige der Rohbilddaten sowie ein rekonstruiertes Bild der erfolgreich angepassten Einzelmolekülsignale sehen. Verwenden Sie benutzerdefinierte Software in MATLAB, indem Sie manuell fünf Kontrollpunktpaare im Pop-up-Fenster auswählen, indem Sie grob schätzen und auf die Zellpole der gleichen fünf Zellen sowohl in den Einzelmolekül-Lokalisierungsdaten als auch auf Zellumrisse klicken. Löschen Sie Zellen mit weniger als 10 Lokalisierungen, und entfernen Sie Zellen, die teilweise außerhalb des Ansichtsfelds positioniert sind, und löschen Sie dann alle zusätzlichen unerwünschten Zellen im Popupfenster, indem Sie in die Gliederung ihrer Zellen klicken.

Weisen Sie schließlich Lokalisierungen zu, die sich innerhalb der Grenze der Gliederung einer Zelle befinden, zu dieser Zelle. Verwerfen Sie alle Lokalisierungen, die sich nicht innerhalb einer Zellumrisslinie befinden. Ein entscheidender Faktor für die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls ist es, sicherzustellen, dass die Einmolekülsignale gut voneinander getrennt sind.

Wenn sich mehr als ein Fluoreszenzmolekül gleichzeitig in einer Zelle befindet, kann die Lokalisierung der Flugbahn eines anderen Moleküls falsch zugeordnet werden. Dieses Protokoll wird das Verknüpfungsproblem beseitigt, indem alle Flugbahnen verworfen werden, für die zwei oder mehr Lokalisierungen gleichzeitig in derselben Zelle vorhanden sind. Wenn also einmolekulare Signale zu dicht sind, wird eine große Menge dieser Daten während der Verarbeitung automatisch verworfen.

Je nach Expressionsniveau der fluoreszierend markierten Fusionsproteine können pro Zelle etwa 200 bis 3 000 Lokalisationen erzeugt werden. Diese Lokalisierungen können zwischen 10 und 150 Flugbahnen ergeben. Eine große Anzahl von Flugbahnen ist notwendig, um gut beprobte Verteilungen zu erzeugen.

Hier ist das Histogramm der scheinbaren Diffusionskoeffizienten für fast 80.000 Einzelmolekül-Trajektorien des Yersinia Enterocolitica Typ 3 Sekretionsproteins YscQ mit fluoreszierendem Protein eYFP gekennzeichnet. YscQ bindet an membranintegrierte Injektionen, was zu einem Bruchteil von Molekülen führt, etwa 24%, die nicht diffundieren, wie die in Schwarz gezeigte Verteilung zeigt. Die restlichen YscQ-Moleküle diffundieren frei im Zytosol.

Während der hier beschriebenen Methode wird festgestellt, dass ungebundene YscQ-Moleküle in mindestens drei unterschiedlichen diffusiven Zuständen existieren. Zu dieser Schlussfolgerung wurde die Verteilung der scheinbaren Diffusionskoeffizienten mit einer Bibliothek simulierter Verteilungen mit bekannten Diffusionskoeffizienten gebracht. Beim Versuch, mehrere diffusive Zustände aufzulösen, sollten mehrere tausend Einzelmolekülbahnen gesammelt werden, um sicherzustellen, dass die scheinbaren Diffusionskoeffizientenverteilungen sehr gut beprobt werden.

Ein-Molekül-Tracking kann in Wildtypzellen oder in genetischen Deletionsmutanten durchgeführt werden, um festzustellen, ob bestimmte diffusive Zustände nur manifestieren, wenn ein molekularer Bindungspartner vorhanden ist. Durch die Auflösung der diffusiven Zustände von zytosolischen Proteinen und Proteinkomplexen mittels 3D-Einzelmolekül-Tracking können Forscher bestimmen, wo, wann und wie sich oligomere Proteinkomplexe in lebenden Zellen bilden. Die Arbeit mit Hochleistungslaserquellen und lebenden menschlichen Krankheitserregern kann extrem gefährlich sein.

Angemessene Lasersicherheits- und Biosicherheitsprotokolle sollten immer befolgt werden.