Direkte Messung des KDM1A Target Engagements mit Chemoprobe-basierten Immunoassays

Die Bewertung des Zielengagements, d. h. der Wechselwirkung eines Arzneimittels mit dem Protein, für das es entwickelt wurde, ist eine Grundvoraussetzung für die Interpretation der biologischen Aktivität jeder Verbindung in der Arzneimittelentwicklung oder in Grundlagenforschungsprojekten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine direkte Messung des Dosiseffekts und der Dynamik des KDM1A-Zielengagements anstelle von Messungen von nachgelagerten Effekten wie Histonmarkierungen und Expression ermöglicht. Diese Technik kann in der Grundlagenforschung und auch in klinischen Studien, bei onkologischen ZNS oder anderen Krankheiten, die mit KDM1A-Hemmer behandelt werden, zur Untersuchung der Pharmakodynamik angewendet werden.

Diese Technik basiert auf einer Chemoprobe entwickelt, um ORY-1001 zu studieren, iadademstat, aber kann wirklich für andere KDM1A-Hemmer verwendet werden und die Strategie kann auf andere Ziele angewendet werden. Das Verfahren wird von Raquel Ruiz, Betriebsleiter der PK/PD-Erkennungsplattform aus meinem Labor, demonstriert. Während der Zellbehandlung mit ORY-1001 bindet die Verbindung an das im Zellkern vorhandene KDM1A-Protein.

Um dieses Verfahren zu beginnen, rufen Sie eine 10-Mikroliter-Einweg-Aliquot von 20 Millimolar biotinytd Sonde OG-881 Stofflösung aus dem Kühlschrank und lassen Sie es bei Raumtemperatur für 10 Minuten aufwärmen. Mit einer Mikropipet mit Filterspitzen die Stammlösung seriell verdünnen, um die beiden mikromolaren Arbeitslösungen vorzubereiten. Als nächstes lösen Sie eine Tablette proTease-Hemmer in einem Milliliter PBS in einem Mikrozentrifugenrohr auf.

Mischen Sie für jeden Milliliter des gewünschten Volumens des 1x Zelllysepuffers mit der Chemoprobe 100 Mikroliter kommerziellen erhaltenen 10x Zelllysepuffer, 150 Mikroliter des 10x Protease-Inhibitors, 12,5 Mikroliter der beiden mikromolaren OG-881 Arbeitslösung und 737,5 Mikroliter Typ-1-Doppeldestillwasser. Die Zellen werden in 1x Lysepuffer in Gegenwart der Chemoprobe lysiert, die an jedes freie KDM1A-Protein bindet. Um aus Geweben zu bereiten, verwenden Sie einen Mörtel und Stößel, die auf Trockeneis gekühlt werden, um ein ein Kubikzentimeter Stück gefrorenes Gewebe zu pulverisieren und zu homogenisieren.

Aliquot das Gewebe in Einweg-Fläschchen, stellen Sie sicher, etwa 40 Milligramm Gewebepulver in jede Durchstechflasche zu übertragen, während zu jeder Zeit auftauen zu vermeiden. Bewahren Sie die Proben bei 80 Grad Celsius auf, bis sie verarbeitet werden können. Zur Herstellung aus Zellpellets, setzen Sie das Pellet von etwa 10 Millionen Zellen in 200 Mikroliter 1x Zelllysepuffer mit 25 Nanomolar OG-881.

Wirbel jede Probe kurz und halten Sie sie auf Eis für fünf Minuten. Mit einem Beschallungsmittel beschallen Sie die Proben mit drei Impulsen bei jeweils 45 Kilohertz, die jeweils 20 Sekunden dauern. Legen Sie die Proben 20 Sekunden lang zwischen den Impulsen auf Eis.

Halten Sie die Proben für weitere fünf Minuten auf Eis. Dann wirbeln Sie kurz und zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 mal G für 10 Minuten in einer Zentrifuge, die bei vier Grad Celsius vorgekühlt ist. Mit einem Milliliter Mikropipet übertragen Sie jeden Überstand in ein separates 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr.

Lassen Sie die Rohre vor der Verarbeitung zwei Stunden auf Eis. Dann quantifizieren Sie das native Protein mit dem Bradford-Assay, wie im Textprotokoll beschrieben. Eine Gesamtplatte ist mit Anti-KDM1A-Antikörperbeschichtet.

Freie Platte ist mit Streptavidin beschichtet. Zelllysat wird dann beiden Platten hinzugefügt und der KDM1A-Komplex wird direkt oder durch die Chemoprobe erfasst. Die Platten werden mit dem Anti-KDM1A-Detektionsantikörper und einem sekundären Antikörper, der an Meerrettichperoxidase gekoppelt ist, gewaschen und inkubiert.

Schließlich wird lumineszierendes Substrat hinzugefügt und Signal erzeugt. Für den gesamten KDM1A ELISA 10 Milliliter KDM1A-Capture-Antikörper in PBS auf eine Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter pro Platte vorbereiten. 100 Mikroliter in jeden Brunnen der Platte geben.

Für den kostenlosen KDM1A ELISA 10 Milliliter Streptavidin in PBS in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter pro Platte vorbereiten. 100 Mikroliter in jeden Brunnen der Platte geben. Dann jede Platte mit Klebefolie versiegeln und über Nacht bei vier Grad Celsius bebrüten.

Am nächsten Tag die Teller aus dem Kühlschrank nehmen und bei Raumtemperatur ca. 45 Minuten auslagern lassen. Waschen Sie jede Platte dreimal mit Waschpuffer, stellen Sie sicher, dass die Platte auf Papiertücher nach jedem Waschschritt tippen, um jede Restlösung zu entfernen. Fügen Sie 200 Mikroliter Blockierpuffer zu jedem Brunnen beider Platten hinzu.

Oben die Platten mit Klebefolie versiegeln und bei Raumtemperatur zwei Stunden lang inkubieren. In der Zwischenzeit die zuvor erhaltenen nativen Proteinextrakte mit PBS auf die entsprechende Konzentration verdünnen und die Platte so auslegen, dass eine Standardkurve mit humanem rKDM1A vorbereitet wird, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem die zweistündige Inkubation abgeschlossen ist, entsorgen Sie den Sperrpuffer und waschen Sie die Platten mit Waschpuffer, um die Platte nach jedem Waschschritt auf Papiertücher zu tippen, um restliche Lösung zu entfernen.

Die entsprechenden verdünnten Proben in einen gekühlten 96-Tiefbrunnenspeicherblock nach der Plattenverteilung in Tabelle 2 des Textprotokolls übertragen. Halten Sie diesen Block auf Eis, während Sie 100 Mikroliter pro Brunnen in die gesamte und freie ELISA-Platten nach der Plattenverteilung in Tabelle 3 des Textprotokolls pipetieren. Bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubieren, dann die Proben entsorgen und die Platten fünfmal mit Waschpuffer waschen.

Bereiten Sie 20 Milliliter Kaninchen Anti-KDM1A-Detektionsantikörper in Blockierpuffer in einer Konzentration von 0,125 Mikrogramm pro Milliliter vor. Fügen Sie 100 Mikroliter der Detektions-Antikörperlösung zu jedem Bohrkörper beider Platten hinzu, mit Ausnahme derjenigen, die den Negativkontrollen entsprechen. Die Platten mit Klebefolie versiegeln und bei Raumtemperatur eine Stunde lang bebrüten.

Danach entsorgen Sie die Detektions-Antikörperlösung und waschen Sie die Platten sechsmal mit Waschpuffer. Bereiten Sie 25 Milliliter sekundären Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper, HRP, auf eine Verdünnung von ein bis 5 000 im Sperrpuffer vor. Fügen Sie 100 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung zu jedem Brunnen der Mikrotiterplatten hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für eine Stunde.

30 Minuten vor dem Ende dieser Inkubation zu gleichen Teilen der Luminol-Enhancer- und Peroxidlösung in einer Bernsteinflasche unter weichen Lichtbedingungen mischen. Lassen Sie diese Mischung bei Raumtemperatur. Wenn die einstündige Inkubation abgeschlossen ist, entsorgen Sie die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie die Platten sechsmal mit Waschpuffer.

Als nächstes, Pipetten 100 Mikroliter der Luminol Arbeitslösung zu jedem Brunnen der Platten, sicherstellen, sehr langsam Zurohr, um Blasenbildung zu vermeiden. Verwenden Sie einen Timer, um die Zeit zwischen dem Hinzufügen der Lösung und der Lumineszenzmessung der Platten zu steuern und diese Zeit konstant zu halten, um eine gute Reproduzierbarkeit zwischen dem Test zu erreichen. Top versiegeln die Platten mit Klebefolie und Zentrifuge bei 500 mal G und bei Raumtemperatur für 45 Sekunden, um restliche Blasen zu beseitigen.

Die Platten auf einem Plattenschüttler bei 100 Umdrehungen pro Minute für eine Minute inkubieren. Entfernen Sie dann den Klebefilm und legen Sie die Platte in einen Mikroplattenleser ein und lassen Sie sie drei Minuten liegen, um die Temperatur bei 25 Grad Celsius zu stabilisieren. Lesen Sie die relativen Lumineszenzeinheiten jedes ELISA-Platten-Assays.

Speichern und kopieren Sie die unformatierten RLU-Werte aus den Rohdatentabellendateien zur weiteren Analyse. In dieser Studie wird ein neuartiger KDM1A-Chemoprobe-Capture-basierter ELISA verwendet, um die KDM1A-Zielinteraktion in Zellen und Gewebeproben direkt zu messen. Die RLU-Werte der Gesamt- und freien rKDM1A werden bewertet, um die Linearität zu überprüfen.

Die RLU-Werte der gesamt- und freien KDM1A, die in menschlichen PBMCs von drei unabhängigen Freiwilligen nachgewiesen wurden, werden dann auf der Standardkurve überlagert. AML-Zellen werden nach Dener-Empfehlungen kultiviert und mit Fahrzeug oder ORY-1001 in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt. Der native Proteinextrakt wird in Gegenwart von 25 Millimolar OG-881 Chemoprobe erhalten und 0,5 Mikrogramm Gesamtprotein werden verwendet, um die Analyse des Zieleingriffs durchzuführen.

Die Gesamt- und freie KDM1A werden dann ermittelt und die Prozentsätze des Zielengagements von ORY-1001 zu KDM1A werden relativ zum Fahrzeug berechnet. Die dosisresponsive KDM1A-Zielinteraktion in PBMCs und bei der Lungenbehandlung von Ratten mit ORY-1001 durch orale Gavage, berechnet relativ zur Fahrzeuggruppe, wird hier dargestellt. Die Ex-vivo-Inkubation mit 25 nanomolaren ORY-1001 von Lungenproteinextrakten aus den mit dem Fahrzeug behandelten Tieren ergibt noch volle TE, erhöht TE jedoch nicht weiter bei Proben von Ratten, die vier Tage lang mit 30 Mikrogramm pro Kilogramm ORY-1001 behandelt wurden, was bestätigt, dass KDM1A in vivo bereits vollständig gehemmt wurde.

Dieses Protokoll bewertet das KDM1A-Zielengagement, indem es freie und gesamtkundliche KDM1A misst. Denken Sie daran, es erfordert native Proteinextraktion. Diese Technik kann an Proben verschiedener Arten verwendet werden, um einen bestimmten Inhibitor zu bewerten, auch um auf neue Inhibitoren zu prüfen.

Die in dieser Studie verwendete Chemoprobe kann auch für Chemoproteomik zur Untersuchung des KDM1A-Interinteractums angewendet werden. Denken Sie daran, sicher zu arbeiten und jederzeit vorbeugende Maßnahmen beim Umgang mit biologischen Proben und bioaktiven Verbindungen wie KDM1A-Hemmer zu respektieren.