Methode, um Muster der Atmung in seneszierenden Mäusen durch hemmungslose Barometrische Plethysmographie zu erhalten

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Muster der Atmung bei Mäusen zu messen. Wichtig ist, dass es die Auswirkungen von aktiven Verhaltensweisen in genetisch veränderten Stämmen minimieren kann, die Ergebnisse verwirren können. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie nicht invasiv ist und nicht die Verwendung von anästhetischen oder stressinduzierenden Beschränkungen erfordert.

Beginnen Sie, indem Sie sicherstellen, dass alle Schläuche und Rohre mit der barometrischen Plethysmographenkammer verbunden sind, und indem Sie ein Gaszuflussrohr und ein Vakuumabflussrohr direkt an die barometrische Plethysmographiekammer anschließen. Um den niedrigen Durchfluss in die Kammer zu kalibrieren, stellen Sie den Durchfluss in und aus der Kammer auf Null und entfernen Sie das Durchflussrohr in die Kammer. Schalten Sie das Vakuum aus und geben Sie eine Null in die Zelle mit niedriger Einheit ein, um den Nullstrom im 7700 Verstärker-Setup der barometrischen Plethysmographen-Software aufzuzeichnen.

Dann das Zuflussrohr wieder anbringen und den Vakuumstrom einschalten, um den hohen Durchfluss zu kalibrieren und 20,93% sauerstoffsymmetrisches Stickstoffgas durch die barometrische Plethysmographiekammer aus dem Gasmischer fließen zu lassen. Konvertieren Sie als Nächstes den vom Durchflussmesser gemessenen Zuflusswert von Litern pro Minute in Milliliter pro Sekunde, und klicken Sie auf die Zelle mit hoher Einheit, um den Wert in Milliliter pro Sekunde einzugeben. Doppelklicken Sie auf high cal, ändern Sie die Zeit auf drei Sekunden und klicken Sie auf Messen.

Lassen Sie dann die 7700 Verstärker-Setup-Registerkarte offen, um die metabolischen Analysatoren auf die barometrische Plethysmographie-Software zu kalibrieren. Um den metabolischen Analysator im Gasmischerprogramm zu kalibrieren, stellen Sie den Gasmischer auf 20,93% Sauerstoff und 79,07% Stickstoff ein. Und auf dem metabolischen Analysator, stellen Sie die Sauerstoffkalibrierung auf 20,93% und das Kohlendioxid auf 0%Drehen Sie das Zifferblatt zurück zu Probe, sobald die entsprechenden Werte auf den Gasanalysatoren eingegeben wurden, um den hohen Sauerstoff- und niedrigen Kohlendioxidanteil einzustellen.

Klicken Sie auf die ABCD 4 Registerkarte der barometrischen Plethysmographie-Software und geben Sie 20.93 unter hoher Einheit der C2-Linie für Sauerstoff ein. Ändern Sie unter hoch kal die Zeit auf drei Sekunden, und klicken Sie auf Messen. Geben Sie Null unter niedrigem Kal der C3-Linie für Kohlendioxid ein.

Ändern Sie dann die Zeit auf drei Sekunden, und klicken Sie unter niedrig kal auf Messen. Ändern Sie im Gasmischerprogramm den Sauerstoffwert auf 10 % und den Kohlendioxidwert auf 5 % und warten Sie mehrere Minuten, bis sich der Gasstrom an diese Werte anpasst. Drehen Sie bei den metabolischen Analysatoren die Einstellknöpfe, um das Kohlendioxid auf 5 % zu kalibrieren, wobei darauf geachtet wird, das Zifferblatt nach der Kalibrierung der Werte wieder zur Probe zu drehen.

Nachdem Sie überprüft haben, ob die Messwerte des Analysators stabil sind, klicken Sie auf eine hohe Einheit unter C3 und geben Sie fünf für Kohlendioxid ein. Ändern Sie dann hoch kal auf drei Sekunden und klicken Sie auf Messen. Klicken Sie unter der Option C2 auf niedrige Einheit, geben Sie 10 für Sauerstoff ein, und klicken Sie auf Low cal, geben Sie drei Sekunden ein und klicken Sie auf Messen.

Ändern Sie den Gasmischer wieder auf 20,93% Sauerstoff und 79,07% Stickstoff und warten Sie einige Minuten, bis sich die Kammer an diese Werte anpasst. Führen Sie routinemäßig zusätzliche Kalibrierungen mit zertifizierten Gastanks durch, um zu bestätigen, dass der Durchflussmischer und die Sauerstoff-Kohlendioxid-Analysatoren ordnungsgemäß funktionieren. Wenn die metabolischen Analysatoren kalibriert wurden, überprüfen Sie die mit der barometrischen Plethysmographenkammer verbundenen Durchflussmesser erneut und passen Sie den Luftstrom in und aus der Kammer auf die für das Experiment geeigneten Raten an.

Wenn alle Einstellungen auf die barometrische Plethysmographie-Software angewendet wurden, klicken Sie auf der Registerkarte "Erfassung schließen". Schlagen Sie die Aufnahme an, benennen Sie die Datei und klicken Sie auf OK, um mit der Aufnahme zu beginnen. Für hemmungslose Barometrische Plethysmographie, erfassen Sie das Gewicht und die anfängliche Körpertemperatur der Maus, bevor Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurück.

Warten Sie 10 Minuten, um die Sauerstoff- und Kohlendioxiddaten im Hintergrund aus der leeren Kammer zu sammeln, bevor Sie die Maus in die Kammer legen. Dokumentieren Sie in der ersten Stunde das Verhalten des Tieres und machen sie detaillierte Notizen, die die spezifischen Werte des Ein- und Abflusses der Kammer enthalten. Achten Sie am Ende der Kammerbehausung auf Segmente der leisen Atmung für die nächsten 60 Minuten, indem Sie körpertemperaturmessungen alle 10 Minuten durchführen, wenn Sie ein implantierbares Gerät verwenden.

Achten Sie darauf, sich mit allgemeinen Mausverhalten vertraut zu machen, so dass Fälle von ruhiger Atmung ohne Schnüffeln, Pflegen oder Erforschen angemessen identifiziert werden können. Am Ende des Experiments, kehren Sie die Maus in ihren Käfig zurück und reinigen und wischen Sie die Ausrüstung gründlich ab. Für eine Stoffwechselanalyse öffnen Sie das Stoffwechselpanel in der Software und erhalten den Durchschnitt der ersten 10 Minuten des Sauerstoff- und Kohlendioxidgehalts, wenn die Kammer leer war.

Zeigen Sie das Flussbedienfeld der barometrischen Plethysmographie-Software an, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Attribut analysieren, um die entsprechenden Parameter festzulegen. Bestätigen Sie für ein Muster der Atemanalyse die Zeiten für die 15 Sekunden der stillen Atmung mit Anmerkungen über das Verhalten von Tieren sowie der Ablauftafel. Geben Sie dann die Zeiten unter dialogöffnen von der Registerkarte Datenparser ein und klicken Sie auf Parser-Ansichtsmodus, um nur die spezifischen 15-Sekunden-Segmente anzuzeigen, die von Interesse sind.

Um Apnoen und erweiterten Atem zu analysieren, beenden Sie in der Datei "Offene Überprüfung" den Parseransichtsmodus, und klicken Sie auf Setup P3 Setup und Graph Setup, um Die Seitenansicht als Typ und fünf als Anzahl der Bereiche auszuwählen. Geben Sie minus zwei in die Box mit der Bezeichnung niedrig und zwei in die Box mit der Aufschrift hoch für die Durchflussmaße in Milliliter pro Sekunde ein, und wenden Sie die Änderungen an. Scrollen Sie dann zur 30-Minuten-Marke auf dem Flow-Tracing-Panel und zählen Sie die Apnoe und die erweiterten Atemzüge für den Zeitraum von 30 bis 60 Minuten manuell, nachdem die Maus in die Kammer gelegt wurde.

Für diese Analyse deuten Phasen der suspendierten Atmung, die länger als oder gleich 0,5 Sekunden dauern, auf eine Apnoe hin. Erweiterte Atemzüge werden durch einen starken Anstieg der Atemspur über 1,25 Milliliter pro Sekunde gefolgt von einem starken Rückgang unter minus 0,75 Milliliter pro Sekunde angezeigt. Diese repräsentative Strömungsverfolgung der leisen Atmung einer 22 Monate alten Maus ist typisch für ein Muster, bei dem die Atmung ohne aktives Atmungsverhalten konsistent ist.

Dieses Atemmuster stammt aus einem aktiveren Segment, in dem die Mäuse das Kammerschnüffeln und/oder pflegen donerten, und ist nicht ideal für die Art der Atemaufnahme, die für diese Methode verwendet wird. Der Parameter, der für die Beurteilung möglicher Muster von Atemunterschieden zwischen den beiden Zeitpunkten ausgewählt wurde, waren Atemfrequenz, Gezeitenvolumen, Minutenbelüftung, gezeitenvolumeninschaspiratorisches Zeitverhältnis und minutenbelüftung, das Kohlendioxid-Verhältnis ausgestoßen wurde. Weitere Analysen wurden mit jedem der vier 15-Sekunden-Basissegmente für Frequenz, Gezeitenvolumen, Minutenbelüftung, Gezeitenvolumen-Inspiratorisches Zeitverhältnis und Minutenbelüftung mit Kohlendioxid-Ausgestoßenem durchgeführt.

Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zeitpunkten und keine Unterschiede in der Variabilität zwischen einem der vier Zeitsegmente für ein Atmungsmuster gefunden. Die Quantifizierung der Anzahl der Apnoen und der erhöhten Atemzüge, die für jedes Tier in den Minuten 30 bis 60 des hemmungslosen Barometrischen Plethysmographieprotokolls beobachtet wurden, ergab, dass gealterte Tiere innerhalb von 30 Minuten eine hohe Anzahl von Apnoen und das Vorhandensein von Augmented Atemzügen zeigten. Forscher können auch Gas-Herausforderungen wie Hypoxie oder Hyperkapnie verwenden, um Veränderungen im Atemmuster zu dokumentieren, die sich aus einer Intervention oder Therapie ergeben.

Diese Technik bietet ein Mittel zur Charakterisierung von Atmungsmustern bei kleinen Nagetieren und genetisch veränderten Tierstämmen, die deutliche Verhaltensunterschiede aufweisen können.