Name: Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie der opsonophagozytische Tötungsassay Immunreaktionen gegen Streptococcus pneumoniae bewertet. Diese Methode dient als Goldstandard zur Messung der Antikörperwirksamkeit.

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Wir danken Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) für seine unschätzbare Hilfe bei der Gründung OPKA Tests in unserem Labor. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health Grant 1R01AI123383-01A1, FYA unterstützt.

(1) Kultur, Differenzierung und Validierung von HL-60 Zellen

<ol><li>HL-60 Zellkulturmedien bestehend aus 500 mL RPMI mit L-Glutamin und 50 mL Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum vorzubereiten. Fügen Sie keine Antibiotika, da dies die Differenzierung der HL-60 Zellen beeinflussen kann.</li>
	<li>Für die Vermehrung/Wartung von HL-60 Zellen entlüftet Kultur 5 x 106 Zellen in HL-60 Zellkulturmedien 75 cm2 10 mL Fläschchen bei 37 ° C und 5 % CO2. Die Passage Zellen alle 3−4 Tage, optimale Zelle Konzentrationen beizubehalten. Hinweis: Die Zellkonzentration sollte 5 x 106/mL nicht überschreiten.</li>
	<li>Generieren Sie arbeiten Bestände von HL-60 Zellen durch Aliquotierung ca. 1 x 106 Zellen/mL in HL60 Kulturmedien mit 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in 1 mL Kryo Röhrchen. Hinweis: Funktionierende Aktien können bei-80 ° c gelagert werden Der Meister Bestand sollte bei-120 ° c gelagert werden</li>
	<li>Differenzieren Sie HL-60 Zellen durch Kultivierung 1,5 x 107 Zellen in 15 mL HL-60 Zellkulturmedien mit 0,6 % N, N-Dimethylformamid (DMF) bei 37 ° C und 5 % CO2 in steriler Filter-capped 75 cm2 Flaschen für 3 Tage vor OPKA.</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob die HL-60-Zellen erfolgreich differenziert haben und eignen sich für den Einsatz in der OPKA-Test testen Lebensfähigkeit und Zelle Oberflächenmarker nach etablierten Flow Cytometry Protokolle16,17, 18,19. Ernten Sie nach Differenzierung HL-60 Zellen und Flecken Sie ca. 1 x 104 Zellen mit Gewebekulturen konjugierten Antikörpern/Flecken für CD71, CD35, annexin V und Propidium Jodid. Hinweis: Differenzierte Zellen sollte ≥65 % lebensfähig, ≥55 % CD35+, und ≤20 % CD71+ durch bestimmt gegründet Validierung Protokolle14 (Abbildung 1).</li>
</ol>
2. Vorbereitung des OPKA Puffer und Reagenzien

<ol><li>Bereiten Sie 50 mL sterile Opsonization Puffer B (OBB vor) durch Mischen 42,5 mL sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Ca2 +/Mg+ 2, 5 mL des Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum und 2,5 mL 0,1 % sterile Gelatine. Shop bei 4 ° C.</li>
	<li>Erhalten Sie Baby Kaninchen ergänzen und speichern bei-80 ° C.</li>
	<li>Zu erhalten Sie, oder bereiten Sie Bakterienkultur Platten (d. h. 15 x 100 mm2 5 % Schafe Blutagar Platten).</li>
</ol>
3. Vorbereitung der bakteriellen Lager Proben

<ol><li>Erhalten Sie einen Vorrat an der bakteriellen Angabe getestet werden. Hinweis: Für dieses Protokoll, Serotyp 3 Streptococcus Pneumoniae (WU2, großzügig zur Verfügung gestellt von Dr. Moon Nahm) verwendet wird.</li>
	<li>Wachsen Sie die bakterielle Belastung in einer entsprechenden Brühe (d. h. Todd Hewitt Brühe + 0,5 % Hefeextrakt für diese Sorte WU2) für ca. 2−4 h bei 37 ° C. Hinweis: Die Extinktion bei 600 nm (OD600) der Kultur sollte zwischen 0,6 und 0,8.</li>
	<li>Pellet-die Bakterien durch Zentrifugation bei 6.000 X g für 2 min und Aufschwemmen der Zellen in 10−30 mL 15 % Glycerin in der entsprechenden Brühe. Aliquoten die Bakterienkultur (500 µL pro aliquoten) in sterilen 1,5 mL Zentrifuge Tuben und Speicher bei-80 ° C.</li>
	<li>Eine Durchstechflasche bakterielle bestand in einem 37 ° C Wasserbad aufzutauen. Pellet-die Bakterienzellen und in 500 µL OBB unter sterilen Bedingungen aufzuwirbeln.</li>
	<li>Bereiten Sie verschiedene Verdünnungen der bakteriellen Aktien OBB (d. h. 10 µL keine Verdünnung, 10 µL 01:10, 10 µL 1: 100, etc.). Führen Sie OPKA Assay (Abschnitte 4 – 6, einschließlich HL-60/Ergänzung Kokultur), wie beschrieben unter Verwendung von verschiedenen Verdünnungen von der unbehandelten bakteriellen bestand. Kultur die Platten über Nacht bei 30 ° C (CO2). Hinweis: Die Temperatur von 30 ° C ist spezifisch für WU2 Überwucherung zu verhindern; andere Stämme/Serotypen kann optimal bei 37 ° c wachsen.</li>
	<li>Zählen der Kolonien für jede Verwässerung des unbehandelten bakteriellen Lager zusammen mit HL-60 Zellen und Ergänzung kultiviert. Bestimmen Sie, welche Verdünnung der Bakterien die optimale Anzahl von zählbaren Kolonien (etwa 80−120 KBE für unbehandelte Bakterien zusammen mit HL-60 Zellen kultiviert) ergibt. Beachten Sie diese Verdünnung für zukünftige OPKAs mit dieser bakteriellen bestand.</li>
</ol>
4. bakterielle Behandlung und Kultur

<ol><li>Tauen Sie eine Tube bakterielle Lager in Schritt 3.3 vorbereitet. Pellet-Bakterien (6.000 X g für 2 min) und Zelle Pellet in OBB bei optimalen Verdünnung gemäß Schritt 3.6 aufzuwirbeln.</li>
	<li>Pipette 10 µL resuspendierte bakterielle Verdünnung pro Bohrloch in einer Kultur Rundboden 96-Well Zellplatte.</li>
	<li>Geben Sie 20 µL des entsprechenden Antikörper oder medikamentöse Behandlung in jeder experimentellen in zweifacher Ausfertigung. Hinweis: In diesem Protokoll wird ein Serotyp-spezifische Antikörper in Mäusen erzeugt als Behandlung X und ein Glykosid Hydrolase Enzym bekannt zu die Serotyp 3 Polysaccharid-Kapsel zu erniedrigen ist als Therapie Y (Abbildung 2)4,20hinzugefügt. Verwenden Sie für Kontroll-Vertiefungen 1 x PBS oder OBB, abhängig von der Puffer für die Behandlung Brunnen verwendet.</li>
	<li>Schütteln Sie Probenteller mit ca. 90 u/min für 1 h bei Raumtemperatur. Passen Sie diese abhängig von der optimalen Temperatur oder schütteln Bedingungen der Behandlungen getestet.</li>
</ol>
5. HL-60 Co Bakterienkultur

<ol><li>Bereiten Sie HL-60 Zellen durch die HL-60 differenzierte Zellen, die mit DMF behandelt werden drei Tage vor (siehe Punkt 1.4) in 15 mL konische Röhrchen Ernte vor. Pellet-Zellen (500 X g, 3 min), den Überstand zu verwerfen und mit mindestens 10 mL 1 X PBS waschen.</li>
	<li>Pellet-die gewaschenen Zellen (500 X g, 3 min), den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in OBB (beginnen Sie mit 1 mL OBB und für eine Endkonzentration von 1 x 107/mL nach Zellzählung anpassen).</li>
	<li>Fügen Sie Baby-Kaninchen-Ergänzung (steril, unverdünnt Baby-Kaninchen-Serum, Alter 3−4 Wochen) zu einem Endvolumen von 1:5. Hinweis: Die Endkonzentration der HL-60-Ergänzung Mischung sollte 1 x 107/mL. Wenn Ergänzung Abhängigkeit zu testen, kann eine zweite Lösung mit aktiven HL-60-Zellen mit Hitze-inaktivierten Ergänzung verwendet werden (Ergänzung durch Inkubation in einem Wasserbad bei inaktiviert werden kann > 55 ° C für mindestens 30 min).</li>
	<li>Nach 1 h Bakterienkultur komplett (4.4) ist, teilen Sie jede Probe (d. h. 10 µL jeder 30 µL Probe in zwei neue Brunnen) in doppelte Brunnen für zwei Gruppen (z. B. Nutzung nur 20 µL der ursprünglichen 30 µL Kokultur Pipettieren Fehler ausmachen) : ein Satz wird Co kultiviert mit HL-60-Ergänzung und eine beinhaltet nur Bakterien. Fügen Sie 50 µL der HL-60-Ergänzung Mischung (aus Schritt 5.3) auf die einzelnen experimentellen Wells (Delegierte + HL-60); Fügen Sie 50 µL OBB allein in die Vertiefungen der Bakterien nur (Delegierte -HL-60). Hinweis: In diesem Beispiel werden ca. 800 bakterielle KBE für die anfängliche Kokultur mit 5 x 10550 µL HL-60 Zellen verwendet. Diese Multiplizität der Infektion zu hoch oder zu niedrig, wie letzte Kolonie Zahlen angegeben, passen Sie die bakterielle Anfangsverdünnung im Gegensatz zu den HL-60-Zellzahl.</li>
	<li>Schütteln Sie die 96-Well-Platte bei 37 ° C für 1 h (CO2).</li>
</ol>
6. Probieren Sie Beschichtung und Inkubation über Nacht

<ol><li>Verdünnen Sie jeweils gut 1:5 mit OBB, so dass jede Probe ein Volumen von mindestens 50 µL hat.</li>
	<li>Pipette 50 µL jeder Probe direkt auf einen bestimmten Bereich einer Bakterienkultur Platte, ausreichend Abstand zwischen den Proben zu gewährleisten. Für 15 x 100 mm Runde2 Agarplatten, Pipettieren ca. 4 Proben auf einer Platte.</li>
	<li>Decken und Proben für ca. 15 min bei Raumtemperatur trocknen lassen.</li>
	<li>Invertieren Sie Platten und Kultur über Nacht bei 30 ° C (CO2). Alternativ Kultur Platten in anaeroben Gläsern zu testen, ob anoxische Bedingungen das bakterielle Wachstum beeinflussen oder zu kontrollieren für Morphologie.</li>
	<li>Zählen Sie nach Übernachtung Kultur die Kolonien in jeder bestimmten Musterbereich. Analysieren von Daten durch den Vergleich der Anzahl von lebenden Zellen in jedem Satz an den entsprechenden Regler und/oder Proben, die nicht HL-60 Co Zellkultur erhalten (indikativ für 100 % Zelle überleben, 0 % Zelle Tötung).</li>
</ol>

<ol><li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

OPKAs dienen die entscheidende Rolle bei der Beurteilung der Antikörper-vermittelten Immunantwort induziert durch Impfungen6,8. Die Hauptbedeutung dieser vereinfachten OPKA ist die Anpassungsfähigkeit der Bedingungen getestet werden (d. h., Antikörper, Enzym-Behandlungen). In diesem Sinne während dieser Assay verwendet werden kann, um den Beitrag von Opsonins (z.B. Antikörper) in Phagozytose, testen sie auch lässt sich beurteilen, Wege zur Überwindung von Virulen...

Die Opsonophagocytic töten Assay (OPKA) ist ein wichtiges Werkzeug für spätere Änderungen der Immunantwort und Funktion Änderungen in bakteriellen Struktur oder Funktion verlinken. Als solche häufig dient es als eine ergänzende Assay immun-basierte Wirksamkeit von Antikörper-Therapien, Impfstoffkandidaten, Enzym-Optimierung zu bestimmen. In-vivo-Tests sind notwendig, um effektive Räumung oder Schutz in eine bakterielle Infektion-Modell zu bestimmen, kann die OPKA verwendet werden, um immun Beitrag zur bakteriellen Zelltod zu den grundlegende Komponenten bewerten: Bakterien, Immunzellen, und experimentelle Behandlungen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die OPKAs geändert und für eine Vielzahl von Bakterien und Serotypen, darunter Streptococcus Pneumoniae1, Staphylococcus Aureus2, Pseudomonas Aeruginosa3verwendet werden kann. Darüber hinaus können diese optimierten Assays verwendet werden, um verschiedene experimentelle Behandlungen, einschließlich der Möglichkeit eines Enzyms, das Bakterium zugänglicher zu ergänzen-vermittelten immunen Zellen4 und Antikörper-Behandlungen zur Verbesserung machen bewerten Opsonization5. Klassisch, OPKA Assay erfolgreich eingesetzt in der Grundlagenforschung und klinische Forschung Einstellungen als ein aussagekräftiger Indikator für Schutz induziert durch Erreger-spezifischen Antikörper6,7,8,9 .
Verschiedene Arten von Immunzellen können zur Beurteilung der Opsonophagocytic töten verwendet werden. Eine häufig verwendete phagocytic Bevölkerung ist der HL-60 menschlichen leukämischen Zell-Linie. Diese Zelllinie kann als inaktivierte Promyelocytes in Kultur gehalten werden; jedoch können sie in verschiedene aktivierte Zustände über verschiedene Drogen Behandlungen10,11unterschieden werden. Behandlung von HL60 mit N, N-Dimethylformamid unterscheidet die Zellinie in aktivierten Neutrophilen mit starken phagocytic Aktivität11. Während HL-60 Zellen optimiert wurden und werden häufig für die Phagozytose Assays10verwendet, können andere primäre polymorphkernigen Leukozyten als immun Arm der Experiment-12verwendet werden.
Darüber hinaus können diese Assays vereinfachte13 oder14 betrachten mehrere Antibiotika-resistente Bakterienstämme der zu prüfenden gemultiplext. Die Multiplex-Methode worden eher möglich durch die Entwicklung von Software erzielt, die effizient bakterielle Koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Spot auf einem Agar-Platte15zählen kann. Hier beschreiben wir eine optimierte Methode mit ein Bakterienstamm, HL-60-Zellen, Baby-Kaninchen-Ergänzung und Blutagar Platten. Mit dieser Methode können mehrere Behandlungen schnell beurteilt werden, um spezifische Forschung Fragen auf wie der angeborenen Immunantwort auf bakterielle Infektion moduliert werden kann.

<table><tbody><tr><td>Annexin V (APC-konjugiert)</td><td>BioLegend</td><td>640919</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD35, menschlich (PE-konjugiert)</td><td>BioLegend</td><td>333405</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD71, menschlich (PE-konjugiert)</td><td>BioLegend</td><td>334105</td><td></td></tr><tr><td>zu verwendender Bakterienstamm (z. B. Streptococcus pneumoniae, WU2)</td><td>Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blut-Agar-Platten</td><td>Hardy Diagnostic</td><td>A10</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Klon-Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G9012-1L</td><td></td></tr><tr><td>HL-60 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>IgG Isotyp-Kontrolle (PE-konjugiert)</td><td>BioLegend</td><td>400907</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamid (DMF)</td><td>Fisher Chemikalie</td><td>UN2265</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medien mit L-Glutamin</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

opsonophagocytic tötung assay immunreaktionen gegen bakterielle krankheitserreger zu bewerten

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Ein wesentlicher Aspekt der Immunantwort auf bakterielle Besiedlung des Gastgebers ist Phagozytose. Ein Opsonophagocytic-Tötung-Assay (OPKA) ist ein experimentelles Verfahren, in dem phagocytic Zellen mit bakteriellen Einheiten Co kultiviert sind. Die Immunzellen werden phagozytieren und töten die Bakterienkulturen in einer Ergänzung-abhängigen Weise. Die Effizienz der immun-vermittelte Zelle Tötung ist eine Reihe von Faktoren abhängig und kann verwendet werden, um festzustellen, wie die verschiedenen bakteriellen Kulturen zu vergleichen, in Bezug auf Widerstand zum Zelltod führt. Auf diese Weise kann die Wirksamkeit von potenziellen immun-basierten Therapeutika gegen bestimmte Bakterienstämme und/oder Serotypen beurteilt werden. In diesem Protokoll beschreiben wir eine vereinfachte OPKA, die grundlegende Kulturbedingungen und Zelle zählen, um bakterielle Zellviabilität nach Kokultur mit Behandlung und HL-60 Immunzellen bestimmen verwendet. Diese Methode wurde erfolgreich mit einer Reihe von verschiedenen Pneumokokken-Serotypen, Kapsel und Acapsular Stämme und andere Bakterienarten genutzt. Die Vorteile dieses OPKA-Protokolls sind seine Einfachheit, Vielseitigkeit, (da dieser Test auf Antikörper Behandlungen wie Opsonins nicht beschränkt), und Minimierung von Zeit und Reagenzien zu grundlegenden experimentelle Gruppen zu beurteilen.

Validierung von HL-60 Differenzierung sollte vor Beginn der OPKA durchgeführt werden. Dies kann erreicht werden mit Durchflusszytometrie um zu bestimmen, die extrazellulären Ausdruck von CD11b, CD35, CD71 und annexin V (Abbildung 1). Propidium Jodid kann auch als Lebensfähigkeit Marker verwendet werden. Nach der Behandlung mit DMF für 3 Tage, Ausdruck der CD35 erhöht werden sollte (≥55 % aller Zellen) und Ausdruck der CD71 verringert werden sollte (≤20 % aller Zellen). Der Prozentsatz von an...

Dieser Opsonophagocytic Tötung Assay wird verwendet, um die Fähigkeit der phagocytic Immunzellen zur Beantwortung und töten Bakterien basierend auf verschiedene Behandlungen und/oder Bedingungen zu vergleichen. Klassisch, dient dieser Assay als der Goldstandard für die Beurteilung der Effektor-Funktionen von Antikörpern gegen ein Bakterium als Opsonin erhoben.

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Dieser Test verbindet die Modulation der bakteriellen Struktur und Funktion mit immunzellbasierter antibakterieller Aktivität. Als solche kann ein wichtiges Immuntherapeutika einer potenziellen Behandlung bei der Bestimmung der Wahrscheinlichkeit einer verbesserten bakterielleclearance beurteilt werden. Opsonophagozytäre Tötungassay dient traditionell als Goldstandard für die Bewertung effektiver Funktionen von Antikörpern, die gegen das Bakterium als obsonant erhoben werden.Dieses Protokoll bietet Einfachheit und Vielseitigkeit gegenüber bestehenden standardisierten Assays mit hohem Durchsatz. In diesem Protokoll untersuchen wir die Auswirkungen einer medikamentösen Behandlung auf Streptokokken-Pneumonie und wie diese Effekte zu einer verbesserten Phagozytose des Bakteriums führen. Hier wenden wir das OPKA auf Streptokokken-Lungenentzündungszellen an.Dieses Protokoll kann jedoch angenommen werden, um die phagozytische Tötung anderer Krankheitserreger durch Immunzellen zu bewerten. Widmen Sie sich Zeit, um die Bakterienbestände zu optimieren und sicherzustellen, dass die zu zählenden endgültigen KBE in den optimalen Bereich fallen. Wir empfehlen dringend, die Durchflusszytometrie zu verwenden, um sicherzustellen, dass HL60-Zellen lebensfähig und aktiv sind und verschiedene Kulturbedingungen ausprobieren, um funktionell aktive Zellen zu gewährleisten.Die visuelle Demonstration wird ein besseres Verständnis dafür vermitteln, wie die Probe plattiert werden sollte und wie zählbare Proben erreicht werden können. Zu Beginn bereiten SIE HL60 Zellkultur-Medien bestehend aus 500 Milliliter RPMI ergänzt mit L-Glutamin und 15 Milliliter Hitze inaktiviert fetale Rinderserum. Zur Vermehrung und Wartung von HL60-Zellen, Kultur fünf Millionen Zellen in 10 Milliliter HL60 Zellkultur Medien in 75 Quadratzentimeter entlüfteten Kolben bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid.Um Arbeitsbestände an HL60-Zellen zu erzeugen, fügen Sie etwa eine Million Zellen pro Milliliter in HL60-Kulturmedien, ergänzt mit 10%dimethylsulfoxid, in einen Milliliter kryogenen Röhren ein. Zur Unterscheidung von HL60-Zellen, Kultur 1,5 mal 10 zu den sieben Zellen in 15 Milliliter n.HL60 Zellkultur Medien ergänzt mit 0,6%DMF in sterilen Filter gekappt 75 Quadratzentimeter Kolben bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für drei Tage vor OPKA. Zur Vorbereitung der bakteriellen Bestandsproben den WU2-Bakterienstamm in einer geeigneten Brühe etwa zwei bis vier Stunden bei 37 Grad Celsius anbauen.Als nächstes pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei sechstausend Mal G für zwei Minuten und suspendieren die Zellen in 10 bis 30 Milliliter 15%Glycerin in der entsprechenden Brühe. Aliquot die Bakterienkultur in sterile 1,5 Milliliter Zentrifugenrohre und lagern bei 80 Grad Celsius. Als nächstes tauen Sie eine Durchstechflasche mit Bakterienvorräten in einem 37 Grad Celsius Wasserbad auf.Pellet die Bakterienzellen und resuspendieren in 500 Mikroliter OBB unter sterilen Bedingungen. Plattenverdünnungen des unbehandelten Bakterienbestandes auf Blutagarplatten und Kultur der Platten über Nacht bei 30 Grad Celsius. Zählen Sie nach dem Inkubationsschritt die Kolonien für jede Verdünnung unbehandelter Bakterienbestände, die mit HL60-Zellen kokultiviert werden.Zeichnen Sie auf, welche Verdünnung von Bakterien die optimale Anzahl zählbarer Kolonien für zukünftige OPKAs mit diesem Bakterienbestand ergibt. Eine Röhre mit Bakterienbestand auftauen. Pelletbakterien bei sechstausend Mal G für zwei Minuten und resuspendieren das Zellpellet in OBB bei der optimalen Verdünnung im vorherigen Schritt erhalten.Pipette 10 Mikroliter der resuspendierten bakteriellen Verdünnung pro Brunnen in einer runden unteren 96 Brunnenzellkulturplatte. Fügen Sie dann 20 Mikroliter eines geeigneten Antikörpers oder einer medikamentösen Behandlung zu jedem experimentellen Brunnen in doppelter Weise hinzu. Für Steuerbrunnen verwenden Sie 1XPBS oder OBB, abhängig von dem Puffer, der für die Behandlungsbrunnen verwendet wird.Schütteln Sie die Probenplatte bei ca. 90 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur für eine Stunde. Um die HL60 differenzierten Zellen zu ernten, die drei Tage zuvor mit DMF behandelt werden, pellet die Zellen drei Minuten lang bei 500 mal G. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit mindestens 10 Millilitern 1XPBS.Pellet die gewaschenen Zellen bei 500 mal G für drei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in OBB erneut aus. Fügen Sie steriles unverdünntes Babykaninchenserum in einem ein bis fünf Endvolumen hinzu.Nach einer Stunde Bakterienkultur, teilen Sie jede Probe in doppelte Brunnen für zwei Gruppen. Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter der HL60-Ergänzungsmischung zu jedem experimentellen Satz von Brunnen und 50 Mikroliter OBB nur zu den Brunnen von Bakterien hinzu. Schütteln Sie die 96-Well-Platte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.Um Plattenproben, verdünnen Sie jeden Brunnen mit OBB in einem bis fünf Endvolumen, so dass jede Probe ein Volumen von mindestens 50 Mikroliter hat. Als nächstes Pipette 50 Mikroliter jeder Probe direkt auf einen bestimmten Bereich einer bakteriellen Kulturplatte, um einen angemessenen Abstand zwischen den Proben zu gewährleisten. Bedecken und Proben ca. 15 Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen.Umkehren Sie die Teller und Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius. Alternativ können Kulturplatten in anaeroben Gläsern testen, ob anoxische Bedingungen das Bakterienwachstum beeinflussen oder um die Morphologie zu kontrollieren. Zählen Sie nach der Nachtkultur die Kolonien in jedem ausgewiesenen Stichprobenbereich, und analysieren Sie die Daten, indem Sie die Anzahl der lebenden Zellen in jedem Satz mit den entsprechenden Steuerelementen vergleichen.Die schwierigsten Aspekte bei der Ersteinführung dieser Technik werden wahrscheinlich die Optimierung der Ausgangs-KGE des Bakterienbestands sein und sicherstellen, dass die HL60-Zellen effektiv differenziert werden. Vor dem Start des OPKA wurde die HL60-Differenzierung mittels Durchflusszytometrie mit Propidiumjodid als Lebensfähigkeitsmarker validiert. Nach der Behandlung mit DMF für drei Tage wurde die Expression von CD35 erhöht und die Expression von CD71 verringert.Die durchschnittlichen Prozentsätze der bakteriellen KBE in den HL60 behandelten Gruppen im Vergleich zu den entsprechenden nicht-HL60 behandelten Gruppen wurden verwendet, um das Überleben der bakteriellen Zell verschiedener Behandlungen zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass bei einer wirksamen Behandlung die Anzahl der Kolonien zwischen DER HL60-Kokultur und den wenigen HL60-Zellen unterschiedlich war, was auf eine effizientere Phagozytose hindeutet. Die Ergebnisse zeigten, dass, wenn die bakterielle Verdünnung nicht optimiert wurde oder das Koloniewachstum nach der Beschichtung nicht sorgfältig beobachtet wurde, das Überwuchern der Kolonien eine genaue Zählung der Kolonien verhindern konnte.Das Wichtigste, was sie beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollten, ist, die bakterielle Inkubation sorgfältig zu überwachen, um ein Überwuchern der KBE zu vermeiden. In-vivo-Assays können verwendet werden, um eine effektive bakterielle Clearance innerhalb eines Wirts zu beschüben. Diese Assays können verwendet werden, um die mit dem OPKA beobachtete Immunwirksamkeit zu bestätigen, die auf menschliche oder tierische Modelle übertragbar sind.Der opsonophagozytäre Tötungstest wurde in früheren bedeutenden Studien mit großer Wirkung verwendet, um antibakterielle Therapien mit phagostischen Immunantworten zu verknüpfen. Die Arbeit mit bakteriellen Krankheitserregern kann gefährlich sein. Bitte tragen Sie während dieses Testes jederzeit eine persönliche Schutzausrüstung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir präsentieren Ihnen eine High-Throughput-durchflusszytometrischen Assays auf die Phagozytoseaktivität von Antigen-spezifischen Antikörpern aus klinischen Proben zu bestimmen, unter Verwendung fluoreszierender Antigen-beschichteten Beads und einer monozytären Zelllinie mehrere Fc-Rezeptoren zur Bereitstellung von Rezeptor-Nutzung und Phagozytoseaktivität Bestimmungen in einer standardisierten und reproduzierbare Weise für jedes Antigen von Interesse.

Die Bestimmung der Phagozytoseaktivität of Clinical Antikörper Proben

Quelle: Nagre, N., et al. Phagozytose und Bakterienbeseitigung der Alveolaren Makrophagen bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video zeigt die Bewertung der komplementrezeptorvermittelten Phagozytose mit roten Blutkörperchen von Schafen, die mit IgM und Komplement opsonisiert sind, gefolgt von deren Aufnahme durch Mausmakrophagen. Das Ausmaß der Phagozytose wird quantifiziert, indem ein blaues chromogenes Produkt gemessen wird, das durch hämoglobinkatalysierte Oxidation von Diaminofluoren...

Modellierung komplement-vermittelter Phagozytose unter Verwendung von opsonisierten roten Blutkörperchen in vitro

Quelle: Seman, B. G., et.al. Neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert die Isolierung von Neutrophilen und entzündlichen Monozyten aus neonatalen Mausmilzen und deren Anwendung in einem leuchtenden bakteriellen Tötungsassay. Es behandelt mechanische Dissoziation, rote Blutkörperchenlyse, magnetische perlenbasierte Zellanreicherung, bakterielle Inkubation und Antibiotikaschutz. Zeitgesteuerte Lumineszenzmessungen zeigen eine...

In-vitro-Untersuchung der bakteriellen Tötung durch neonatale Maus-Milzphagozyten

Dieses Video zeigt eine Technik zur Bewertung der komplementvermittelten bakteriziden Aktivität von Antikörpern, die im Serum vorhanden sind. Dieser Ansatz kombiniert isoliertes Serum mit pathogenen Bakterien und exogenen Komplementproteinen. Nach der Inkubation werden die Bakterien auf einer Agarplatte gezüchtet und die produzierten Kolonien quantifiziert, um den bakteriziden Serumtiter zu messen.

Ein bakterizider Serumassay für die komplementvermittelte bakterizide Aktivität von Antikörpern

In diesem Video demonstrieren wir einen Assay zum Nachweis der Zytotoxizität von virulenten und weniger virulenten Staphylococcus aureus-Stämmen gegen humane Neutrophile nach Phagozytose mittels Durchflusszytometrie.

Zytotoxizitätstest von Staphylococcus aureus-Stämmen an Neutrophilen nach Phagozytose

Das Video zeigt einen in vitro opsonophagozytären Tötungsassay unter Verwendung einer Co-Kultur von humanen Neutrophilen mit Streptococcus pneumoniae. Antikörper und Komplementproteine erleichtern die Opsonisierung der Bakterien, so dass Neutrophile Bakterien erkennen und abtöten können, was eine erfolgreiche opsonophagozytäre Aktivität von Neutrophilen zeigt.

Bewertung der opsonophagozytären Abtötungsaktivität gegen bakterielle Krankheitserreger

Dieses Video zeigt einen Opsono-Adhärenz-Assay zur Untersuchung der Interaktion zwischen opsonisierten Bakterien und Immunzellen. Fluoreszenzmarkierte Bakterien, die mit Testserum behandelt werden, das Anti-Kapsel-Antikörper enthält, werden mit Makrophagen inkubiert. Nach der Färbung der Makrophagen mit Fluoreszenz werden die auf der Makrophagenoberfläche anhaftenden Bakterien zur Visualisierung unter einem Mikroskop betrachtet.

Ein Opsono-Adhärenz-Assay zur Beurteilung der Opsonisierung von verkapselten Bakterien durch Anti-Kapsel-Antikörper

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Virulenz von planktonischen oder Oberfläche befestigt Bakterien mit D. Discoideum (Amöben) als Host zu messen. Virulenz wird gemessen über einen Zeitraum von 1 h und Host töten wird quantifiziert mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildanalyse. Wir zeigen dieses Protokoll mit dem Bakterium p. Aeruginosa.

Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

Hier präsentieren wir eine elegante Protokoll für in Vivo Evaluierung der Impfstoff Wirksamkeit und Host Immunantworten. Dieses Protokoll kann für Impfstoff-Modelle, die studieren, virale, bakterielle oder parasitäre Erreger angepasst werden.

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Messung der Shigellacidal Aktivität der Antikörper im Serum. Serum mit Bakterien und exogene Ergänzung, inkubiert, vermischt und das Reaktionsgemisch auf Agarplatten überzogen ist. Lebensfähige Bakterien bilden Kolonien, die gezählt werden, einen automatisierten Kolonie Enumerator verwenden und die bakterizide Titer bestimmt.

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Der Opsono-Adhärenz-Assay ist eine alternative Methode zum opsono-phagozytischen Tötungstest zur Bewertung der Opsonic-Funktionen von Antikörpern in der Impfstoffentwicklung.

Opsono-Adherence Assay zur Bewertung funktioneller Antikörper in der Impfstoffentwicklung gegen Bacillus anthracis und andere verkapselte Pathogene

Erfahren Sie, wie der opsonophagozytische Tötungsassay Immunreaktionen gegen Streptococcus pneumoniae bewertet. Diese Methode dient als Goldstandard zur Messung der Antikörperwirksamkeit.

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

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