Eine enzymfreie Methode zur Isolierung und Expansion von humanen Adsetzen-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen
16. Dezember 2019
Dieses Protokoll bietet eine enzymfreie Methode zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus abdominoplastischen und lipoaspiratischen Proben mit einer Explant-Methode. Das Fehlen harter Enzyme oder Zentrifugationsschritte sieht klinisch relevante Stammzellen vor, die für Studien in vitro verwendet oder in die Klinik zurückgebracht werden können.
Dieses Protokoll bietet eine einfache kostengünstige Möglichkeit, ASCs ohne den Einsatz von harten Enzymen oder Zentrifugationsschritten zu isolieren, die den Zellphänotyp und das Verhalten verändern können. Das Fehlen harter Schritte führt zu weniger manipulierten Zellen als solche, die mit Enzymen und Zentrifugation isoliert sind, wodurch die Frage minimiert wird, ob experimentelle Beobachtungen ein Artefakt der Isolationsmethode sind. Diese Explant-Methode kann klinisch relevante ASCs erzeugen, die in einen Patienten eingeführt werden, um eine Vielzahl von Krankheiten zu behandeln oder im Leben zu erweitern, die Forschungsanwendungen ermöglichen.
Es ist schwierig, die Hackmethode in Worten vollständig zu erklären. Die visuelle Demonstration kann anderen Wissenschaftlern die Schwierigkeiten des Lernens dienen, das Gewebe selbst auseinander zu brechen. Ähnliche Explantationsmethoden können verwendet werden, um andere Populationen von MSCs zu isolieren, z. B. solche aus Nabelgeweben.
Um die Abdominoplastik-Gewebeproben zu zerkleinern, übertragen Sie zuerst das Gewebe auf den Deckel einer sterilen 100-Millimeter-Platte. Verwenden Sie dann eine sterile Nadel, um ein Stück Gewebe an Ort und Stelle zu halten und verwenden Sie ein steriles Skalpell, um das Gewebe in weniger als einen Millimeter Stücke zu schneiden. Übertragen Sie das Gewebe in ein frisches Rohr und invertieren oder schütteln Sie die Probe fünf- bis sechsmal, um das Mischen aller Schichten zu gewährleisten.
Dann, mit einem sterilen Spachtel, übertragen 2,5 bis fünf Milliliter Gewebe auf eine 100 Millimeter Vakuumgas Plasma behandelt Gewebe Kulturplatte. Messen Sie das Volumen der Probe, indem Sie in ein frisches Zentrifugenrohr gießen. Als nächstes fügen Sie ein gleichwertiges Volumen von Gewebekulturmedien auf die Platte und wirbeln Sie die Platte sanft, um den Inhalt zu mischen.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent Kohlendioxid, bis eine ausreichende Anzahl von Zellen auf der Basis der Platte zu sehen sind. Sobald eine ausreichende Anzahl von Zellen auf der Platte oder nach sieben Tagen notiert sind, je nachdem, was früher ist, entfernen Sie alle verbleibenden Stücke des Gewebes. Als nächstes kulturieren Sie die ASCs in Gewebekulturmedien, bis sie 70% Konfluenz erreichen oder bis die Cluster dicht werden, an welchem Punkt die Zellen durchgehen sollen.
Spülen Sie die Platte vorsichtig mit 1X Phosphat gepufferte Kochsaline. Um die anhaftenden Zellen zu versuchen, die phosphatgepufferte Kochchen zu aspirieren, fügen Sie einen Milliliter Trypsin, ergänzt mit 0,25%EDTA, zu jeder Platte hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Fügen Sie eine kleine Menge Medien auf die Platte, um das Trypsin zu deaktivieren.
Dann pipette sanft das Medium Trypsin von der Oberseite der Platte nach unten, verlusterung alle schwach befestigten Zellen von der Platte. Um die Zellen auszusäen, fügen Sie zuerst Medien zur Platte hinzu. Fügen Sie dann die Zellen tropfenweise hinzu und wirbeln Sie dann die Platte, um eine gleichmäßige Verteilung über die Platte zu gewährleisten.
Nach drei Passagen, gehen Sie zytometrie und Differenzierung Assays zu fließen. Nach drei Passagen wurden isolierte ASCs aus Lipoaspirat- und Abdominoplastikproben gefunden, die eine MSC-Morphologie und einen Phänotyp aufweisen, ähnlich wie isolierte ASCs nach einer enzymatischen Verdauung. Wie andere MSCs sind die explantisolierten ASCs negativ für CD45 und positiv für CD73, CD90 und CD105.
Beim Hacken des Gewebes muss die Oberfläche jedes Stückes ausreichend groß sein, damit die ASCs aus dem Gewebe wandern können. Dabei handelt es sich um grundlegende Stammzellen, die für ein breites Anwendungsspektrum eingesetzt werden können. Die isolierten ASCs können für jede nachgeschaltete Anwendung in vivo oder in vitro verwendet werden.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine enzymfreie Methode zur Isolierung von aus Fettgewebe stammenden Stammzellen (ASCs) aus Abdominoplastie- und Lipoaspiratproben mithilfe einer Explantentechnik. Dieser Ansatz minimiert die Zellmanipulation und gewährleistet klinisch relevante Stammzellen, die für verschiedene Anwendungen geeignet sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Stammzellbiologie
- Regenerative Medizin
- Zellisolationsmethoden
Hintergrund
- Traditionelle Methoden zur Isolierung von ASCs beinhalten häufig harsche Enzyme und Zentrifugation.
- Diese Methoden können das Zellphänotyp und das Zellverhalten verändern.
- Die Explantenmethode bietet eine schonendere Alternative.
- Visuelle Demonstrationen können beim Verständnis des Gewebeminzprozesses helfen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer kosteneffektiven und einfachen Methode zur Isolierung von ASCs.
- Reduzierung des Risikos von Artefakten in experimentellen Beobachtungen, die durch aggressive Isolationsverfahren verursacht werden.
- Erzeugung klinisch relevanter ASCs für therapeutische Anwendungen.
Verwendete Methoden
- Das zerkleinerte Gewebe aus einer Bauchdeckenstraffung wird in einer Zellkulturschale kultiviert.
- Die Zellen werden bei 37 °C in einer CO2-Atmosphäre inkubiert.
- Nach ausreichendem Zellwachstum werden die verbliebenen Gewebestücke entfernt.
- Die Zellen werden weitergeimpft und auf Stammzellmarker charakterisiert.
Hauptergebnisse
- Isolierte ASCs weisen eine Morphologie und ein Phänotyp auf, die denen ähneln, die mittels enzymatischer Verdauung erhalten wurden.
- Explanten-isolierte ASCs sind negativ für CD45 und positiv für CD73, CD90 und CD105.
- Die Methode liefert weniger manipulierte Zellen, wodurch die experimentelle Zuverlässigkeit erhöht wird.
- ASCs können für verschiedene nachgeschaltete Anwendungen sowohl in vivo als auch in vitro verwendet werden.
Schlussfolgerungen
- Die Explantenmethode ist eine geeignete Alternative zur Isolierung von ASCs.
- Diese Technik erhält die Zelleigenschaften besser als herkömmliche Methoden.
- Isolierte ASCs weisen ein breites Potenzial für Forschungs- und klinische Anwendungen auf.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese enzymfreie Isolationsmethode löst eine zentrale Herausforderung in der regenerativen Medizin: die Gewinnung klinisch relevanter mesenchymaler Stammzellen, ohne Artefakte durch aggressive enzymatische oder mechanische Verfahren einzuführen. Durch die Erhaltung des nativen Zellphänotyps und der Zellfunktion verbessert der Ansatz die Vorhersagegenauigkeit für nachgeschaltete Anwendungen wie Krankheitsmodellierung und therapeutisches Screening. Die Methode unterstützt frühe Entdeckungsworkflows, bei denen die biologische Risikominderung und die Zielvalidierung von zuverlässigen, möglichst wenig manipulierten Zellquellen abhängen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen unter Verwendung von fettgewebsstämmigen Stammzellen mit erhaltener Multipotenz und Oberflächenmarkern.
- Operativer Wert: Verringert die Variabilität experimenteller Ergebnisse, indem enzyminduzierte phänotypische Veränderungen ausgeschlossen werden.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch die Generierung weniger manipulierter Zellen für Target-Validierungsassays.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt aus Fettgewebe stammende Stammzellen, die für standardisierte In-vitro-Assays geeignet sind und konsistente mesenchymale Phänotypen aufweisen.
- Operativer Wert: Erleichtert die Assay-Bereitschaft durch eine aus Explanten basierende Expansion, die die Positivität für CD73, CD90 und CD105 erhält.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die reproduzierbare Zellproduktion für Wirkstoff-Screenings und mechanistische Studien.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Stellt eine klinisch relevante Zellquelle bereit, die auf Anwendungen der regenerativen Medizin ausgerichtet ist.
- Präklinisches Modell: Ermöglicht die Gewinnung von fettgewebsabstammenden Stammzellen für krankheitsrelevante Systeme ohne Exposition gegenüber xenogenen Enzymen.
- Mechanistische Risikominimierung: Verringert Bedenken hinsichtlich Isolationsartefakten, die Differenzierungs- oder immunmodulatorische Funktionsanalysen beeinflussen könnten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der frühen Stammzellisolierung bis zur präklinischen Validierung ein und unterstützt Arbeitsabläufe, bei denen die Integrität der Zellquelle die Datenzuverlässigkeit sowie Go/No-Go-Entscheidungen beeinflusst.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem fettgewebeabstammende Stammzellen mit nativemähnlicher Morphologie und Phänotyp bereitgestellt werden.
- Screening: Stellt standardisierte, expansionsfähige Zellen für Testplattformen bereit, die Eigenschaften mesenchymaler stromaler Zellen erfordern.
- Analytik: Ermöglicht Durchflusszytometrie und Differenzierungsassays nach drei Passagen zur Bestätigung der Stammzellidentität.
- Translationale Forschung: Verbindet die Isolierung mit therapeutischem Potenzial durch Erhaltung klinisch relevanter Zelleigenschaften.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare, enzymfreie Plattform zur Herstellung fettgewebeabstammender Stammzellen über verschiedene Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagegenauigkeit, indem isolationsbedingte Artefakte in Stammzellenexperimenten minimiert werden.
- Operativer Wert: Bietet ein kostengünstiges, einfaches Protokoll, das nicht auf teure Enzyme oder Zentrifugation angewiesen ist.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch höhere Zuverlässigkeit der Ergebnisse zellbasierter Assays.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem zuverlässige mesenchymale Stammzellen für die präklinische Bewertung bereitgestellt werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert aseptische Techniken und grundlegende Zellkulturausrüstung für das mechanische Zerhacken und die Gewebekultur aus Explantaten.
- Beruht auf sterilen Instrumenten wie Skalpellen, Nadeln und Spateln zur Gewebepräparation.
- Benötigt standardisierte Inkubationsbedingungen bei 37 °C mit 5 % CO2 für ein optimales Zellauswachsen.
- Beinhaltet manuelle Passagierung basierend auf Konfluenz oder Clusterdichte nach der initialen Gewebeentfernung.
- Setzt auf Durchflusszytometrie und Differenzierungsassays zur phänotypischen Bestätigung nach der Isolierung.
