Name: Standard-Betriebsverfahren für Lyssavirus-Überwachung der Fledermauspopulation in Taiwan (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Erfahren Sie das Standardverfahren zur Lyssavirus-Überwachung in Fledermauspopulationen in Taiwan. Diese Methode ermöglicht Forschern die Identifizierung von vier verschiedenen Lyssaviren und trägt zum Verständnis zoonotischer Krankheitsdynamiken bei.

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Wir danken Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai und Ya-Lan Li für ihre Unterstützung während dieser Studie. Diese Studie wurde durch das Stipendium Nr. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) des Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture, Executive Yuan, Taiwan, unterstützt.

1. Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit Lyssaviren
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass alle Laborarbeiter, die mit Fledermausproben umgehen, eine Tollwutprophylaxe vor der Exposition erhalten17. Überwachen Sie die Tollwut-Antikörper-Spiegel der Arbeiter im Voraus und überprüfen Sie sie alle 6 Monate17. Für diejenigen, deren Antikörperspiegel unter 0,5 I.E./ml17liegen, ist eine Tollwut-Nachsorge erforderlich.</li>
	<li>Je nach den Biosicherheitsvorschriften des Landes, in dem sich das Labor befindet, stellen Sie sicher, dass die folgenden Verfahren in geeigneten Laboratorien auf Biosicherheitsebene (z. B. BSL-2-Laboratorien in Taiwan und BSL-3-Laboratorien in Australien) durchgeführt werden und dass Arbeitnehmer sind derzeit qualifiziert und tragen die richtige persönliche Schutzausrüstung18. HINWEIS: Die Tollwutimpfung bietet wenig bis gar keinen Schutz vor Lyssaviren der Phylogruppen II und III18. Die Arbeitnehmer müssen darüber informiert werden, dass mehrere zoonotische Krankheitserreger bei Fledermäusen19 identifiziert wurden und Proben unter geeigneten Laborbedingungen auf Biosicherheitsniveau mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung behandeln sollten.</li>
</ol>2. Probensammlung
<ol><li>Verwenden Sie gefunden schwache oder kranke Fledermäuse oder Kadaver. HINWEIS: Schwache oder kranke Fledermäuse werden zur tierärztlichen Versorgung oder Forschung an die Bat Conservation Society of Taipei geliefert, während Kadaver direkt an das Animal Health Research Institute übergeben werden. Keine gesunden Fledermäuse wurden in diesem Überwachungsprogramm eingeschläfert.</li>
	<li>Lassen Sie einen Fledermausökologen Fledermausarten durch morphologische Eigenschaften identifizieren20.</li>
	<li>Führen Sie DNA-Barcoding der Fledermaus-Arten, wenn Lyssavirus positiv diagnostiziert wird, mit zuvor veröffentlichten Verfahren21.</li>
	<li>Senden Sie ein Informationsblatt zu jedem Fledermauskadaver (Sammelstelle, Arten, klinische Zeichen usw.).</li>
</ol>3. Nekropsie von Fledermausproben
<ol><li>Bereiten Sie Materialien vor.<ol>
<li>Bereiten Sie eine saubere Sezierplatte vor und legen Sie ein steriles absorbierendes Pad für Nekropsie.</li>
		<li>Bereiten Sie Sammelrohre für das Sammeln von Fledermausorganen vor.</li>
		<li>Bereiten Sie Einweg-Pinzette und Skalpelle für Nekropsie. Ändern Sie die Werkzeuge zwischen der Nekropsie jeder Fledermaus. Bereiten Sie Baumwollkugeln mit 70% Ethanol befeuchtet für die Reinigung von Pinzetten und Skalpellen während der Probenahme.</li>
		<li>Bereiten Sie zwei Mikroskopdias für die FAT vor. Sammeln Sie frische Proben und fixieren Sie sie in formalin Lösung für histopathologische Untersuchungen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Untersuchen Sie alle externen Öffnungen vor der Nekropsie. Fotografieren Sie die äußeren Merkmale der Fledermaus, insbesondere den Kopf, die Ohren und die Flügel, für die Artendifferenzierung.</li>
	<li>Sammeln Sie eine orale Tupferprobe. Legen Sie die Fledermaus in ventrale Recumbency auf dem Brett und fixieren Sie den Kopf der Fledermaus mit einer Pinzette. Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie der Calvaria mit einem Skalpell und ziehen Sie die Haut zu den Seiten. Schneiden Sie den Schädel entlang der Mittellinie der Calvaria mit einem Skalpell und öffnen Sie ihn mit einer Pinzette, um das Gehirngewebe freizulegen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Hirngewebe aus dem Schädel und legen Sie es auf einen sterilen Zungendrucker und machen Sie Abstriche aus dem Hirngewebe (siehe Schritt 4.2). Sammeln Sie ein kleines Stück frisches Hirngewebe und fixieren Sie es in Formalin für histopathologische Untersuchungen. Enthalten Sie das restliche Hirngewebe in einer Röhre für die Nukleinsäureextraktion.</li>
	<li>Saubere Pinzette und Skalpell mit Wattebällchen mit 70% Ethanol befeuchtet, um zurückgehaltene Gewebe zwischen der Probensammlung zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie die Fledermaus auf das Brett in dorsale Recumbency und fixieren Sie es auf dem Brett mit Nadeln an beiden Seiten der Axilla und Schwanz Ferse.</li>
	<li>Incise die Haut entlang der Mittellinie des Körpers von Unterkiefer zu Anus. Heben und trennen Sie die Haut und das darunter liegende Muskelgewebe mit einer Pinzette. Sammeln Sie die Speicheldrüsen, die in der Nähe des Unterkieferknochens sind.</li>
	<li>Heben Sie das Brustbein leicht mit einer Pinzette an und schneiden Sie das Brustbein und die Bauchwand entlang der Mittellinie mit einem Skalpell. Die Clavikeln mit einem Skalpell schneiden. Befestigen Sie die linken und rechten Rippenkäfige mit Nadeln am Brett, um die Brusthöhle zu öffnen.</li>
	<li>Erfassen Sie die Bruttoläsionen und den Grad der post-mortem Veränderung.</li>
	<li>Entfernen Sie das viszerale Gewebe (d. h. Herz, Lunge, Leber, Nieren, Darm) mit einer Pinzette und einem Skalpell aus dem Kadaver. Sammeln Sie die viszeralen Proben nach Bedarf für zukünftige Forschung. HINWEIS: Es wird empfohlen, doppelte Proben zu sammeln. Eines sollte für die molekulare Diagnose gesammelt werden, das andere sollte bei -80 °C mit oder ohne virales Transportmedium für die Viruskultur eingefroren werden22.</li>
</ol>4. Direkter fluoreszierender Antikörpertest (FAT)
<ol><li>Machen Sie Eindruck Abstriche des Gehirngewebes für die FAT. Führen Sie die FAT wie zuvor beschrieben18,23 mit den folgenden Änderungen aus.</li>
	<li>Trennen Sie das Hirngewebe vorsichtig mit einer Pinzette vom verbundenen Nervengewebe und übertragen Sie das Hirngewebe in einen sterilen Zungendepressivum. Schneiden Sie den Querschnitt des Gehirns, einschließlich des Hirnstamms und Kleinhirn18,23. Machen Sie Eindruck Abstriche des Gehirngewebes durch leichtes Berühren der geschnittenen Oberfläche des Gehirngewebes, und drücken Sie das Dia auf Linsengewebe, um überschüssiges Gewebe zu entfernen.</li>
	<li>Befestigen Sie die Dias mit Aceton bei -20 °C für 30 min. Trocknen Sie die getesteten Dias und die positiven und negativen Kontrollen vor der Färbung mit Konjugat.</li>
	<li>Die Verwendung von jedem der beiden handelsüblichen FITC-konjugierten Antitollwut-Antikörper zur Färbung von Lyssavirus-Antigen wird sehr empfohlen23. Bestimmen Sie die Arbeitskonzentration des handelsüblichen Konjugats vor der ersten Färbung. Die verdünnten Konjugate durch einen Spritzenfilter von 0,45 m auf die Dias fallen lassen und die Dias 30 min in einer Nasskammer bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Das überschüssige Konjugat von den Dias abtropfen lassen und die Dias nach der Inkubation mit phosphatgepufferter Kochchen (PBS) waschen.</li>
	<li>Lassen Sie eine kleine Menge von 10% Glycerin auf die Dias und Abdeckung mit Abdeckung Folien.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Dias mit einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
</ol>5. Nukleinsäureextraktion
<ol><li>Fügen Sie das richtige Volumen von MEM-10 (mindestens wesentliches Medium, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum) zum Hirngewebe hinzu (10% w/v).</li>
	<li>Homogenisieren Sie das Hirngewebe mit einer 5 mm Stahlperle in einem Homogenisator und Zentrifuge bei 825 x g für 10 min.</li>
	<li>Extrahieren Sie die Nukleinsäure, deren Endvolumen 50 l beträgt, innerhalb von 200 l des Überstandes unter Verwendung des handelsüblichen Gesamtnukleinsäureextraktionskits mit Instrument.</li>
</ol>6. RT-PCR und phylogenetische Analyse
HINWEIS: Es wurden mehrere Primer-Sets veröffentlicht, um alle bekannten Lyssaviren oder spezifischen Lyssaviren zu erkennen. Das hier beschriebene Protokoll ist ein Beispiel, das unser Labor verwendet und möglicherweise nicht allen experimentellen Anforderungen entspricht. Wählen Sie geeignete Primer nach Laborbedarf aus.
<ol><li>Bereiten Sie das einstufige RT-PCR-Reagenz wie folgt vor: Fügen Sie dem Reaktionsgemisch, das 2,5 l 10x Reaktionspuffer, 0,5 l Vorwärts- und Rückwärtsprimer (jeweils 10 m), 4 l von 1,25 mM dNTP, 0,3 l RNase-Inhibitor (40 U/L) enthält, 5 l , 0,3 l Reverse-Transkriptase (10 U/L), 0,4 l DNA-Polymerase (5 U/L) und 11,5 l DEPC-behandeltes Wasser. HINWEIS: Der in diesem Protokoll verwendete Primersatz ist JW12 (5'-ATGTAACACCYCTACAATG-3') und N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3')24. Ändern Sie die Herstellung von Reagenzien und Fahrradbedingungen entsprechend den verwendeten Grundierungssätzen.</li>
	<li>Führen Sie das Radfahren unter den folgenden Bedingungen durch: Inkubation bei 42 °C für 40 min; anfängliche Denaturierung bei 94 °C für 10 min; 35 Zyklen von 94 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; und schließlich weitere Verlängerung bei 72 °C für 10 min.</li>
	<li>Verwenden Sie einen anderen oder mehr Primer-Sets, um die Diagnoseempfindlichkeit zu erhöhen.<ol>
<li>Verwenden Sie N113F (5'-GTAGGATGCATGGG-3') und N304R (5'-TTGACGAAGATCTCTCTCTCAT-3')25,26, um das einstufige RT-PCR-Reagenz wie folgt vorzubereiten: Fügen Sie 5 l extrahierte Nukleinsäure zu einem Reaktionsgemisch hinzu, das 5 Vorwärts- und Reverse-Primer (jeweils 4 m), 5 l mit 1,25 mM dNTP, 0,5 l RNase-Inhibitor (40 U/L), 0,2 l Reverse-Transkriptase (10 U/L), 1 l DNA-Polymerase (5 U/L) und 23,3 l DEPC-behandeltes Wasser.</li>
		<li>Führen Sie das Radfahren unter den folgenden Bedingungen durch: Inkubation bei 42 °C für 40 min; anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 min; 35 Zyklen von 95 °C für 1 min, 55 °C für 1 min und 20 s und 72 °C für 1 min; und schließlich weitere Verlängerung bei 72 °C für 10 min. HINWEIS: Wählen Sie je nach Laborbedarf geeignete Grundierungen für die Diagnose aus. N113F wurde ursprünglich für die Amplifikation von Tollwutviren entwickelt, kann aber für andere Lyssaviren nicht gut funktionieren. Der Satz von N113F und N304R funktioniert gut für Tollwut-Virus (Taiwan Frettchen Dachs Variante) und Taiwan Fledermaus Lyssavirus. Es wird einfacher sein, ganze Nukleoproteinsequenzen mit dem Satz von JW12 und N304R Primern zu erhalten, wenn das Lyssavirus durch beide der beiden oben genannten Primer-Sets verstärkt wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analysieren Sie das PCR-Produkt auf 2% Agarose-Gel-Elektrophorese und visualisieren Sie durch UV-Lichtbeleuchtung.</li>
	<li>Sequenzieren Sie das PCR-Produkt nach kommerziellem Sequenzierungsdienst.</li>
	<li>Geben Sie die Sequenz ein oder laden Sie sie auf die Webseite des Nukleotide Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) hoch. Wählen Sie die Datenbank "Andere (nr etc.)" und geben Sie den Organismus als Lyssavirusein. Wählen Sie den MegaBlast-Algorithmus aus, und führen Sie den BLAST aus.</li>
</ol>7. Virusisolierung
HINWEIS: Führen Sie die Virusisolation durch, wenn entweder 1) die FAT oder 2) die RT-PCR positiv angegeben ist.
<ol><li>Homogenisieren Sie die Gehirnprobe in einer 10%(w/v) Suspension in MEM-10. Zentrifuge bei 825 x g für 10 min.</li>
	<li>Inokulieren Sie 200 l Überstand mit einer Suspension von 3 x 106 MNA (Mausneuroblastom) Zellen in 1 ml MEM-10 für 1 h bei 37 °C mit 1% CO2 . Übertragen Sie die Hirnhomogenat-Zellsuspension auf einen 25 cm2 Kolben und fügen Sie 6 ml MEM-10 hinzu.</li>
	<li>1 ml der Hirnhomogenat-Zellsuspension in einem 4-Well-Teflon-beschichteten Glasschlitten mit 6 mm Durchmesser gleichzeitig anbauen.</li>
	<li>Nach 3–4 Tagen Inkubation bei 37 °C mit 1%CO2fixieren Sie die Zellen auf dem 4-Well-Dia mit 100% Aceton (v/v).</li>
	<li>Färben Sie die Dias mit zwei FITC-konjugierten Antitollwut-Antikörpern nach den Schritten 4.4–4.7. Die Zellen werden infiziert, wenn die intrazytoplasmatischen Einschlüsse untersucht werden. Zeichnen Sie den Prozentsatz der infizierten Zellen auf.</li>
	<li>Führen Sie Trypsinisierung und Subkultur der geimpften Zellkultur durch, wenn die Dias negativ befleckt werden:<ol>
<li>Entfernen Sie das Medium und spülen Sie den Kolben mit 5 ml PBS.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml Trypsin in den Kolben und schlagen Sie fest auf den Boden des Kolbens.</li>
		<li>Fügen Sie 6 ml MEM-10 hinzu und setzen Sie die Zellen erneut aus.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellsuspension in einen neuen Gewebekolben (6 ml) und auf eine 4-Well-Rutsche (1 ml).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 7.4–7.6, bis eine 100% Infektiosität erreicht ist.</li>
	<li>Sammeln Sie den Überstand nach 24 h Inkubation.</li>
</ol>

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<li>Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+interlaboratory+trials+on+rabies+diagnosis%3A+an+overview+of+results+and+variation+in+reference+diagnosis+techniques+%28fluorescent+antibody+test%2C+rabies+tissue+culture+infection+test%2C+mouse+inoculation+test%29+and+molecular+biology+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).</li>
</ol>

Es werden keine Interessenkonflikte deklariert.

Dieses Laborstandard-Betriebsverfahren (SOP) bietet ein serielles Verfahren zur Prüfung von Fledermausproben auf das Vorhandensein von Lyssavirus-Antigenen in Taiwan. Zu den wichtigsten Schritten gehört der Einsatz von FAT und RT-PCR. Die Auswahl geeigneter Proben und die erfolgreiche Isolierung des Virus sind ebenfalls wichtig. Darüber hinaus wurde einige Fehlerbehebung während der Überwachung von Fledermaus Lyssaviren durchgeführt. Der Hauptunterschied waren die Zieltiere. Ursprünglich (2008-2009) waren die Zieltiere d...

Viren der Gattung Lyssavirus sind zoonotische Krankheitserreger. Es gibt mindestens sieben Lyssavirus-Arten, die mit menschlichen Fällen in Verbindung gebracht werden1. Zusätzlich zu den 16 Arten in dieser Gattung1,2,3, Taiwan Fledermaus Lyssavirus (TWBLV)4 und Kotalahti Fledermaus Lyssavirus5 wurden vor kurzem in Fledermäusen identifiziert, aber ihre taxonomischen Status haben noch nicht bestimmt werden.
Fledermäuse sind die natürlichen Wirte der meisten Lyssaviren, mit Ausnahme von Mokola Lyssavirus und Ikoma Lyssavirus, die noch nicht in irgendwelchen Fledermäusen identifiziert wurden1,2,3,6. Die Informationen über Lyssaviren bei asiatischen Fledermäusen sind immer noch begrenzt. Zwei nicht charakterisierte Lyssaviren bei asiatischen Fledermäusen (eines in Indien und das andere in Thailand)7,8 wurden berichtet. Ein menschlicher Tollwut-Fall im Zusammenhang mit einem Fledermausbiss in China wurde im Jahr 2002 berichtet, aber die Diagnose wurde nur durch klinische Beobachtung9gemacht. In Zentralasien wurde Das Aravan-Lyssavirus 1991 in Der weniger mausohrohrigen Fledermaus (Myotis blythi) in Kirgisistan und das Khujand-Lyssavirus in der Schnurrbartfledermaus (Myotis mystacinus) in Tadschikistan im Jahr 2001 10 identifiziert. In Südasien, Gannoruwa Fledermaus Lyssavirus wurde in der indischen Fliegenfuchs (Pteropus medius) in Sri Lanka im Jahr 2015identifiziert 3. In Südostasien zeigten mehrere serologische Studien an Fledermäusen auf den Philippinen, Thailand, Bangladesch, Kambodscha und Vietnam eine variable Seroprävalenz11,12,13,14, 15. Obwohl Irkut Lyssavirus in der größeren Röhrennasenfledermaus (Murina leucogaster) in der Provinz Jilin, China im Jahr 201216identifiziert wurde, bleiben die genauen Arten und Standorte von Lyssaviren in ostasiatischen Fledermauspopulationen unbekannt.
Um das Vorhandensein von Lyssavirus in taiwanesischen Fledermauspopulationen zu bewerten, wurde ein Überwachungsprogramm mit direkter FAT und RT-PCR initiiert. Taiwan Fledermaus Lyssavirus wurde in zwei Fällen der japanischen Pipistrelle identifiziert (Pipistrellus abramus)4 in 2016–2017. In diesem Artikel wird ein Laborstandard-Betriebsverfahren für die Lyssavirus-Überwachung der Fledermauspopulation in Taiwan eingeführt. Das Flussdiagramm der Fledermauslyssavirus-Diagnose in unserem Labor ist in Abbildung 1dargestellt.

<table><tbody><tr><td>2,5% Trypsin (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td>Trypsin</td></tr><tr><td>25 cm2 Flasche</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Honeywell</td><td>32201-1L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>VWR Life Science</td><td>97062-250</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol</td><td>NIHON SHIYAKU REAGENZ</td><td>NS-32294</td><td></td></tr><tr><td>AMV Reverse Transkriptase</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum (100X)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Blade</td><td>Braun</td><td>BA215</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Chemilumineance System</td><td>TOP BIO CO.</td><td>MGIS-21-C2-1M</td><td></td></tr><tr><td>Auffangröhrchen</td><td>Qiagen</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>Auffangröhrchen</td><td>SSI</td><td>2341-SO</td><td></td></tr><tr><td>Abdeckfolie</td><td>Muto Pure chemical Co., LTD.</td><td>24505</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Analysator</td><td>Applied Biosystems</td><td>3700XL</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>FITC Anti-Tollwut Monoklonales Globulin</td><td>Fujirebio Diagnostic Inc.</td><td>800-092</td><td>FITC-konjugierte Anti-Tollwut-Antikörper: Reagenz B</td></tr><tr><td>Vierwelliger Glasobjektträger mit Teflonbeschichtung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>30-86H-WHITE</td><td></td></tr><tr><td>Gelelektrophorese-System</td><td>Major Science</td><td>MJ-105-R</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td>Trypsin-Inkubator</td></tr><tr><td></td><td>ASTEC</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>LIGHT DIAGNOSTICS Tollwut-FAT-Reagenz</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>5100</td><td>FITC-konjugierte Anti-Tollwut-Antikörper: Reagenz A</td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact Instrument</td><td>Roche</td><td>03731146001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1</td><td>Roche</td><td>03730964001</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10x)</td><td>Gibco</td><td>11430030</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM Vitaminlösung</td><td>Gibco</td><td>11120052</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Nadel</td><td>Terumo</td><td>NN*2332R9</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Medicago</td><td>09-8912-100</td><td></td></tr><tr><td>Primer-Synthese</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasin Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>Sequenzierungsservice</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>AA00008032E00MNT10</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Edelstahl Perlen</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Steriles absorbierendes Pad</td><td>3M</td><td>1604T-2</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>Nalgene</td><td>171-0045</td><td></td></tr><tr><td>Taq-Polymerase</td><td>JMR Holdings</td><td>JMR-801</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>2720</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Zungenspatel</td><td>HONJER CO., LTD.</td><td></td><td></td>122246</tr><tr><td>Pinzette</td><td>Tennyson Entwicklung medizinischer Instrumente CO., LTD.</td><td>A0601</td><td></td></tr><tr><td>Tylosintartrat</td><td>Sigma</td><td>T6271-10G</td><td>MEM-10</td></tr></tbody></table>

standard-betriebsverfahren für lyssavirus-Überwachung der fledermauspopulation in taiwan

Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan

Viren innerhalb der Gattung Lyssavirus sind zoonotische Krankheitserreger, und mindestens sieben Lyssavirus-Arten sind mit menschlichen Fällen in Verbindung gebracht. Da Fledermäuse sind natürliche Reservoirs der meisten Lyssaviren, ein Lyssavirus-Überwachungsprogramm von Fledermäusen wurde in Taiwan seit 2008 durchgeführt, um die Ökologie dieser Viren bei Fledermäusen zu verstehen. In diesem Programm, nicht-staatliche Fledermaus-Schutz-Organisationen und lokale Tierseuchen-Kontrollzentren kooperierten, um tote Fledermäuse oder Fledermäuse sterben an Schwäche oder Krankheit zu sammeln. Gehirngewebe von Fledermäusen wurden durch Nekropsie erhalten und einem direkten fluoreszierenden Antikörpertest (FAT) und Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zum Nachweis von Lyssavirus-Antigenen und Nukleinsäuren unterzogen. Für die FAT werden mindestens zwei verschiedene Tollwut-Diagnosekonjugate empfohlen. Für die RT-PCR werden zwei Primersätze (JW12/N165-146, N113F/N304R) verwendet, um eine Teilsequenz des Lyssavirus-Nukleoprotein-Gens zu verstärken. Dieses Überwachungsprogramm überwacht Lyssaviren und andere Zoonoseerreger bei Fledermäusen. Taiwan Fledermaus Lyssavirus ist in zwei Fällen der japanischen Pipistrelle gefunden (Pipistrellus abramus) in 2016–2017. Diese Ergebnisse sollten die Öffentlichkeit, Gesundheitsfachleute und Wissenschaftler über die potenziellen Risiken der Kontaktaufnahme mit Fledermäusen und anderen Wildtieren informieren.

Von 2014 bis Mai 2017 wurden 332 Fledermauskadaver von 13 Arten zur Überwachung gesammelt. Zwei positiv getestet. Im ersten Fledermausfall wurde der Hirnabdruck mit einem der kommerziellen FITC-konjugierten Antitollwut-Antikörper negativ getestet (Abbildung 2), während die RT-PCRs mit jedem der beiden Primer-Sets (JW12/N165-146, N113F/N304R) positive Ergebnisse (Abbildung 3). Es wurde eine 428 bp-Sequenz von Amplicon (verstärkt mit N113F/N304R und enthält das pa...

Dieses Protokoll führt ein Standard-Labor-Betriebsverfahren für diagnostische Tests von Lyssavirus-Antigenen bei Fledermäusen in Taiwan.

Standard-Betriebsverfahren für Lyssavirus-Überwachung der Fledermauspopulation in Taiwan

Viruses within the genus Lyssavirus are zoonotic pathogens, and at least seven lyssavirus species are associated with human cases. Because bats are ...

Lyssavirus ist ein Zoo-no-tic Pathogene. Um das Vorhandensein von Lyssavirus in taiwanesischen Fledermauspopulationen zu bewerten, haben wir ein Überwachungsprogramm initiiert. Und es identifizierte erfolgreich vier Lyssaviren von 2016 bis 2018.Dieses Protokoll ist eine schrittweise Einführung in die Überwachung des Lyssavirus in Taiwan. Wir hoffen, dass es für Forscher nützlich sein wird, die an der Überwachung des Lyssavirus interessiert sind. Es ist wichtig, das richtige Tac-Keg-Symbol zu verbinden.Eine tote oder sterbende Fledermaus ist besser geeignet als eine lebende Fledermaus für Lyssavirus Überwachung. Je nach den Biosicherheitsvorschriften des Landes, in dem sich das Labor befindet, führen Sie die folgenden Verfahren in einem geeigneten Labor auf Biosicherheitsebene durch. Und dafür sorgen, dass die Forscher derzeit qualifiziert sind und die richtige persönliche Schutzausrüstung tragen.Nach der Sammlung von schwachen oder kranken Fledermäusen oder Kadaver, haben ein FledermausÖkologe die Fledermausart durch die morphologischen Eigenschaften des Exemplars identifizieren. Übermitteln Sie dem Labor ein Informationsblatt, das den Sammelplatz, die Arten, die klinischen Zeichen und andere relevante Daten zu jeder Fledermausprobe enthält. Vor Beginn der Nekroskopie, untersuchen Sie alle äußeren Öffnungen und fotografieren die Fledermäuse äußere Merkmale, vor allem den Kopf, Ohren und Flügel für die Artendifferenzierung.Um eine orale Tupferprobe zu sammeln, legen Sie die Fledermaus in ventraler Rekumbency auf eine sterile Dissektionsplatte und fixieren Sie den Kopf mit einer Pinzette. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Haut entlang der Mittellinie des Wadenbereichs zu schneiden; und ziehen Sie die Haut zu den Seitenseiten, um einen Schnitt im Schädel entlang der Mittellinie des Wadenbereichs zu machen. Öffnen Sie den Schädel mit einer Pinzette, um das Hirngewebe freizulegen, und verwenden Sie die Pinzette, um das Hirngewebe sanft vom verbundenen Nervengewebe zu trennen.Schneiden Sie den Querschnitt des Gehirns, einschließlich des Hirnstamms und des Kleinhirns, und berühren Sie die geschnittene Oberfläche des Hirngewebes leicht mit Glasdias, um Abstrichabdrücke zu machen. Drücken Sie das Dia auf Linsengewebe, um das überschüssige Gewebe zu entfernen und den Abstrich abdruckgleitet in minus 20 Grad Celsius Aceton für 30 Minuten. Dann fixieren Sie ein kleines Stück frisches Hirngewebe, in Formalin, für histopathologische Untersuchung.Und legen Sie den Rest des Gewebes in emi-em 10 für die Nukleinsäureextraktion. Als nächstes die Haut von der Mannigfaltigkeit zum Anus entlang der Mittellinie des Körpers zu schneiden, und verwenden Sie die Pinzette, um die Haut zu heben und zu trennen und Muskelgewebe zu unterstreichen;um die Sammlung der Speicheldrüsen zu ermöglichen, die sich in der Nähe des Unterkieferknochens befinden. Heben Sie das Brustbein mit der Pinzette leicht an, verwenden Sie das Skalpell, um das Brustbein und die Bauchwand entlang der Mittellinie zu schneiden und die Clavikeln zu schneiden.Verwenden Sie Nadeln, um den linken und rechten Rippenkäfig an der Sezierplatte zu befestigen, um die Brusthöhle zu öffnen. Und erfassen Sie die Brutto-Legionen und den Grad der Post-Mortem-Änderung. Verwenden Sie dann die Pinzette und das Skalpell, um das viszerale Gewebe entsprechend der geplanten Downstream-Analyse zu entfernen.Um am Ende der Fixierung einen direkten fluoreszierenden Antikörpertest durchzuführen, trocknen Sie die Abstrichabformdias und wählen Sie für die Analyse mindestens zwei fluoreszenzkonjugierte Antitollwut-Antikörper aus. Filtern Sie einen Antikörper auf jeden Dia durch ein 0,45 Mikrometer Sieb. Und die Rutschen 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer bebrüten.Am Ende der Inkubation das überschüssige Konjugat abtropfen lassen und die Dias mit PBS waschen. Verwenden Sie dann ein kleines Volumen von 10% Glycerin, um Deckel-Slips auf die Dias zu montieren und die Dias mittels Fluoreszenzmikroskopie abzubilden. Wenn entweder der fluoreszierende Antikörpertest oder die RT-PCR-Analyse positiv angegeben ist, homogenisieren Sie die Gehirnprobe in der 10%-Suspension in emi-en 10 und sedimentieren Sie das Gewebe fleu-rry durch Zentrifugation.200 Mikroliter des Super-nat-en mit dreimal 10 bis 6. Maus-Neuroblastomzellen und einem Milliliter emi-en 10 für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 1% Kohlendioxid impfen. Und übertragen Sie die homogene Zellsuspension des Gehirns auf einen 25 Zentimeter quadratischen Kolben, der sechs Milliliter frischee emi-en 10 enthält. Bei einem Milliliter Hirnhomogenzellsuspension in einen vierwelligen Teflon-beschichteten Glasschlitten mit einem Durchmesser von sechs Millimetern und legen Sie den Schlitten drei bis vier Tage lang bei 37 Grad Celsius und 1% Kohlendioxid.Nach der Fixierung mit 100% Aceton, färben Sie die Dias mit den gleichen zwei fluoreszenz konjugierten Antitollwut-Antikörpern, wie sie für den Fluoreszenz-Antikörpertest verwendet werden. Und visualisieren Sie die Dias durch fluoreszierende Mikroskopie, um die Anzahl der Intracida-plas-mic Einschlüsse zu bestimmen. Nach der Trypsinisierung und Unterkultivierung der geimpften Zellkultur nach Standardprotokollen, kehren Sie die Kältekultur für weitere drei bis vier Tage in den Zellkultur-Inkubator zurück, wobei die Anzahl der infizierten Zellen wiederholt gezählt wird, wie gerade gezeigt, bis eine 100%ige Infektiosität erreicht ist.Von Januar 2014 bis Mai 2017 wurden 332 Fledermauskadaver von 13 Arten zur Überwachung gesammelt. In dieser repräsentativen Analyse von zwei positiven Fledermausfällen wurde der Hirneindruck negativ mit dem fluoreszierenden Antikörpertest mit einem der kommerziellen, fit-sy konjugierten Antitollwut-Antikörper getestet, während die RT-PCR, die jeden der beiden verschiedenen Primer-Sets verwendet, positive Ergebnisse lieferte. Die Unterwerfung der erhaltenen Ampli-con-Sequenz nach Sprengabfragen in der Gen-Bank-Datenbank ergab, dass die Sequenz Lyssaviren ähnelte, deren Identitäten weniger als 79 % der Identitäten der entdeckten Lyssaviren unterstützten.Zwei Lyssaviren wurden anschließend erfolgreich aus den beiden Gehirnen isoliert, wie durch Fluoreszenz-Antikörpertest und Sequenzierung bestätigt. Der schlüsselfertige Schritt zur Bestimmung der Lyssavirus-Positivität sind der Fluoreszenz-Antikörpertest und die RT-CPR-Analyse. Die Verwendung von zwei oder mehr Anti-Tollwut-Antikörpern in den Primer-Sets wird dringend empfohlen.Neben dem Lyssavirus können weitere Zoo-nicht-ical Fledermaus-Erreger mit geschlossenen diagnostischen Methoden überwacht werden. Die Daten können dann verwendet werden, um die Öffentlichkeit über die Vermeidung von Kontakt mit Fledermäusen zu informieren. Je mehr wir in der Lage sind, Fledermaus Lyssavirus zu studieren, desto mehr werden wir in der Lage sein, seine Entwicklung und Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit zu verstehen.

standard-operating-procedure-for-lyssavirus-surveillance-bat

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle, um 1) Virus-codierte Immunmodulatoren zu identifizieren, die Förderung von Arboviren Replikation und (2) Eukaryotische Host Faktoren, die Arboviren Replikation zu beschränken. Diese Fluoreszenz und Lumineszenz-basierten Methoden können Forscher schnell quantitative Ablesung von Arboviren Replikation in einfachen Tests mit geringen Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

Ein Pan-Lysavirus verschachtete Umkehr-Transkription Polymerase-Kettenreaktion wurde entwickelt, um speziell alle bekannten Lyssaviren zu erkennen. Die Validierung mit Tollwut-Hörnproben verschiedener Tierarten ergab, dass diese Methode eine Empfindlichkeit und Spezifität hat, die dem Gold-Standard-Fluoreszenz-Antikörper-Test entspricht und für die routinemäßige Tollwutdiagnostik verwendet werden könnte.

Bewertung einer universellen, veralteten Transcription Polymerase Chain Reaction zur Erkennung von Lyssaviren

Dies ist ein Protokoll für die optimale Gewebevorbereitung für genomische, transkriptomische und proteomische Analysen von Fledermäusen, die in freier Wildbahn gefangen sind. Es enthält Protokolle für Fledermaus-Capture und -Sektion, Gewebekonservierung, und Zellkultivierung von Fledermausgewebe.

Gewebesammlung von Fledermäusen für -Omics Analysen und primäre Zellkultur

Diese Echtzeit-RT-PCR mit dsDNA interkalierenden Farbstoff ist geeignet, Lyssavirus-Infektionen zu diagnostizieren. Die Methode beginnt mit RNA, die aus Tollwut-Verdachtsproben für Ante-Mortem- oder Post-Mortem-Proben extrahiert wird, detaillierung der Master-Mix-Vorbereitung, RNA-Addition, Einrichtung der Echtzeitmaschine und korrekte Interpretation der Ergebnisse.

Pan-lyssavirus Echtzeit RT-PCR für Tollwut-Diagnose

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Erfahren Sie das Standardverfahren zur Lyssavirus-Überwachung in Fledermauspopulationen in Taiwan. Diese Methode ermöglicht Forschern die Identifizierung von vier verschiedenen Lyssaviren und trägt zum Verständnis zoonotischer Krankheitsdynamiken bei.

Standard-Betriebsverfahren für Lyssavirus-Überwachung der Fledermauspopulation in Taiwan

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