Standard-Betriebsverfahren für Lyssavirus-Überwachung der Fledermauspopulation in Taiwan

Lyssavirus ist ein Zoo-no-tic Pathogene. Um das Vorhandensein von Lyssavirus in taiwanesischen Fledermauspopulationen zu bewerten, haben wir ein Überwachungsprogramm initiiert. Und es identifizierte erfolgreich vier Lyssaviren von 2016 bis 2018.

Dieses Protokoll ist eine schrittweise Einführung in die Überwachung des Lyssavirus in Taiwan. Wir hoffen, dass es für Forscher nützlich sein wird, die an der Überwachung des Lyssavirus interessiert sind. Es ist wichtig, das richtige Tac-Keg-Symbol zu verbinden.

Eine tote oder sterbende Fledermaus ist besser geeignet als eine lebende Fledermaus für Lyssavirus Überwachung. Je nach den Biosicherheitsvorschriften des Landes, in dem sich das Labor befindet, führen Sie die folgenden Verfahren in einem geeigneten Labor auf Biosicherheitsebene durch. Und dafür sorgen, dass die Forscher derzeit qualifiziert sind und die richtige persönliche Schutzausrüstung tragen.

Nach der Sammlung von schwachen oder kranken Fledermäusen oder Kadaver, haben ein FledermausÖkologe die Fledermausart durch die morphologischen Eigenschaften des Exemplars identifizieren. Übermitteln Sie dem Labor ein Informationsblatt, das den Sammelplatz, die Arten, die klinischen Zeichen und andere relevante Daten zu jeder Fledermausprobe enthält. Vor Beginn der Nekroskopie, untersuchen Sie alle äußeren Öffnungen und fotografieren die Fledermäuse äußere Merkmale, vor allem den Kopf, Ohren und Flügel für die Artendifferenzierung.

Um eine orale Tupferprobe zu sammeln, legen Sie die Fledermaus in ventraler Rekumbency auf eine sterile Dissektionsplatte und fixieren Sie den Kopf mit einer Pinzette. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Haut entlang der Mittellinie des Wadenbereichs zu schneiden; und ziehen Sie die Haut zu den Seitenseiten, um einen Schnitt im Schädel entlang der Mittellinie des Wadenbereichs zu machen. Öffnen Sie den Schädel mit einer Pinzette, um das Hirngewebe freizulegen, und verwenden Sie die Pinzette, um das Hirngewebe sanft vom verbundenen Nervengewebe zu trennen.

Schneiden Sie den Querschnitt des Gehirns, einschließlich des Hirnstamms und des Kleinhirns, und berühren Sie die geschnittene Oberfläche des Hirngewebes leicht mit Glasdias, um Abstrichabdrücke zu machen. Drücken Sie das Dia auf Linsengewebe, um das überschüssige Gewebe zu entfernen und den Abstrich abdruckgleitet in minus 20 Grad Celsius Aceton für 30 Minuten. Dann fixieren Sie ein kleines Stück frisches Hirngewebe, in Formalin, für histopathologische Untersuchung.

Und legen Sie den Rest des Gewebes in emi-em 10 für die Nukleinsäureextraktion. Als nächstes die Haut von der Mannigfaltigkeit zum Anus entlang der Mittellinie des Körpers zu schneiden, und verwenden Sie die Pinzette, um die Haut zu heben und zu trennen und Muskelgewebe zu unterstreichen;um die Sammlung der Speicheldrüsen zu ermöglichen, die sich in der Nähe des Unterkieferknochens befinden. Heben Sie das Brustbein mit der Pinzette leicht an, verwenden Sie das Skalpell, um das Brustbein und die Bauchwand entlang der Mittellinie zu schneiden und die Clavikeln zu schneiden.

Verwenden Sie Nadeln, um den linken und rechten Rippenkäfig an der Sezierplatte zu befestigen, um die Brusthöhle zu öffnen. Und erfassen Sie die Brutto-Legionen und den Grad der Post-Mortem-Änderung. Verwenden Sie dann die Pinzette und das Skalpell, um das viszerale Gewebe entsprechend der geplanten Downstream-Analyse zu entfernen.

Um am Ende der Fixierung einen direkten fluoreszierenden Antikörpertest durchzuführen, trocknen Sie die Abstrichabformdias und wählen Sie für die Analyse mindestens zwei fluoreszenzkonjugierte Antitollwut-Antikörper aus. Filtern Sie einen Antikörper auf jeden Dia durch ein 0,45 Mikrometer Sieb. Und die Rutschen 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer bebrüten.

Am Ende der Inkubation das überschüssige Konjugat abtropfen lassen und die Dias mit PBS waschen. Verwenden Sie dann ein kleines Volumen von 10% Glycerin, um Deckel-Slips auf die Dias zu montieren und die Dias mittels Fluoreszenzmikroskopie abzubilden. Wenn entweder der fluoreszierende Antikörpertest oder die RT-PCR-Analyse positiv angegeben ist, homogenisieren Sie die Gehirnprobe in der 10%-Suspension in emi-en 10 und sedimentieren Sie das Gewebe fleu-rry durch Zentrifugation.

200 Mikroliter des Super-nat-en mit dreimal 10 bis 6. Maus-Neuroblastomzellen und einem Milliliter emi-en 10 für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 1% Kohlendioxid impfen. Und übertragen Sie die homogene Zellsuspension des Gehirns auf einen 25 Zentimeter quadratischen Kolben, der sechs Milliliter frischee emi-en 10 enthält. Bei einem Milliliter Hirnhomogenzellsuspension in einen vierwelligen Teflon-beschichteten Glasschlitten mit einem Durchmesser von sechs Millimetern und legen Sie den Schlitten drei bis vier Tage lang bei 37 Grad Celsius und 1% Kohlendioxid.

Nach der Fixierung mit 100% Aceton, färben Sie die Dias mit den gleichen zwei fluoreszenz konjugierten Antitollwut-Antikörpern, wie sie für den Fluoreszenz-Antikörpertest verwendet werden. Und visualisieren Sie die Dias durch fluoreszierende Mikroskopie, um die Anzahl der Intracida-plas-mic Einschlüsse zu bestimmen. Nach der Trypsinisierung und Unterkultivierung der geimpften Zellkultur nach Standardprotokollen, kehren Sie die Kältekultur für weitere drei bis vier Tage in den Zellkultur-Inkubator zurück, wobei die Anzahl der infizierten Zellen wiederholt gezählt wird, wie gerade gezeigt, bis eine 100%ige Infektiosität erreicht ist.

Von Januar 2014 bis Mai 2017 wurden 332 Fledermauskadaver von 13 Arten zur Überwachung gesammelt. In dieser repräsentativen Analyse von zwei positiven Fledermausfällen wurde der Hirneindruck negativ mit dem fluoreszierenden Antikörpertest mit einem der kommerziellen, fit-sy konjugierten Antitollwut-Antikörper getestet, während die RT-PCR, die jeden der beiden verschiedenen Primer-Sets verwendet, positive Ergebnisse lieferte. Die Unterwerfung der erhaltenen Ampli-con-Sequenz nach Sprengabfragen in der Gen-Bank-Datenbank ergab, dass die Sequenz Lyssaviren ähnelte, deren Identitäten weniger als 79 % der Identitäten der entdeckten Lyssaviren unterstützten.

Zwei Lyssaviren wurden anschließend erfolgreich aus den beiden Gehirnen isoliert, wie durch Fluoreszenz-Antikörpertest und Sequenzierung bestätigt. Der schlüsselfertige Schritt zur Bestimmung der Lyssavirus-Positivität sind der Fluoreszenz-Antikörpertest und die RT-CPR-Analyse. Die Verwendung von zwei oder mehr Anti-Tollwut-Antikörpern in den Primer-Sets wird dringend empfohlen.

Neben dem Lyssavirus können weitere Zoo-nicht-ical Fledermaus-Erreger mit geschlossenen diagnostischen Methoden überwacht werden. Die Daten können dann verwendet werden, um die Öffentlichkeit über die Vermeidung von Kontakt mit Fledermäusen zu informieren. Je mehr wir in der Lage sind, Fledermaus Lyssavirus zu studieren, desto mehr werden wir in der Lage sein, seine Entwicklung und Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit zu verstehen.