Name: Bewertung des Darmkrebsrisikos und der Prävalenz durch Stuhl-DNA-Integritätsnachweis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Erfahren Sie die nicht-invasive Stuhl-DNA-Integritätsnachweis-Methode zur Verbesserung der Darmkrebsfrüherkennung. Dieses benutzerfreundliche Kit kombiniert sicher mit bestehenden Screening-Tests für präzisere Risikobewertungen.

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Die Autoren haben keine Anerkennung.

Die Patienten wurden zwischen 2013 und 2015 am Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) in Meldola (FC, Italien) rekrutiert. Die eingeschriebenen Patienten wurden in das Protokoll IRSTB002 aufgenommen, das von der Ethikkommission von IRST - IRCCS AVR genehmigt wurde (25/10/2012, ver. 1). Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Von allen Patienten wurde eine schriftliche Einwilligung eingeholt.
1. DNA-Extraktion aus dem Stuhl
<ol><li>Verwenden Sie ein Kit, um Stuhlproben vorzubereiten (siehe Materialtabelle). Wählen und behandeln Sie das Fäkalienmaterial, indem Sie die Extraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers durchführen. Verstärken Sie die gereinigte DNA direkt oder speichern Sie sie bei -20 °C für die nachfolgende Analyse.</li>
</ol>2. Herstellung von Positivkontrolle, Standards, Spike-in-DNA und klinischen Proben
<ol><li>Erstellung von Normen und Proben<ol>
<li>Um die positive Kontrolle, Standards, Spike-in-DNA und alle klinischen Proben vorzubereiten, zentrifugieren Sie ein Aliquot aus positiver Kontrolle, Standards und Spike-in-DNA, und setzen Sie dann jedes Reagenz durch Zugabe der richtigen Menge an bereitgestelltem Wasser wieder aus (siehe unten). Dann, vorsichtig Wirbel die positive Kontrolle, Standard, und Spike-in-DNA, dann Zentrifuge für 10 s. Um eine vollständige Resuspension der trockenen Reagenzien zu erreichen, lagern Sie die flüssigen Reagenzien vor Gebrauch 30 min bei Raumtemperatur (RT).<ol>
<li>Die positive Kontrolle ist menschliche DNA in einem trockenen Format. Setzen Sie jedes Aliquot mit 750 l Wasser auf.</li>
			<li>Die Spike-in-DNA ist Lachs (Oncorhynchus keta) DNA, die als exogene interne Kontrolle verwendet wird, um das mögliche Vorhandensein von Inhibitoren in DNA-Proben aus Stuhl extrahiert zu überprüfen. Setzen Sie jedes Aliquot mit 100 l Wasser auf.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Um die Standardkurve vorzubereiten, produzieren Sie vier 1:5 Verdünnungen ausgehend von der Lagerlösung. Die Standardpunkte müssen 10 ng/Reaktion, 2 ng/Reaktion, 0,4 ng/Reaktion und 0,08 ng/Reaktion sein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der 1x Spike-in-DNA<ol>
<li>Bereiten Sie die Spike-in-DNA-Kontrolle direkt vor der Verwendung vor.</li>
		<li>Bereiten Sie die 1x Spike-in-DNA-Kontrolle vor, indem Sie 5 l FL-DNa-Spitze mit 20 l sterilem Wasser mischen. Die Anzahl der 1x Spike-in-DNA-Kontrollproben wird entsprechend der Anzahl der zu analysierenden Proben sowie der positiven Kontrolle erstellt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von Proben<ol>
<li>Mischen Sie 75 l der Proben (klinische Proben oder Positivkontrolle) mit 25 l 1x Spike-in-DNA, was zu einem Gesamtvolumen von 100 l führt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Amplifikation und Bestimmung des FL-DNA-Wertes mit qPCR Easy PGX
HINWEIS: Vollständige Amplifikationsmischungen mit spezifischen Primern und Sonden, die auf die menschliche DNA und die interne Kontrolle abzielen, werden in einem lyophilisierten Format in 8 Well-Streifen für FL-DNA Mix A und FL-DNA Mix B bereitgestellt. Standards, positive und negative Kontrollen sowie Proben müssen mit beiden lyophilisierten Mischungen verstärkt werden. Klinische Proben dürfen nur mit beiden lyophilisierten Mischungen doppelt verstärkt werden.
<ol><li>Siehe Tabelle der Materialien für qPCR-Instrument und Bediensoftware.<ol>
<li>Öffnen Sie die Bediensoftware und richten Sie die Platte und das Wärmeprofil ein:<ol>
<li>Richten Sie die Platte wie in Tabelle 1dargestellt ein.<ol>
<li>Legen Sie den Brunnentyp für alle acht Positionen in Spalte 1 als Standardfest.</li>
				<li>Stellen Sie den Brunnentyp für die Brunnen A2 und B2 als NTCein.</li>
				<li>Legen Sie den Brunnentyp für C2 und D2 (die positiven Steuerelemente) als Unbekanntfest.</li>
				<li>Legen Sie den Brunnentyp für alle anderen Positionen als Unbekannt fest.
</li>
				<li>Wählen Sie alle 96 Positionen aus, und fügen Sie die Dyes FAM und HEXhinzu. Klicken Sie auf Sync Plate.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Stellen Sie das Wärmeprofil gemäß Tabelle 2ein.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die benötigte Anzahl von Streifen für 10 s, um den Inhalt auf den Boden des Rohres zu bringen.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Dichtungen von den Streifen, während Sie darauf achten, den Inhalt zu behalten, und fügen Sie zu den jeweiligen Streifen: Negativkontrolle: 20 L Wasser; Probe: 20 L DNA; Standardkurve: 20 l der Norm 1, 2, 3 oder 4; Positivkontrolle: 20 L positiv kontrollierbar.</li>
		<li>Schließen Sie alle Streifen mit den 8 Streifen flachen optischen Kappen und Wirbel für einige Sekunden sorgfältig.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Streifen für 10 s und laden Sie sie in das Instrument. Starten Sie dann den Lauf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Datenanalyse
HINWEIS: Die Datenanalyse kann je nach Software automatisch oder manuell durchgeführt werden (siehe Materialtabelle).
<ol><li>Wählen Sie am Ende des Laufs die Spalten A, C, E, G für "FAM: FL-DNA-A" und "HEX: IC"und die Spalten B, D, F, H für "FAM: FL-DNA-B" und "HEX: IC"aus.</li>
	<li>Stellen Sie für die Standardmengen Ausgangsmengefolgendes auf: 10 ng/Reaktion für A1- und B1-Bohrungen, 2 ng/Reaktion für C1 und D1, 0,4 ng/Reaktion für E1 und F1 und 0,08 ng/Reaktion für G1 und H1.</li>
	<li>Legen Sie Schwellenwertfluoreszenzwerte für FAM-Kanäle (FL-DNA A und FL-DNA B) und HEX (IC) auf 150 fest.</li>
	<li>KlickenSie im Feld Ergebnistabelleauf Spaltenoptionen | Alle auswählen | Ok, um die Ergebnisse in beiden Kanälen mit ihren jeweiligen Cq-Werten (-R) und -R-Lastwerten zu erhalten. HINWEIS: Diese Werte werden von der Real Time PCR-Instrumentensoftware bereitgestellt. Die letzte R entspricht dem fluoreszenzwert, der auf den letzten Amplifikationszyklus normalisiert wurde.</li>
	<li>Klicken Sie im Feld Ergebnistabelle mit der rechten Maustaste auf die Tabelle, um das Kontextmenü zu öffnen, und klicken Sie auf An Excel senden, um die Rohdaten zu exportieren.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Werte der Standards, um die Eignung der Standardkurve zu überprüfen.</li>
	<li>Überprüfen Sie für jeden FL-DNA-Mix dieR2-Spalte ["R2 (R)" und die Effizienz ["Effizienz (%)" Spaltenwerte. Wenn sie sich in einem akzeptablen Bereich befinden, ist es möglich, die Analyse entsprechend den Anweisungen des Herstellers fortzusetzen (Tabelle 3).</li>
	<li>Wenn die Ergebnisse des FAM-Kanals nicht im erwarteten Bereich liegen, lassen Sie einen Punkt der Standardkurve weg, und analysieren Sie den Lauf erneut.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Werte der negativen und positiven Steuerelemente mit der folgenden Formel, wobei die "No Cq"-Werte als Null berücksichtigt werden: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg">
</li>
	<li>Vergleichen Sie die erhaltenen Werte mit den in Tabelle 4genannten Werten.</li>
	<li>Wenn sich die Reaktionssteuerungen im Bereich der erwarteten Werte befinden, fahren Sie mit der Analyse der Proben fort. ANMERKUNG: Stellen Sie sicher, dass die erhaltenen Cq-Werte aus einer realen Amplifikationsreaktion (sigmoidale Fluoreszenzkurve) und nicht aus einem Artefakt (lineare Fluoreszenzkurve) generiert werden.</li>
	<li>Um die Eignung der Probe für jeden FL-DNA-Mix zu analysieren, vergleichen Sie die Cq-Werte des HEX-Kanals. Wenn der Wert 16 € beträgt, fahren Sie mit der Analyse der Proben fort. Wenn der Wert &lt;16 ist oder kein Cq vorhanden ist, ist dies wahrscheinlich auf einen Dosierfehler des FL-DNA Spike zurückzuführen. Daher ist es nicht möglich, die Proben zu analysieren.</li>
	<li>Berechnen Sie den Mittelwert der Cq-Werte im "HEX"-Kanal der Positivsteuerung mit der folgenden Formel: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq3.jpg">
</li>
	<li>Berechnen Sie den Mittelwert der Cq-Werte im "HEX"-Kanal der Stichprobenreplikationen mit der folgenden Formel: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq4.jpg">
</li>
	<li>Berechnen Sie die CqHEX-Werte nach der folgenden Formel: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq5.jpg">
</li>
	<li>Vergleichen Sie die CqHEX-Werte der Stichproben mit den in Tabelle 5.</li>
	<li>Vergleichen Sie für jede Mischung (Mix A und Mix B) die Cq-Werte des FAM-Kanals mit den in Tabelle 6 gemeldeten Werten.
</li>
	<li>Um den FL-DNA-Wert jeder geeigneten Probe zu bestimmen, verwenden Sie die folgende Formel, wobei die "No Cq"-Werte als Null betrachtet werden: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq6.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg"> HINWEIS: Das Darmkrebsrisiko und die Prävalenz sind eine Funktion von iFOBT- und FL-DNA-Auswertungen gemäß den Von Rengucci et al.12 (Tabelle 7) erhaltenen Fagan-Nomogramm-Ergebnissen.</li>
</ol>

<ol><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Genetics+of+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular Genetics of Colorectal Cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).</li>
<li>Sears, C. L., Garrett, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbes%2C+Microbiota%2C+and+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Microbes, Microbiota, and Colon Cancer.</a> Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).</li>
<li>SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National Cancer Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html">http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html</a> (2019).</li>
<li>Levin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+Surveillance+for+the+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Adenomatous+Polyps%2C+2008%3A+A+Joint+Guideline+From+the+American+Cancer+Society%2C+the+US+Multi-Society+Task+Force+on+Colorectal+Cancer%2C+and+the+American+College+of+Radiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology.</a> Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).</li>
<li>Bosch, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tests+for+colorectal+cancer+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Colorectal+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular tests for colorectal cancer screening.</a> Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).</li>
<li>Ahlquist, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+colorectal+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of colorectal neoplasia.</a> Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+multiple+molecular+tests+to+detect+colorectal+cancer+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+colorectal+cancer+by+a+quantitative+fluorescence+determination+of+DNA+amplification+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool.</a> Neoplasia. 6, 536-540 (2004).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescence+determination+of+long-fragment+DNA+in+stool+as+a+marker+for+the+early+detection+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer.</a> Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+DNA+for+noninvasive+diagnosis+of+colorectal+cancer+in+immunochemical+fecal+occult+blood+test-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).</li>
<li>De Maio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+and+stool+nucleic+acid+analysis+for+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).</li>
<li>Rengucci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stool+DNA+integrity+method+for+early+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).</li>
</ol>

Maura Menghi ist hauptamtliche Mitarbeiterin von Diatech Pharmacogenetics srl.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die DNA-Integritätsanalyse von Hockern, die durch manuelle und halbautomatische Ansätze extrahiert wurden, ein alternatives Werkzeug zur Früherkennung von kolorektalen Läsionen darstellen kann7,8,9,,10,11,12. Molekulare, nichtinvasive Screening-Tests wurden im Laufe der Jahre für den Nachwe...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.
The first&#160;affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.

Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Darmkrebs (CRC) leitet sich von einem mehrstufigen Prozess ab, bei dem sich gesundes Epithel langsam zu Adenomen oder Polypen entwickelt, die im Laufe der Zeit zu bösartigen Karzinomen übergehen1,2. Trotz der hohen Inzidenzrate des SCR wurde in den letzten zehn Jahren ein rückläufiger Trend beim Anteil der Todesfälle beobachtet3. Tatsächlich haben frühdiagnostische Instrumente, die in Screening-Programmen eingesetzt werden, zur Früherkennung und Entfernung von präneoplastischen Adenomen oder Polypen4geführt. Aufgrund der unterschiedlichen technischen Grenzen ist jedoch keine dieser Methoden optimal. Um die Empfindlichkeit und Spezifität zu verbessern, wurden viele Stuhl-DNA-Tests allein oder in Kombination mit aktuellen Routinediagnostiktestsvorgeschlagen 5,6.
Typischerweise, gesunde Schleimhaut vergießt in den Fäkalstrom apoptotische Kolonozyten, während kranke Schleimhaut Peeling nicht-apoptotische Kolonozyten. Fragmente von 200 bp oder mehr in der Länge charakterisieren nicht-apoptotische DNA. Diese DNA wird lange DNA (L-DNA) genannt und ist zu einem nutzbaren Biomarker für die CRC-Frühdiagnose geworden. Die L-DNA kann aus Stuhlproben isoliert und mit qPCR mit einem in vitro diagnostischen FL-DNA Kit7,8,9,10,11,12quantifiziert werden.
Der Test besteht aus zwei Assays zum Nachweis von FL-DNA-Fragmenten im Bereich von 138 bp bis 339 bp. Jeder Assay ermöglicht die Amplifikation von FL-DNA (FAM) sowie Spike-in-DNA (HEX). Um eine optimale Verstärkung aller Fragmente zu gewährleisten, wurde der Test in zwei Assays (genannt "A" und "B") unterteilt. Der A-Test erkennt zwei Regionen von Exon 14 des APC-Gens (NM_001127511) und ein Fragment von Exon 7 des TP53-Gens (NM_001276760). Der B-Test erkennt ein Fragment von Exon 14 des APC-Gens (NM_001127511) und zwei Regionen der Exons 5 und 8 des TP53-Gens (NM_001276760). Die Assays unterscheiden nicht zwischen den erkannten Regionen. Die Spike-in-DNA entspricht der Oncorhynchus Keta Lachs DNA und ermöglicht die Überprüfung, ob das Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt wurde und überprüft das mögliche Vorhandensein von Inhibitoren, die zu falschen negativen Ergebnissen führen können. Die FL-DNA-Konzentration wird durch absolute Quantifizierung nach der Standardkurvenmethode ausgewertet und als ng/Reaktion ausgedrückt.
Die FL-DNA-Methode ist ein nicht-invasiver und kostengünstiger Stuhl-DNA-Test, der in Kombination mit dem immunchemischen fäkalen okkulten Bluttest (iFOBT) derzeit in CRC-Screening-Programmen verwendet wird und bessere Vorhersagen von CRC- und/oder Hochrisiko-Adenomaläsionenermöglicht 12.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL und 2 mL Polypropylen-Twist-Lock-Röhrchen (DNase-, RNase-, DNA-, PCR-Inhibitor-frei)</td><td></td><td></td><td>Erforderliche Verbrauchsmaterialien für DNA-Extraktion und Real Time</td></tr><tr><td>PCR Absolutes Ethanol (Qualität des analytischen Grads)</td><td></td><td></td><td>Reagenz für DNA-Extraktion erforderlich</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Maximale Geschwindigkeit von 20000 x g. Erforderliches Gerät für die DNA-Extraktion</td></tr><tr><td>EasyPGX Analysesoftware Version 2.0.0</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT800-SW</td><td>Analysesoftware&nbsp;</td></tr><tr><td>EasyPGX Zentrifuge/Vortex 8-Well-Streifen</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT803</td><td>Gerät empfohlen für den Real Time PCR Assay</td></tr><tr><td>EasyPGX qPCR Gerät 96&nbsp;</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT800-96</td><td>Empfohlenes Gerät für den Real Time PCR Assay</td></tr><tr><td>EasyPGX ready FL-DNA</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT029</td><td>Kit erforderlich für den Real Time PCR Assay</td></tr><tr><td>Mikropipetten (Volumina von 1 bis 1.000 & Mikro; L)</td><td></td><td></td><td>Verbrauchsmaterialien, die für die DNA-Extraktion und Real Time PCR benötigt</td></tr> werden <tr><td>Puderfreie Einweghandschuhe</td><td></td><td></td><td>Verbrauchsmaterialien, die für die DNA-Extraktion und Real Time PCR benötigt</td></tr><tr><td>werden QIAamp Fast DNA Stool</td><td>Qiagen</td><td>51604</td><td>Kit, empfohlen für die DNA-Extraktion und -Reinigung aus dem</td></tr><tr><td>Stuhl Sterile Filterspitzen DNase-, RNase-frei (Volumina von 1 bis 1.000 & Mikro; L)</td><td></td><td></td><td>Verbrauchsmaterialien, die für die DNA-Extraktion und die Echtzeit-PCR erforderlich</td></tr> sind <tr><td>Thermischer Block, z. B. EasyPGX Trockenblock</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT801</td><td>Erforderliches Instrument für die DNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Vortex, z. B. EasyPGX Zentrifuge/Vortex 1,5 ml&nbsp;</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT802</td><td>Erforderliches Instrument für die DNA-Extraktion</td></tr></tbody></table>

bewertung des darmkrebsrisikos und der prävalenz durch stuhl-dna-integritätsnachweis

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Heute kann Stuhl-DNA mit mehreren Methoden isoliert und analysiert werden. Die langen DNA-Fragmente im Stuhl können durch einen qPCR-Assay nachgewiesen werden, der eine zuverlässige Wahrscheinlichkeit für das Vorhandensein von präneoplastischen oder neoplastischen dickdarmen Läsionen bietet. Diese Methode, die fluoreszenzlange DNA (FL-DNA) genannt wird, ist ein schnelles, nicht-invasives Verfahren, das eine Verbesserung gegenüber dem primären Präventionssystem darstellt. Diese Methode basiert auf der Bewertung der Fäkal-DNA-Integrität durch quantitative Verstärkung spezifischer Ziele der genomischen DNA. Insbesondere die Auswertung von DNA-Fragmenten von mehr als 200 bp ermöglicht den Nachweis von Patienten mit kolorektalen Läsionen mit sehr hoher Spezifität. Dieses System und alle derzeit verfügbaren Stuhl-DNA-Tests stellen jedoch einige allgemeine Probleme dar, die angegangen werden müssen (z. B. die Häufigkeit, mit der Tests durchgeführt werden sollten, und eine optimale Anzahl von Stuhlproben, die zu jedem Zeitpunkt für jeden einzelnen Personen gesammelt werden). Der Hauptvorteil von FL-DNA ist jedoch die Möglichkeit, sie in Verbindung mit einem Test zu verwenden, der derzeit im CRC-Screening-Programm verwendet wird, dem immunchemischen fekten okkulten Bluttest (iFOBT). Tatsächlich können beide Tests an derselben Probe durchgeführt werden, wodurch die Kosten gesenkt und eine bessere Vorhersage des eventuellen Vorhandenseins von kolorektalen Läsionen erreicht werden kann.

Der Workflow dieses Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt. Der Workflow bietet zwei Steuerungsschritte und verschiedene Aktionen entsprechend diesen Schrittergebnissen. Erstens: Wenn eine Probe ungeeignete Kontrollen enthält, muss die Verstärkung wiederholt werden. Zweitens: Wenn die Verstärkung gehemmt wird, muss die Probe von Anfang an aufbereitet oder als nicht wertvoll eingestuft werden.
Abbildung 2 zeigt die Fluoreszenzkurven, die durch positive und ne...

Das vorgestellte diagnostische FL-DNA-Kit ist eine zeitsparende und benutzerfreundliche Methode, um die zuverlässige Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins von Darmkrebsläsionen zu bestimmen.

Bewertung des Darmkrebsrisikos und der Prävalenz durch Stuhl-DNA-Integritätsnachweis

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Diese Methode ermöglicht es, durch einen nicht-invasiven Ansatz Patienten mit kolorektaler neoplastischer Läsion zu erkennen. Insbesondere erlaubt dieser Test in Verbindung mit Tests, die derzeit im Darmkrebs-Screening-Programm verwendet werden, das Vorhandensein von Krebs oder ein höheres Risiko für abnormale Läsionen besser vorherzusagen. Um dieses Protokoll zu beginnen, zentrifugieren Sie ein Aliquot jeder positiven Kontrolle, Standard-DNAs und Spike-in-DNA, in einem trockenen Format für 10 Sekunden auf einer Mini-Zentrifuge.Setzen Sie die Positivkontrolle mit 750 Mikroliter Wasser aus. Setzen Sie die Spike-in-DNA, die als exogene interne Kontrolle verwendet wird, um das Vorhandensein von Inhibitoren zu testen, mit 100 Mikroliter Wasser aus. Für die Standardkurve den Trockenen mit 100 Mikroliter Wasser wieder aufhängen und vier 1:5 Verdünnungen ab der Stammlösung vornehmen.Dann die Reagenzien 15 Sekunden lang vorsichtig wirbeln und 10 Sekunden lang in einer Minizentrifuge zentrieren. Für eine vollständige Resuspension die flüssigen Reagenzien vor der Verwendung 30 Minuten bei Raumtemperatur lagern. Um die 1x Spike-in-DNA-Kontrolle vorzubereiten, mischen Sie fünf Mikroliter FL-DNA-Spike mit 45 Mikroliter sterilem Wasser.Mischen Sie für die Proben 75 Mikroliter jeder Probe mit 50 Mikrolitern 1x Spike-in-DNA, was ein Gesamtvolumen von 125 Mikrolitern ergibt. Öffnen Sie zunächst die qPCR-Betriebssoftware. Um die Platte einzurichten, legen Sie den Brunnentyp für alle acht Positionen in Spalte 1 als Standard fest.Stellen Sie den Brunnentyp für die Brunnen A2 und B2 als NTC ein. Legen Sie den Brunnentyp für die positiven Steuerelemente C2 und D2 auf Unbekannt fest. Und setzen Sie den Brunnentyp für alle anderen Positionen als Unbekannt.Wählen Sie alle 96 Positionen aus. Fügen Sie die Farbstoffe FAM und HEX hinzu und klicken Sie auf Sync Plate. Legen Sie dann das Thermalprofil wie angegeben fest.Bereiten Sie die gewünschte Anzahl von 8-Well-Streifen vor, die vollständige lyophilisierte Amplifikationsmischungen enthalten, mit spezifischen Primern und Sonden, die auf die menschliche DNA und die interne Kontrolle abzielen. Um den Inhalt auf den Boden der Rohre zu bringen, zentrifugieren Sie die Streifen für 10 Sekunden. Entfernen Sie vorsichtig die Dichtungen von den Streifen, um sicherzustellen, dass sie kein Pellet verlieren.Dann 25 Mikroliter Wasser in die negativen Kontrollbrunnen geben. 25 Mikroliter Proben-DNA zur Probe bohrungen Brunnen und 25 Mikroliter Positivkontroll-DNA in die Positivkontrollbrunnen. Fügen Sie für die Standardkurve 25 Mikroliter der Standard-1, 2, 3 und 4 in jedem dedizierten Brunnen hinzu.Verwenden Sie 8-Streifen flache optische Kappen, um alle Streifen und Wirbel für ein paar Sekunden vorsichtig zu schließen. Zentrifugieren Sie die Streifen 10 Sekunden lang, laden Sie sie in das Instrument und starten Sie den Lauf. Wählen Sie am Ende des Laufs für FAM FL-DNA A und HEX IC die Spalten A, C, E und G aus. Für FAM FL-DNA B und HEX IC wählen Sie Spalten, B, D, F und H. Für die Standardmengen Ausgangsmenge 10 Nanogramm pro Reaktion für A1- und B1-Bohrungen, zwei Nanogramm pro Reaktion für C1 und D1, Punkt vier Nanogramm pro Reaktion für E1 und F1 und Punkt Null acht Nanogramm pro Reaktion für G1 und H1. Legen Sie dann für FAM- und HEX-Kanäle Threshold Fluoreszenzwerte auf 150 fest.Klicken Sie im Feld Ergebnistabelle auf Spaltenoptionen, dann auf Alle auswählen und dann auf Okay, um die Ergebnisse in beiden Kanälen mit ihren jeweiligen Cq- und Delta-R-Lastwerten zu erhalten, die von der Echtzeit-qPCR-Instrumentensoftware bereitgestellt werden. Delta R entspricht zuletzt dem fluoreszenzwert, der auf den letzten Amplifikationszyklus normalisiert wurde. Klicken Sie im Feld Ergebnistabelle mit der rechten Maustaste auf die Tabelle, um das Kontextmenü zu öffnen.Klicken Sie auf An Excel senden, um die Rohdaten zu exportieren. Und laden Sie dann die Excel-Datei auf die dedizierte Analysesoftware hoch, um die FL-DNA-Menge automatisch zu berechnen. Aus der Kombination von iFOBT- und FL-DNA-Werten wird für jeden Patienten das Darmkrebsrisiko geschätzt.Fluoreszenzkurven einer geeigneten positiven Probe zeigen das Probensignal auf dem HEX-Kanal, der internen Steuerung, innerhalb des akzeptablen Bereichs. Das positive Signal liegt über der Schwelle auf dem FAM-Kanal, die die Verstärkung von Zielgenen anzeigt. Fluoreszenzkurven einer geeigneten negativen Probe zeigen das Probensignal innerhalb des akzeptablen Bereichs auf dem HEX-Kanal an.Das negative Steuersignal liegt unterhalb des Schwellenwerts auf dem FAM-Kanal. Andererseits zeigen Kurven einer nicht geeigneten Probe das Sample-Signal, das nicht innerhalb des akzeptablen Bereichs auf dem HEX-Kanal liegt. Höchstwahrscheinlich aufgrund einer möglichen Hemmung.Daher muss diese Probe wiederholt werden, beginnend mit der Extraktion. Die Ausgabetabelle der Softwareanalyse zeigt Daten für Mix A und Mix B in Bezug auf die FL-DNA-Konzentration für Reaktionskontrollen, klinische Proben und Ergebnisse der Qualitätskontrolle. Beispiel Nummer vier hat keine Ergebnisse, da die Qualitätskontrolle nicht bestanden wurde.Sie muss wiederholt und neu analysiert werden. Bitte seien Sie vorsichtig, wenn Sie die DNA für Spike-in-Kontrolle auf die Standardkurve resuspended. Und bei der Verteilung verschiedener DNAs auf 8-Well-Streifen sowie während der molekularen Detektion im Abschnitt der Ergebnisanalyse.Diese Methode muss in Kombination mit dem iFOBT-Test durchgeführt werden, um eine bessere Bewertung der chromektierten neoplastischen Läsionen zu ermöglichen, sie muss mit derselben Fäkalienprobe durchgeführt werden.

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Krebsforschung

Reduzierte / fehlender Expression von PMS2 und / oder ERCC1 im gesamten Krypten ist ein häufiges Ereignis innerhalb von 10 cm auf jeder Seite des Kolon-Adenokarzinome, wahrscheinlich aufgrund eines Defektes Bereich mit hoher Wandlungsfähigkeit und Progression von Krebs. Ein Mangel an Ku86 oder CCOI ist viel seltener in diesen Bereich Mängel.

Mangelhafte PMS2, ERCC1, Ku86, CCOI in Field Mängel bei der Progression zu Darmkrebs

Wir beschrieben ein Verfahren für die Zerlegung von Darmkrebs (CRC), lebensfähige einzelne Zellen, die dann auf kundenspezifische Antikörper Microarrays erkennen Oberflächen-Antigene (DotScan CRC-Microarray) erfasst zu produzieren. Sub-Populationen von Zellen gebunden, die Microarray kann durch Fluoreszenz-Multiplexing mit monoklonalen Antikörpern mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert profiliert werden.

Darmkrebs Zelloberflächenprotein Profiling mit einem Antikörper Microarray und Fluoreszenz Multiplexing

Dieses Video beschreibt das DNA-Isolationsprotokoll aus Stuhlproben von Dickdarmtumor-tragenden Mäusen. Die extrahierte DNA wird mittels PCR amplifiziert und das Produkt mit einem auf magnetischen Kügelchen basierenden Ansatz weiter gereinigt. Mit dieser Methode kann der Effekt der Umweltanreicherung auf die Dickdarmmikrobiota und die Tiersterblichkeit bestimmt werden.

Mikrobielle DNA-Isolierung im Stuhl: Untersuchung des Effekts der Umweltanreicherung auf die Mikrobiomdiversität im Maustumormodell

Wir berichten über signifikante Verbesserungen bei der reproduzierbaren Messung von somatischen Mutationen von Dickdarmstammzellen nach Exposition von Mäusen gegenüber potentiellen DNA-schädigenden Stoffen.

Quantifizierung von Kolon Stem Cell Mutationen

Es wird eine Methode zur Analyse der DNA-Integrität in der zellfreien Überstandsfraktion von Urinproben vorgeschlagen. Die Methode eignet sich zur Früherkennung urologischer Malignome und hat sich für die Früherkennung von Blasenkrebs als genau erwiesen.

Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben

Environmental Enrichment (EE) ist eine Unterbringung von Tieren, die verwendet wird, um Mechanismen zu offenbaren, die die Zusammenhänge zwischen Lebensstil, Stress und Krankheit zugrunde liegen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, das verwendet ein Maus-Modell der Doppelpunkt Tumorgenese und EE speziell Veränderungen in Mikrobiota Artenvielfalt definieren, die tierischen Sterblichkeit auswirken können.

Eine Methode, um die Auswirkungen der Umweltanreicherung Doppelpunkt Microbiome Biodiversitätskonvention in einem Mausmodell Doppelpunkt Tumor definieren

Digitalen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein nützliches Werkzeug zum hochempfindlichen Nachweis von Einzel-Nukleotid und DNA-Kopie Zahl Varianten. Hier zeigen wir wichtige Überlegungen zur Messung der seltenen Varianten im menschlichen Genom mittels digitaler PCR mit dem Chip-in-Rohr-Format.

Digitalen Polymerase-Kettenreaktion-Assay für die genetische Variation bei einem sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis Patienten mit dem Chip-in-Rohr-Format

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um die überexprimierten Treibergene zu entdecken, die die etablierten krebsstammähnlichen Zellen, die aus kolorektalen HT29-Zellen gewonnen wurden, aufrecht erhalten. RNAseq mit verfügbarer Bioinformatik wurde durchgeführt, um Genexpressionsnetzwerke zu untersuchen und zu untersuchen, um einen potenziellen Mechanismus zu erhellen, der am Überleben von gezielten Tumorzellen beteiligt ist.

Entdeckung von Treiber-Genen in kolorektalen HT29-abgeleiteten Krebs-Stamm-ähnlichen Tumorsphären

Wir präsentieren ein flexibles Protokoll zur Erzeugung hochwertiger Metagenome (Virome) (Virome) aus menschlichen Stuhlproben. Ursprünglich für die Bodenviromik entwickelt, wurde dieses Protokoll hier erfolgreich auf Stuhlproben angewandt, was eine robuste Charakterisierung der menschlichen Darmvirosphäre ermöglichte.

DNA-Viralgrößenfraktion-Metagenomik für menschliche Stuhlproben

Wir beschreiben die Etablierung von orthotopen kolorektalen Tumoren durch Injektion von Tumorzellen oder Organoiden in den Cecum von Mäusen und die anschließende Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) aus diesem Modell.

Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

Erfahren Sie die nicht-invasive Stuhl-DNA-Integritätsnachweis-Methode zur Verbesserung der Darmkrebsfrüherkennung. Dieses benutzerfreundliche Kit kombiniert sicher mit bestehenden Screening-Tests für präzisere Risikobewertungen.

Bewertung des Darmkrebsrisikos und der Prävalenz durch Stuhl-DNA-Integritätsnachweis

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