Verarbeitung von Bronchoalveolar Lavage Fluid und Matched Blood für Alveolar Macrophage und CD4⁺ T-Zell Immunophenotypisierung und HIV Reservoir Assessment

HIV ist aufgrund seiner Persistenz in zellulären und anatomischen Reservoirs unheilbar. Diese Methode ermöglicht eine HIV-Reservoir-Bewertung von Immunzellen, die aus der Lunge isoliert sind. Diese Technik ermöglicht die Isolierung von Lungenschleimhaut-T-Zellen und Alveolar-Makrophagen aus BAL-Flüssigkeit für eine weitere phänotypische oder virologische Bewertung als zelluläre HIV-Reservoirs.

Das Verständnis der Biologie von Alveolarmakrophagen und CD4-positiven T-Zellen und deren Beitrag zum HIV-Reservoir könnte zu wichtigen Erkenntnissen über die Herausforderungen einer HIV-Heilung führen. Die Isolierung von primären Makrophagen von BAL kann auf verschiedene andere Forschungsbereiche angewendet werden, einschließlich entzündlicher oder infektiöser Lungenerkrankungen wie Asthma und Tuberkulose. Nachdem Sie die BAL-Flüssigkeit von einem menschlichen Patienten gemäß den Standardprotokollen erhalten haben, wirbeln Sie die Flüssigkeit im ursprünglichen Sammelrohr aus, bevor Sie die Probe in ein 50-Milliliter-Rohr innerhalb eines Biosicherheitsschranks übertragen.

Wenn die Flüssigkeit sehr trüb oder durch fadenförmiges Gewebe kontaminiert erscheint, filtern Sie die Probe durch einen 70-Mikrometer Nylon-Netzfilter in ein neues 50-Milliliter-Rohr. Nach der Zentrifugation den Überstand in ein neues 50-Milliliter-Rohr geben und mit einer Pipettenspitze das Pellet, das die gesamten BAL-Zellen enthält, sanft aufbrechen. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter RPMI 1640 Medium aus und fügen Sie einen Milliliter des reservierten Überstandes von je 10 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohren hinzu.

10-Milliliter-Aliquots des verbleibenden Überstandes in 15-Milliliter-Konusröhren geben und alle überstandenen Proben in die Speicherung von minus 80 Grad Celsius legen. Verdünnen Sie die Pelletzellsuspension in 10 Milliliter Medium für jeden 25 Milliliter Originalprobe und sammeln Sie die BAL-Zellen durch Zentrifugation. Dann setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Medium mit 10% fetalem Rinderserum, oder FBS, für das Zählen.

Zum Sortieren ganzer BAL- und peripherer mononukleanischer Blutzellen fügen Sie den fünf Zellen jeweils zwei fünf Milliliter runde Polystyrolröhren pro Teilmenge für die ungefärbten und lebensfähigkeitsbefleckten Kompensationskontrollen fünfmal 10 zu den fünf Zellen hinzu und fügen den Rest jeder Teilmenge in ein Fünf-Milliliter-Rohr pro Probe ein. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie die Kontrollpellets in 100 Mikroliter PBS pro Tube auf Eis wieder auf, bis sie verwendet werden. Setzen Sie die Pellets der Zellen für die Sortierung in 250 Mikroliter eines von 20 Verdünnungdes des Fc-Rezeptor-Blockierpuffers für eine Stunde bei vier Grad Celsius aus, um eine unspezifische Bindung zu blockieren.

Am Ende der blockierenden Inkubation den entsprechenden Antikörpercocktail von Interesse für eine zusätzliche einstündige Inkubation bei vier Grad Celsius hinzufügen. Am Ende der primären Antikörper-Inkubation einen Milliliter PBS zu jedem Rohr für die Zentrifugation hinzufügen und die Pellets in 250 Mikroliter Sortierpuffer auf eisgeschütztem Eis bis zur Sortierung wieder aufsetzen. Zur Vorbereitung der Kompensationskontrollen fügen Sie je drei Tropfen der Anti-Maus-Immunglobulin-Kappa-Kompensationsperlen und der Negativkontrollkompensationsperlen pro Milliliter PBS in ein Mikrozentrifugenrohr hinzu und übertragen 100 Mikroliter der Perlenlösung in jede Probe, die als Kompensation verwendet werden soll.

Fügen Sie jedem einzelnen Rohr, das Perlen enthält, einen Mikroliter jedes Antikörpers in den Cocktail und fügen Sie jedem Lebensfähigkeitsfleck einen Mikroliter Lebensfähigkeitsfleck hinzu. Nach 20 Minuten bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt, die Proben mit einem Milliliter PBS pro Tube waschen und die Pellets in 250 Mikroliter frischer PBS pro Tube wieder aufhängen. Laden Sie die ganz BAL-Zelle unbefleckte Kontrollprobe auf das Durchflusszytometer und richten Sie die Kompensationsmatrix ein.

Als nächstes laden Sie das Probenrohr und sortieren Sie die Zellen unter niedrigem Druck, gating, um Rauschen auszuschließen, um lebende und CD45-positive Zellen einzuschließen und die Doublets auszuschließen. Innerhalb der größeren myeloischen Population sortieren Sie die Doppel-positiven Zellen CD206 und CD169 als alveolare Makrophagen. Innerhalb der kleineren Lymphozytenpopulation isolieren Sie die CD3-positiven Zellen und sortieren Sie die CD4- und CD8-Einzel-positiven Populationen.

Um die periphere mononukleäre Blutzellprobe zu sortieren, Gate, um das Rauschen und DieDoppele auszuschließen und die lebenden CD45-positiven Zellen einzubeziehen, wie gezeigt. Nach dem Gating auf CD3, Gate die CD3-negative, CD14-positive Zellen für die Sortierung der single-positiven Monozyten und Gate der CD3-positive, CD4, und CD8-positive Zellen für die Sortierung der beiden Einzel-positiven Populationen. Beim Zählen der Ganz-BAL-Probe können verschiedene Zelltypen visualisiert werden, einschließlich größerer, runder Makrophagen und kleinerer, runder Lymphozyten.

Makrophagen sind der am häufigsten vorkommende Zelltyp in der BAL-Flüssigkeit und machen etwa 85 % der Zellen in der Nichtraucherlunge aus. Diese Zellen sind bei Rauchern so angereichert, dass sie fast ausschließlich erscheinen, und werden im Vergleich zu den bei Nichtrauchern beobachteten Makrophagen tendenziell um etwa 40 % vergrößert. Die Marker, die zum Sortieren von Alveolarmakrophagen aus BAL-Flüssigkeitsproben verwendet wurden, wurden auf der Grundlage zuvor beschriebener Phänotypen von Alveolarmakrophagen ausgewählt, wie dem Mannoserezeptor CD206, der auf phagozytischen Zellen vorhanden ist, und dem Sialoadhesinrezeptor CD169.

Nach ihrer Isolierung können Alveolarmakrophagen und andere Zelltypen zur Immunphenotypisierung durch Durchflusszytometrie, immunologische Funktionelle Assays oder Reservoirquantifizierung durch ultraempfindliche PCR verwendet werden. Diese Technik ermöglicht den Zugang zu hochreinen geweberesidenten Makrophagen, die historisch schwer zu erreichen waren, was die bisher unerreichbare Untersuchung der signifikanten Immunzellpopulation ermöglicht.