CRISPR/Cas9-Technologie zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression in iPSC-abgeleiteten Muskelprogenitoren

Duchenne ist eine Muskeldystrophie, die vorzeitige Erschöpfung der Muskelvorläuferzellen verursacht. Es ist eine der schwersten Muskeldystrophien. Um eine funktionelle Muskelregeneration zu fördern, verwenden wir CRISPR/Cas9-vermittelte Genbearbeitung, um die Dystrophinexpression in induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Muskelvorläuferzellen wiederherzustellen.

Die CRISPR-Cas9 Genbearbeitung hat das Potenzial, die Dystrophin-Genexpression wiederherzustellen. Autologe iPSC-abgeleitete Muskelvorläuferzellen können die Stammzellpore auffüllen, Schäden reparieren und weitere Komplikationen in DMD verhindern, ohne eine Immunantwort zu verursachen. Verschiedene Wirkstoffe von iPS-Zellen in myogenen Vorläuferzellen reduzierten das Risiko einer Tumor-Regenese in iPS-Zellen.

Mehrere Therapien, die autologe induzierte Pluripotente Stammzell-abgeleitete Muskelvorläuferzellen mit CRISPR-Cas9-vermittelter genetischer Korrektur kombinieren, versprechen Duchenne-Muskeldystrophie-Behandlungsstrategien. Diese Technologie kann verwendet werden, um viele angeborene Krankheiten durch die genetische Bearbeitung autologer Stammzellen, einschließlich Herz-, Gehirn- und Blutkrankheiten, zu behandeln. Wir haben gezeigt, dass die Demonstration dieses Ansatzes den Lesern Erfahrung im Umgang mit Zellumprogrammierung und Genbearbeitung bieten kann, was eine Herausforderung bleibt.

Untersuchen Sie unter einem invertierten Mikroskop die Kolonien infizierter embryonaler Mausstammzellen. Markieren Sie die Kolonien am boden der Schale mit dem selbstfänzigen Objektmarker. Tragen Sie gefettete Klonringe auf, um die markierten Zellkolonien abzudecken.

Fügen Sie 100 Mikroliter 0,05%Trypsin-EDTA zu jedem Klonring hinzu und legen Sie die Platte fünf Minuten lang in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Dann übertragen Sie die verdauten Zellen mit 100-Mikroliter-Pipettenspitzen auf 48-Well-Kulturplatten, die 250 Milliliter MES-Wachstumsmedium enthalten. Inkubieren Sie die Zellen im 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid und 85% Feuchtigkeit.

Wenn sie 70% Konfluss lesen, wählen Sie die Brunnen mit gut gewachsenen Zellen und fügen Sie 250 Milliliter TVP-Lösung für 30 Minuten zu verdauen. Übertragen Sie dann die Zellkultur von jedem Brunnen auf ein Sechs-Zentimeter-Gericht. Wiederholen Sie das Auftragen von Klonringen und der Inkubation für mehrere Male, bis einheitliche, wohnheimförmige Klone erhalten sind.

Verdauen Sie nun die vorbereiteten Maus-iPSCs, indem Sie einen Milliliter TVP-Lösung hinzufügen. Übertragen Sie die Zellkultur in eine 24-Well-Platte, die mit Fibronectin und Gelatine beschichtet ist, und brüten Sie bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Nachdem die Zellen 50% Konfluss erreicht haben, wechseln Sie zu 500 Mikroliter frischem Kulturmedium, das acht Mikrogramm pro Milliliter Polybren enthält.

Fügen Sie dann 100 Mikroliter der lentiviralen Partikellösung zu den mausiPSCs hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für drei Tage bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Als nächstes bestimmen Sie die minimale Konzentration von Blasticidin und Hygromycin B, die bei der halben Killrate innerhalb von 24 Stunden ist.

Fügen Sie die Medien von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Blasticidin und 100 Mikrogramm pro Milliliter Hygromycin B in die Zellen, warten Sie drei Tage, und wählen Sie die Zellen, die als Stabilisatoren infizierter Zellen haften bleiben. Verdauen Sie die ausgewählten Maus-iPSCs mit 0,5 Milliliter TVP-Lösung, die jeweils gut in einer neuen 24-Well-Platte enthalten, und brüten Sie Zellen für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Anschließend pipette die iPSCs in einzelne Zellen und zählen die Zellen mit einer Zellzählkammer.

Wählen Sie etwa 150 verdaut Einzelzellen und verdünnen Sie mit MES-Medium in 10-Zentimeter-Schale, Kultur bei 37 Grad Celsius mit 5%Kohlendioxid. Nach etwa 10 Tagen, unter einem invertierten Mikroskop, verwenden Sie 10 Mikroliter sterile Pipettenspitzen, um einzelne Kolonien zu pflücken und jede Kolonie in 50 Mikroliter TVP-Lösung in einer 96-Well-Platte zu übertragen. 30 Minuten bei 37 Grad Celsius verdauen.

Zuverlässige manuelle Klonung ist entscheidend für den Erfolg der Ernte von CRISPR/Cas9-bearbeiteten induzierten Pluripotenten Stammzellen. Dann übertragen und teilen Sie die verdauten Zellen aus jedem Brunnen in zwei weitere 96-Well-Kulturplatten. Bei 37 Grad Celsius bis 70% konfluent inkubieren.

Mit den Zellkolonien bei 70%Konfluss entfernen Sie das Medium in der 96-Well-Platte. Fügen Sie 25 Mikroliter Lysis-Reagenz mit 1%Proteinase-K-Lösung zu jedem Brunnen hinzu und übertragen Sie das Lysat auf eine weitere 96-Well-PCR-Platte. Versiegeln Sie die PCR-Platte mit Klebedichtungen und inkubieren Sie die Platte in einem thermischen Cycler bei 55 Grad Celsius für 30 Minuten und dann bei 95 Grad Celsius für 45 Minuten, um die Zellen zu lysieren und die Proteinase K.Then, in einem PCR-Rohr, fügen Sie zwei Mikroliter des Lysats, 10 Mikroliter 2x DNA Polymerase Premix, 7 Mikroliter DNase-freies Wasser hinzu. und einen Mikroliter DMD Exon23 Primer.

Starten Sie die PCR-Reaktion entsprechend dem Manuskript. Dann laden Sie die pcR-Reaktion, die mit 2,2 Mikroliter Ladepuffer versorgt wird, auf ein 2%Agarose-Gel. Führen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 100 bis 150 Volt und inspizieren Sie das Gel unter UV-Licht.

In diesem Protokoll wurden zwei Führungs-RNAs entworfen, die den mutierten Exon23 flankieren. Nach Cas9-vermittelten Doppelsträngigenpausen und nicht-homologe Endverbindung wurde der mutierte Exon23 gelöscht, was eine abgeschnittene, aber funktionelle Dystrophin-Produktion ermöglichte. Um das Auslaufen der Trypsin-Lösung zu vermeiden, müssen wir Fett gleichmäßig auf den Boden der Ringe auftragen.

Die Kombination von CRISPR/Cas9 Genombearbeitung mit einem aufgehefteten MyoD-Aktivierungssystem bietet eine sichere, praktikable und effektive Strategie für die autologe Transplantation bei Duchenne-Muskeldystrophie-Patienten mit Gen-Recovery-Basalvorläuferzellen.