Name: Muster-Triggered Oxidative Burst und Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: Lernen Sie zwei zuverlässige Assays zur Quantifizierung von Abwehrreaktionen in Arabidopsis thaliana: den transienten oxidativen Burst und die Hemmung des Sämlingswachstums. Diese Methoden ermöglichen schnelle Vergleiche verschiedener Genotypen.

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Die Arbeit in unserem Labor wird durch das Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, die Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader es Fund und die Queen es University finanziert. KS und IS werden durch Tandem Ontario Graduate Scholarships und NSERC Canada Graduate Scholarships für Master-Studenten (CGS-M) unterstützt.

1. Erkennung von ROS-Burst in Arabidopsis-Blattscheiben nach Immunentlösung
<ol><li>Pflanzenwachstum und -wartung.<ol>
<li>Um die Keimung zu synchronisieren, schichten Sie Arabidopsis Samen, indem Sie etwa 50 Samen in 1 ml sterilem 0,1% Agar [w/v] aussetzen und 3-4 Tage bei 4 °C (kein Licht) lagern. ANMERKUNG: Stratify eine Wildtyp-Hintergrundsteuerung (z. B. Col-0) und Genotypen mit hohen und niedrigen Immunausgängen (z. B. cpk28-1 bzw. bak1-5), um als interne Kontrollen zu dienen.</li>
		<li>Säen Sie Samen auf dem Boden und keimen unter Standard-Kurztagesbedingungen (22 °C, 10 h Licht, 150 mE/m2/s Lichtintensität und 65-70% relative Luftfeuchtigkeit).</li>
		<li>Nach ca. 7 Tagen verwenden Sie Zangen, um einzelne Sämlinge in neue Töpfe zu verpflanzen, die durch mindestens 4 cm voneinander getrennt sind, um eine vollständige Rosettenentwicklung zu ermöglichen. Transplantieren Sie 6-12 Sämlinge pro Genotyp und kehren Sie zu Standard-Kurztagesbedingungen zurück. Regelmäßig Wasser- und Düngepflanzen (1 g/L 20-20-20 Dünger alle 2 Wochen).</li>
	</ol></li>
	<li>Sammeln Sie Blattscheiben in 96-Well-Platten für die Erholung über Nacht.<ol>
<li>Nach 4-5 Wochen nach der Keimung (Abbildung 1A), verwenden Sie einen scharfen 4 mm Biopsie-Punch, um eine Blattscheibe pro Pflanze zu entfernen, die Mittelvene zu vermeiden und darauf zu achten, die Verwundung zu begrenzen (Abbildung 1B). Legen Sie Blattscheiben in eine unbenutzte 96-Well-Luminometerplatte, die 100 l ddH2O enthält, wobei die adaxiale Seite nach oben zeigt, um eine Austrocknung zu verhindern22 (Abbildung 1C). Wenn Sie mehrere Elicitoren bewerten, entfernen Sie 1 Blattscheibe aus dem gleichen Blatt für jede Elicitor-Behandlung. HINWEIS: Probenblätter, die vollständig erweitert sind, von der Spitze der Rosette an dritter bis fünfter Stelle und ungefähr die gleiche Größe und das gleiche Alter aufweisen, um die Variabilität zu begrenzen. Wenn möglich, schneiden Blattscheiben mit einer Rasierklinge vor der nächtlichen Erholung in die Hälfte, da dies die Oberfläche erhöht, die der Elicitorlösung ausgesetzt ist23.</li>
		<li>Erholen Sie sich über Nacht bei Raumtemperatur, um die Interferenz von ROS zu verhindern, die durch Wundung während der Blattscheibensammlung entsteht. Abdeckungsplatten mit Deckel, um Verdunstung zu verhindern.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die Elicitor-Behandlung durch und messen Sie die ROS-Produktion.<ol>
<li>Programmieren Sie den Plattenleser vor dem Hinzufügen der Reaktionslösung, da dies die Zeit zwischen der ROS-Burst-Initiierung und den ersten aufgezeichneten Messungen reduziert. Verwenden Sie eine kommerzielle Software, die für den Plattenleser geeignet ist. In unserem Fall (siehe Inhaltsverzeichnis) klicken Sie auf Einstellungen, und wählen Sie die LUM96-Patrone und den kinetischen Lesetyp aus. Klicken Sie auf die Kategorie "Bereich lesen", und ziehen Sie, um eine Teilmenge der Bohrungen oder die gesamte zu lesende Platte auszuwählen. Legen Sie unter der Registerkarte PMT und Optics die Integrationszeit auf 1.000 ms fest. Legen Sie unter der Registerkarte Timing die Gesamtlaufzeit auf 40-60 min und das Intervall auf 2 min. fest.</li>
		<li>Entfernen Sie Wasser aus jedem Brunnen mit einer Mehrkanalpipette. HINWEIS: Punktieren Sie keine Blattscheiben, da dies zu Wundbelastung führen und zu variableren ROS-Ausgängen führen kann.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Reaktionslösung vor, die 100 'M Luminol, 10 'g/ml HRP und die gewünschte Konzentration von Elicitor (z. B. elf18 bei 1 nM, 10 nM, 100 nM oder 1.000 nM) in sterilem ddH2O mit 10 ml Lösung für eine 96-Well-Platte enthält. HINWEIS: Lyophilisierte Peptide in sterilenH2O in bindungsarmen Schläuchen auflösen, um einen 10 mM-Bestand herzustellen, in Flüssig N2zu blitzen und bei -80 °C aufzubewahren. Wenn Sie einsatzbereit sind, verdünnen Sie die Vorräte in sterilen H2O, um einen Arbeitsbestand von 100 m zu erzeugen und bei -20 °C aufzubewahren.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um 100 l des Reaktionsgemisches an jeden Brunnen zu verteilen, wobei die Lösung allen Blattscheiben der gleichen Behandlung zur gleichen Zeit hinzugefügt wird22. Schließen Sie eine Kontrollreaktion (kein Elicitor) für jeden Genotyp ein, um die basalen ROS-Spiegel in Ermangelung einer Auslösung zu bewerten. Messen Sie sofort die Lichtemission für alle Wellenlängen im sichtbaren Spektrum mit einem Mikroplattenleser. HINWEIS: Bereiten Sie die Reaktionslösung bei schwachem Licht vor und wenden Sie sie auf, da Luminol und HRP lichtempfindliche Reagenzien sind. Reagenzien auf Eis oder bei -20°C aufbewahren, sofern nicht verwendet.</li>
		<li>Messen Sie die Lichtemission mit einer Integrationszeit von 1.000 ms in 2 minuten Intervallen über einen Zeitraum von 40-60 min in einem Mikroplattenleser, um den dynamischen oxidativen Burst zu erfassen (Abbildung 1D). HINWEIS: Verwenden Sie eine längere Integrationszeit, um die Assayempfindlichkeit11zu verbessern und gleichzeitig sicherzustellen, dass alle Proben in einer 96-Well-Platte innerhalb eines Intervalls gemessen werden können.</li>
	</ol></li>
	<li>Dateninterpretation.<ol>
<li>Verwenden Sie für jeden Genotyp eine Tabellenkalkulationsanwendung, um die durchschnittliche Photonenanzahl und den Standardfehler zu jedem Zeitpunkt zu berechnen, und zeigen Sie die ROS-Produktion als Funktion der Zeit mithilfe eines Streudiagramms an. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq1.jpg"> Wo t = jeder Zeitpunkt
</li>
		<li>Alternativ können Sie die Photonenanzahl für jede Blattscheibe summieren und den Durchschnitt dieser Werte für jeden Genotyp mithilfe eines Balkendiagramms mit Standardfehlerbalken oder einer Box- und Schnurrhaardiagramm darstellen. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq2.jpg">
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Seedling Growth Inhibition Assay
<ol><li>Sterilisieren Sie Samen und säen Sie auf Murashige und Skoog (MS) Teller.<ol>
<li>Bereiten Sie sterile Halbstärke (0,5x) MS medium (2,16 g/L) mit 0,8% Agar [w/v] vor. Gießen Sie Medien in Platten (90 x 15 mm) in einer laminaren Durchflusshaube.</li>
		<li>Sterilisieren Sie ca. 100 Samen in einem Mikrozentrifugenrohr, indem Sie mit 1 ml 70% Ethanol für 2 min waschen und durch Aspiration entfernen. 1 ml 40% Bleichmittel hinzufügen und bei Raumtemperatur 1 ml 40% Bleichmittel und sanft eskhereintigen Gestein. Bleichmittel durch Aspiration entfernen und dreimal in 1 ml sterilem Wasser für 5 min waschen. Resuspend in 1 ml sterilen 0,1% Agar. HINWEIS: Alternativ verwenden Sie ein Chlorgassamen-Sterilisationsprotokoll24.</li>
		<li>Säen Sie ca. 100 Samen pro Genotyp auf MS-Agarplatten mit einer Pipette und versiegeln Sie mit Mikroporenband in einer laminaren Durchflusshaube. HINWEIS: Vermeiden Sie es, Samen in unmittelbarer Nähe zu platzieren, da dies die Transplantation von Sämlingen später schwierig macht.</li>
		<li>Satifizieren Sie Samen, indem Sie Teller bei 4 °C (kein Licht) für 3-4 Tage, um die Keimung zu synchronisieren (Abbildung 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transplantieren Sie Sämlinge in 48-Well-Platten, die Immun-Entsende-Peptide enthalten.<ol>
<li>Nach der Schichtung die Platten unter kurzen Tagesbedingungen (22 °C, 10 hLicht, 150 mE/m 2/s Lichtintensität und 65-70% relative Luftfeuchtigkeit) für 3-4 Tage zum Licht bewegen, um eine Keimung zu ermöglichen.</li>
		<li>In einer laminaren Durchflusshaube Peptidverdünnungen (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM und 1.000 nM) in sterilen 0,5x MS-Flüssigkeitsmedien mit 1% Saccharose [w/v] zubereiten, wobei 25 ml MS für jede 48-Well-Platte verwendet werden. Bereiten Sie Platten vor, indem Sie 500 l MS flüssiges Medium oder MS-Medium mit Peptiden pro Brunnen pipetieren. Falls verfügbar, verwenden Sie einen Repeat Pipettor für die Plattenvorbereitung, um den Prozess zu beschleunigen. HINWEIS: Für jeden Genotyp, wachsen Sämlinge in MS ohne Elicitor, um inhärente Unterschiede im Sämlingwachstum zu berücksichtigen.</li>
		<li>Mit sterilen Zangen sorgfältig verpflanzn einen Sämling zu jedem Brunnen der gleichen Größe und Alter, um sicherzustellen, dass es keine Schäden an der Sämling oder Bruch der Wurzel und dass die Wurzel in medienversinken. Für jeden Genotyp mindestens 6-8 Sämlinge in jede Peptidverdünnung transplantieren (Abbildung 2B). HINWEIS: Transplantieren Sie Sämlinge nach 4 Tagen nach der Keimung, da Kurzwurzeln leichter zu manipulieren sind und ältere Sämlinge weniger optimale Ergebnisse liefern können.</li>
		<li>Platten mit Mikroporenband versiegeln und unter normalen Kurztagesbedingungen (22 °C, 10 hLicht, 150 mE/m 2/s Lichtintensität und 65-70% relative Luftfeuchtigkeit) wieder ans Licht rücken. Sämlinge 8-12 Tage wachsen lassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestimmen Sie die prozentuale Wachstumshemmung.<ol>
<li>Sämlinge vorsichtig von 48-Well-Platten entfernen und trocknen, indem Sie auf Papiertuch dabben. Gewichten Sie Sämlinge auf einer analytischen Skala und zeichnen Sie Werte auf. Verwenden Sie, falls verfügbar, eine analyseskala mit USB-Ausgang, um neue Gewichtungswerte in einer Kalkulationstabelle aufzuzeichnen. Bevor Sie Sämlinge wiegen, nehmen Sie ein Foto auf, um die Wachstumshemmung visuell darzustellen (Abbildung 2C).</li>
		<li>Bestimmen Sie die prozentuale Wachstumshemmung von mit Elicitor behandelten Sämlingen im Vergleich zu Sämlingen, die nur in MS angebaut werden (Abbildung 2D), wie folgt: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq3.jpg">
</li>
		<li>Zeichnen Sie Daten mithilfe eines Balkendiagramms mit Standardfehlerbalken oder mithilfe eines Box- und Whisker-Plots, um die interexperimentelle Varianz besser anzuzeigen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Dieses Papier beschreibt zwei Methoden zur Beurteilung von mustergesteuerten Immunantworten in Arabidopsis, die quantitative Ansätze zur Bewertung der Immunleistung ohne den Einsatz spezieller Geräte anbieten. In Kombination können mustergesteuerte ROS und SGI verwendet werden, um frühe bzw. späte Reaktionen auf die Mikrobenwahrnehmung zu bewerten.
Die Hauptbeschränkung des oxidativen Burst-Assays ist die Variabilität. Aus Gründen, die nicht vollständig verstanden werden, unterscheide...

Um Krankheitserreger wahrzunehmen und zu verteidigen, haben Pflanzen membrangebundene Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) entwickelt, die konservierte mikrobielle Moleküle außerhalb der Zelle detektieren, die als mikrobenassoziierte molekulare Muster (MAMPs) bekannt sind1. Die Bindung von MAMPs an ihre kognaatierten PRRs initiiert proteinkinasevermittelte Immunsignalisierung, was zu einer Breitspektrum-Krankheitsresistenz2führt. Eine der frühesten Reaktionen nach der PRR-Aktivierung ist die Phosphorylierung und Aktivierung von integralen Plasmamembran-RESPIRATORY-BURST-OXIDASE-HOMOLOG(RBOH)-Proteinen, die die Produktion extrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) katalysieren 3 , 4. ROS spielen eine wichtige Rolle bei der Etablierung von Krankheitsresistenz, sowohl als sekundäre Botenstoffe zur Verbreitung von Immunsignalisierung als auch als direkte antimikrobielle Wirkstoffe5. Die erste Beobachtung eines immunentlösten oxidativen Bursts wurde mit Kartoffelknollen von cv. Rishiri nach Phytophthora infestans Inokulation6beschrieben. Die ROS-Produktion wurde in mehreren Pflanzenarten mit Blattscheiben7, Zellsuspensionskulturen8und Protoplasten6. Beschrieben hier ist eine einfache Methode für die Assaying Muster-ausgelöste ROS-Produktion in Blattscheiben von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Als Reaktion auf die MAMP-Wahrnehmung katalysieren aktivierte RBOH-Proteine die Produktion von Superoxid-Radikalen (O2-), Hydroxylradikalen (•OH) und Singlet-Sauerstoff (1O2 ), die in Wasserstoffperoxid umgewandelt werden (H2 O 2) im extrazellulären Raum9. H2O2 kann durch Luminol-basierte Chemilumineszenz in Gegenwart des Oxidationsmittels Meerrettichperoxidase (HRP)10quantifiziert werden. HRP oxidiertH2O2 und erzeugt ein Hydroxid-Ion (OH) und Sauerstoffgas (O2 ), die mit Luminol reagieren, um ein instabiles Zwischenprodukt zu erzeugen, das ein Photon von Licht10freisetzt. Photonenemission kann als relative Lichteinheiten (RLUs) mit einem Mikroplattenleser oder Imager quantifiziert werden, der in der Lage ist, Lumineszenz zu erkennen, die in den meisten molekularen Laboratorien zu Standardgeräten geworden sind. Durch die Messung des Lichts, das über ein 40-60-Minuten-Intervall erzeugt wird, kann ein transienter oxidativer Ausbruch bereits 2-5 Minuten nach der Behandlung des Entauslöserers erkannt werden, der bei 10-20 Minuten seinen Höhepunkt erreicht und nach 60 Minuten11auf basale Werte zurückkehrt. Das kumulative Licht, das in diesem Zeitverlauf erzeugt wird, kann als Maß für die Immunstärke verwendet werden, das der Aktivierung von RBOH-Proteinen12entspricht. Praktischerweise erfordert dieser Test keine spezielle Ausrüstung oder umständliche Probenvorbereitung.
Kurz nach dem MAMP-Nachweis gilt der oxidative Ausbruch als frühe Immunantwort, zusammen mit der MAPK-Aktivierung und der Ethylenproduktion5. Spätere Immunantworten sind Transkriptionsreprogrammierung, stomataler Verschluss und Calloseablagerung2,5. Eine längere Exposition gegenüber MAMPs aktiviert kontinuierlich energetisch-kostenintensive Immunsignale, was zur Hemmung des Pflanzenwachstums führt, was auf einen Kompromiss zwischen Entwicklung und Immunität13hindeutet. Musterausgelöste Sättlingswachstumshemmung (SGI) wird häufig zur Beurteilung der Immunleistung bei Arabidopsis verwendet und war integraler Bestandteil der Identifizierung mehrerer Schlüsselkomponenten der Immunsignalisierung, einschließlich PRRs14,15 ,16. Daher präsentiert dieses Papier zusätzlich einen Test für musterausgelöste SGI in Arabidopsis, wobei Sämlinge in Multi-Well-Platten angebaut werden, die Standardmedien oder Medien enthalten, die 8-12 Tage lang mit einem Immunenteliciter ergänzt und dann gewogen werden. mit einer analytischen Skala.
Um zu demonstrieren, wie ROS- und SGI-Assays zur Überwachung der PRR-vermittelten Signalisierung verwendet werden können, wurden drei Genotypen ausgewählt, die unterschiedliche Immunausgänge darstellen: (1) der wilde Typ Arabidopsis Beitritt Columbia (Col-0), (2) der dominant-negative Bak1-5 Mutant, bei dem der multifunktionale PRR-Co-Rezeptor BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) bei der Immunsignalisierung17,18und (3) dem rezessiven cpk28-1 Mutanten, dem die CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) und zeigt erhöhte immunausgelöste Reaktionen19,20. ROS- und SGI-Assays werden als Reaktion auf ein synthetisch hergestelltes elf18-Peptid-Epitop des bakteriellen Dehnungsfaktors Tu (EF-Tu) vorgestellt, das in Arabidopsis vom PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15anerkannt wird. Diese Protokolle können mit anderen Immunentfernern wie dem bakteriellen Motilitätsprotein Flagellin14 oder endogenen Pflanzenelicitor-Proteinen (AtPeps)16verwendet werden, es sollte jedoch beachtet werden, dass die Reaktionsfähigkeit der Pflanzen je nach Elicitor21. Zusammen können ROS- und SGI-Assays für die schnelle und quantitative Bewertung früher und später PRR-vermittelter Reaktionen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>20-20-20 Dünger</td><td>Pflanzenprod</td><td>10529</td><td>1 g/l in Wasser mischen und alle 2 Wochen auf die Pflanzen auftragen, um ein optimales Wachstum zu erzielen.</td></tr><tr><td>4 mm Biopsie-Stanze</td><td>Medical Mart</td><td>232-33-34-P</td><td>Es kann auch ein Korkbohrer-Set mit einer Auflagefläche von 0,125 cm^2 verwendet werden.</td></tr><tr><td>Sterile 48-Well-Platten mit Deckel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3548</td><td></td></tr><tr><td>Analysenwaage mit Draft Sheid</td><td>VWR</td><td>VWR-225AC</td> Jede <td>Standard-Analysewaage kann für Wachstumsinibitionsassays verwendet werden, eine direkte Computerausgabe ist jedoch optimal.</td></tr><tr><td>BioHit mLine Mechanical 12 Mehrkanalpipette (30-300 μl)</td><td>Sartorius</td><td>725240</td><td>Jede Mehrkanalpipette kann verwendet werden, bei Bedarf auch eine einzelne Pipette.</td></tr><tr><td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td><td>EZ Biolab</td><td>cp7211</td><td>Lagern Sie 10 mM Stammpeptid bei -80C in Röhrchen mit geringer Proteinbindung. Nach dem Auftauen 100 μM Arbeitsmaterial bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6782</td><td>In reinem Wasser auflösen. Bei -20 °C und lichtgeschützt lagern.</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>In DMSO auflösen. Bei -20 °C und lichtgeschützt lagern.</td></tr><tr><td>Murisage und Skoog Basalsalze</td><td>Cedarlane Labs</td><td>MSP09-100LT</td><td>bei 4C lagern.</td></tr><tr><td>Erde</td><td>SunGrow Horticulture</td><td>Sunshine Mix #1</td><td>Für den Anbau von Arabidopsis können auch andere Bodenarten verwendet werden. Beim Befüllen der Töpfe mit Wasser mischen.</td></tr><tr><td>SpectraMax Paradigm Multi-Mode-Mikroplatten-Reader mit LUM-Modul</td><td>Molekulare Geräte</td><td>Muss ein Angebot anfordern</td><td>Für diese Assays kann jeder Platten-Reader verwendet werden, der Lumineszenz nachweisen kann.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-1KG</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>96-Well-Platten aus weißem Polystyrol</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-589</td><td></td></tr></tbody></table>

muster-triggered oxidative burst und seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pflanzen haben ein robustes Immunsystem entwickelt, um Krankheitserreger wahrzunehmen und vor Krankheiten zu schützen. Dieses Papier beschreibt zwei Assays, die verwendet werden können, um die Stärke der Immunaktivierung in Arabidopsis thaliana nach der Behandlung mit Elicitor-Molekülen zu messen. Präsentiert zuerst ist eine Methode zur Erfassung der schnell induzierten und dynamischen oxidativen Burst, die mit einem Luminol-basierten Assay überwacht werden kann. Präsentiert zweite ist eine Methode, die beschreibt, wie immuninduzierte Hemmung des Sämlingswachstums zu messen. Diese Protokolle sind schnell und zuverlässig, erfordern keine spezielle Ausbildung oder Ausrüstung und sind weit verbreitet, um die genetische Grundlage der Pflanzenimmunität zu verstehen.

Mutant cpk28-119,25 und bak1-517,18 Pflanzen wurden verwendet, um erwartete Ergebnisse für Genotypen mit hohen und niedrigen Immunantworten zu demonstrieren, bzw. in oxidativen Burst und SGI Tests relativ zu einem Wildtyp-Hintergrundsteuerelement (Col-0). Zur Beurteilung dosisabhängiger Wirkungen wurde eine 10-fache Peptidverdünnungsreihe (1-1.000 nM) von...

Dieses Papier beschreibt zwei Methoden zur Quantifizierung von Abwehrreaktionen in Arabidopsis thaliana nach der Exposition gegenüber Immunentfernern: der vorübergehende oxidative Ausbruch und die Hemmung des Sämlingwachstums.

Muster-Triggered Oxidative Burst und Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Diese Assays können verwendet werden, um Immunleistungen verschiedener Pflanzengenotypen zu bewerten und zu vergleichen. Der Hauptvorteil dieser Techniken ist, dass sie schnell, zuverlässig sind und gängige Laborgeräte verwenden. Für den Wachstumshemmungstest sollten Sämlinge gleicher Größe und Alter transplantiert und vor dem Wiegen vollständig ausgeschmiert werden, um die Variation zu begrenzen.Nach vier bis fünf Wochen nach der Keimung, verwenden Sie einen scharfen Vier-Millimeter-Biopsie-Punch, um eine Blattscheibe pro Arabidopsis Pflanze zu entfernen, den Mittelvenen zu vermeiden und vorsichtig zu sein, die Verwundung zu begrenzen. Sammeln Sie die Scheiben in einzelne Brunnen einer ungenutzten 96-Well-Luminometer-Platte mit 100 Mikroliter doppeldestilliertem Wasser pro Brunnen, adaxiale Seite nach oben, um austrocknung zu verhindern. Wenn Sie mehrere Entferner bewerten, entfernen Sie für jede Elicitor-Behandlung eine zweite Blattscheibe aus demselben Blatt und bedecken Sie die Platte mit dem Deckel, damit sich die Blattscheiben über Nacht bei Raumtemperatur erholen können.Am nächsten Morgen stellen Sie die Mikroplattenleserparameter in Zwei-Minuten-Intervallen über einen Zeitraum von 40 bis 60 Minuten auf eine Integrationszeit von 1.000 Millisekunden ein, um den dynamischen oxidativen Ausbruch zu erfassen. Als nächstes verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um das Wasser in jedem Brunnen durch 100 Mikroliter frisch vorbereiteter Reaktionslösung zu ersetzen, einschließlich einer Kontrolle, keine Entsendereaktion für jeden Genotyp, um den Gehalt an Basalreaktionssauerstoffspezies in Ermangelung von Auslösung zu bewerten. Messen Sie dann sofort die Lichtemission für alle Wellenlängen im sichtbaren Spektrum auf dem Mikroplattenleser.An vier Tagen nach der Keimung, laden Sie jeden Brunnen einer 48-Well-Platte mit 500 Mikroliter MS Medium mit einer Verdünnung von Elicitor Peptid ergänzt. Als nächstes verwenden Sie sterile Zangen, um sorgfältig sechs bis acht Sämlinge der gleichen Größe, des gleichen Alters und des gleichen Genotyps in jede Peptidverdünnung zu transplantieren, wobei darauf zu achten ist, dass der Sämling oder Bruch der Wurzel nicht beschädigt wird und dass die Wurzel in medium getaucht wird. Wenn alle Sämlinge plattiert sind, versiegeln Sie die Platten mit Micropore-Band und stellen Sie die Pflanzen acht bis zwölf Tage lang unter Standard-Kurztagsbedingungen.Um die prozentuale Wachstumshemmung zu bestimmen, nehmen Sie ein Foto auf, um die Wachstumshemmung visuell aufzuzeichnen, bevor Sie die Sämlinge vorsichtig aus jedem Brunnen entfernen. Dann die Wurzeln auf einem Papiertuch zum Trocknen abwerfen und jeden Sämling auf analytischer Skala wiegen. In diesem repräsentativen Experiment zeigten mutierte Pflanzen mit hyperaktiver Immunsignalisierung einen höheren kumulativen und durchschnittlichen oxidativen Ausbruch im Vergleich zu Wildtyp-Arabidopsis-Pflanzen, während mutierte Pflanzen mit eingeschränkter Immunsignalisierung einen reduzierten oxidativen Ausbruch in Konzentrationen zwischen 10 und 1 000 Nanomolar zeigten.Erwartete Unterschiede in der Setzlingswachstumshemmung konnten auch zwischen allen Genotypen erkennbar sein, die in 100 und 1.000 nanomolaren Auslaugenden Peptidkonzentrationen angebaut werden. Bei der Verdünnung von 1 000 nanomolaren Peptidverdünnungen waren die Mutanten mit hyperaktiver Immunsignalisierung deutlich kleiner als Wildpflanzen, die unter den gleichen Bedingungen angebaut wurden, während die Mutanten mit eingeschränkter Immunsignalisierung eine schwache Wachstumshemmung im Vergleich zu Wildpflanzen zeigten. Diese Methoden liefern Hinweise auf frühe und späte Immunreaktionen.Mehrere andere Techniken, einschließlich MAP-Kinase-Assays, pathogen-induzierte Genexpression und Infektionstests, können verwendet werden, um diese Wege abzuleiten. Diese Techniken wurden für den Einsatz in Großbildschirmen modifiziert, die erfolgreich Pathogenrezeptorproteine und mehrere andere Signalkomponenten identifiziert haben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein Zelltod-basierter Assay für PTI in Nicotiana benthamiana Pflanzen beschrieben.

Assay für Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Pflanzen

Eine grundlegende Aufgabe in der Zellbiologie ist es, die Mechanismen, die die Identität der Organellen, die eukaryotischen Zellen machen zu Grunde liegen zu definieren. Hier schlagen wir eine Methode, um die Gene verantwortlich für die morphologische und funktionelle Integrität der Anlage Organellen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Next-Generation-Sequencing-Tools zu identifizieren.

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

Dieses Video zeigt einen Assay zur Messung des oxidativen Ausbruchs in Arabidopsis-Blättern nach Immunauslösung. Blattscheiben, die aus Pflanzenblättern geschnitten werden, werden mit bakteriellen Peptiden inkubiert, die als mikrobenassoziierte molekulare Muster oder MAMPs fungieren. Nach dem Nachweis der MAMPs induzieren Pflanzenzellen die Produktion von extrazellulärem ROS, das mit Hilfe eines Chemilumineszenz-Assays nachgewiesen wird.

Ein Assay zum Nachweis von oxidativen Bursts in Arabidopsis-Blattscheiben nach Immunauslösung

Dieses Video zeigt den Assay zur Hemmung des Sämlingswachstums in der Pflanze Arabidopsis thaliana. Der Einfluss einer erhöhten Konzentration des Immunpeptid-Elicitors auf das Wachstum der Sämlinge wird bestimmt.

Messung der immuninduzierten Hemmung des Sämlingswachstums

Die Quantifizierung des Erregerwachstums ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung verschiedener Immunantworten von Arabidopsis thaliana (im Folgenden: Arabidopsis). Das hier beschriebene Verfahren stellt einen optimierten Spritzeninfiltrationsassay zur Quantifizierung der Pseudomonas syringae pv dar. Maculicola ES4326-Wachstum in adulten Arabidopsis-Blättern.

Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Das Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen der Bleichmittel und Chlor-Gas-Sterilisation auf die Keimung der Samen von einer Reihe von Arabidopsis Genotypen auf sterile Medien gewachsen zu bestimmen. Optimierte Sterilisation Protokolle wurden entwickelt, um das Wachstum von mikrobiellen Verunreinigungen gleichzeitig zufriedenstellend Samen überleben zu verhindern.

Standardisierte Methode für Hochdurchsatz-Sterilisation von Arabidopsis Samen

Ein Hochdurchsatzprotokoll für die Oberflächensterilisation von Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) -Samen wird bereitgestellt, das die Liquid-Handling-Schritte mit einer einfachen Absaugvorrichtung, die mit einer Vakuumpumpe konstruiert ist, optimiert. Hunderte von Samenproben können an einem Tag oberflächensterilisiert werden.

Hochdurchsatz-, robuste und hochzeitflexible Methode zur Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen

Hier beschreiben wir ein fortschrittliches Werkzeug zur Überwachung der Chlorophyllbiosynthese in den frühen Stadien der Arabidopsis-Keimlingsentetiolierung.   Die neuartige Methodik ermöglicht eine nicht-invasive Echtzeit-Chlorophyll-Fluoreszenz-Bildgebung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Nicht-invasiver Assay zur Bestimmung der Chlorophyll-Biosynthese-Kinetik in frühen Stadien der Arabidopsis-De-etiolation

Hier stellen wir eine einfache Methode zur direkten Beobachtung und automatisierten Messung der stomatären Reaktionen auf bakterielle Invasion in Arabidopsis thaliana vor. Diese Methode nutzt ein tragbares stomatales Bildgebungsgerät zusammen mit einer Bildanalyse-Pipeline, die für vom Gerät aufgenommene Blattbilder ausgelegt ist.

Direkte Beobachtung und automatisierte Messung der stomatalen Reaktionen auf Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 in Arabidopsis thaliana

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatzansatz zur Bewertung von Pflanzenionenleck, Peroxidaseaktivität und Callose-Produktion in derselben Probe.

Bewertung von Blattantworten auf mikrobielle Sekundärmetabolite mittels eines Hochdurchsatzformats

Lernen Sie zwei zuverlässige Assays zur Quantifizierung von Abwehrreaktionen in Arabidopsis thaliana: den transienten oxidativen Burst und die Hemmung des Sämlingswachstums. Diese Methoden ermöglichen schnelle Vergleiche verschiedener Genotypen.

Muster-Triggered Oxidative Burst und Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

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