Name: Verwendung von Deuteriumoxid als nicht-invasives, nicht-tödliches Werkzeug zur Beurteilung der Körperzusammensetzung und des Wasserverbrauchs bei Säugetieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Erfahren Sie die Deuteriumoxid-Verdünnungsmethode zur Bestimmung der Körperzusammensetzung und des Wasserverbrauchs bei Säugetieren. Diese nicht-invasive Technik ermöglicht präzise Messungen auch bei gefährdeten Wildtierarten.

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Diese Forschung wurde unterstützt durch MDC Cooperative Agreement (#416), US Forest Service Cooperative Agreement (16-JV-11242311-118), American Academy of Veterinary Nutrition und Waltham/Royal Canin, USA Grant (Grant-Nummer: 00049049), NIH-Ausbildungsstipendium (Grant-Nummer: T32OS011126) und das University of Missouri Veterinary Research Scholars Program. Die Autoren danken Shannon Ehlers für die Vorprüfung dieses Manuskripts. Wir danken Dr. Robert Backus für die Bereitstellung der D2O-Standards und die Nutzung seines Labors.

Alle hier beschriebenen Experimente wurden vom University of Missouri Animal Care and Use Committee genehmigt und im Rahmen der Wildlife Scientific Collection permit (Permit #16409 and #17649) des Missouri Department of Conservation (MDC) durchgeführt.
1. Herstellung einer sterilen, isotonischen, gesalzenenD2O Stofflösung
<ol><li>Machen Sie eine 50 ml Lagerlösung von 9,0 g/l gesalzen D2O.<ol>
<li>Wiegen Sie 450 mg pharmazeutische NaCl und übertragen Sie alle NaCl in ein 100 ml sterilisiertes Becherglas. Notieren Sie die genaue Anzahl von NaCl bis 4 Dezimalstellen im Labor-Notebook.</li>
		<li>Mit einem sterilen abgestuften Zylinder 50 g von 99,8 % Deuteriumoxid messen und auf das sterile Becherglas übertragen, das den NaCl enthält. Notieren Sie die genaue Menge an Deuteriumoxid auf 4 Dezimalstellen im Labor-Notebook oder Inseton.</li>
		<li>Filter 10 ml isosmotische Stärke NaCl (9,0 g/l) durch einen nicht-pyrogenen sterilen Scheibenfilter mit submikronporen (0,2 m).</li>
		<li>Befestigen Sie eine 20 G Nadel am nicht-pyrogenen sterilen Scheibenfilter mit submikronporen (0,2 m) mit einem 10 ml Spritzenfass. In das Septum einer 100 ml sterilen leeren Durchstechflasche einlegen.</li>
		<li>Befestigen Sie ein Vakuumrohr an einer 22 G Nadel und legen Sie die Nadel in das Septum der 100 ml sterilen leeren Durchstechflasche ein.</li>
		<li>10 ml der Lagerlösung in den Spritzenlauf gießen. Schalten Sie das Vakuum langsam ein, bis dieD2O-Lagerlösung langsam in die sterile Durchstechflasche zu filtern beginnt. Gießen Sie die D2O-Lagerlösung in den Spritzenlauf, bis alle 50 ml gefiltert sind. HINWEIS: Die Stammlösung muss je nach benötigter Dosis möglicherweise verdünnt oder konzentriert werden. Die Dosis vonD2O variiert je nach Art und Empfindlichkeit der Analysemethode. Bei Katzen wurde die Arbeitslösung verwendet, um eine Dosis von 0,7 g/kgD2O zu verabreichen. Die oben beschriebene Stammlösung minimiert die Menge der NaCl-Lösung, die subkutan für das Tier eingeführt wird, während sie dennoch eine genaue Messung der Dosis ermöglicht. Bei kleinen Säugetieren wie Fledermäusen muss diese Konzentration zu einer funktionierenden Lösung wie 0,1600 g/ml verdünnt werden. Mit dieser Konzentration kann die Dosis von 0,75 g/kgD2O genau gemessen und in ca. 100 l oder weniger NaCl-Lösung verabreicht werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Herstellung von steriler, isotonischer, entsalzterD2O Lagerarbeitslösung für Fledermäuse
<ol><li>Wiegen Sie eine 10 ml leere sterile Durchstechflasche und zeichnen Sie das Gewicht auf die nächsten 4 Dezimalstellen auf. Tare-Skala.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 1,0 ml Spritze, um 0,65 ml derD2O-Lagerlösung auf die geteerte, 10 ml leere sterile Durchstechflasche zu übertragen. Rekordgewicht von D2O bis 4 Dezimalstellen. Tare-Skala.</li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen von D2O in der 10 ml leeren Durchstechflasche. Verwenden Sie die folgende Gleichung. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq1.jpg"> wobei W ein gemessenes Gewicht und D die Dichte von 99,8%D2O (1,107 g/ml) ist.</li>
	<li>Verwenden Sie das berechnete Volumen und das bekannte Gewicht derD2O, um das Volumen der isotonischen Salin zu bestimmen, das erforderlich ist, um eine Arbeitslösung für 0,1600 g/ml herzustellen.</li>
	<li>In das Septum der 10 ml sterilen Durchstechflasche, der 22 G Nadel (am Vakuumröhrchen befestigt) einlegen. In das Septum der 10 ml sterilen Durchstechflasche, der 20 G Nadel (befestigt an einem 0,22 m Spritzenfilter mit einem 10 ml Spritzenfass).</li>
	<li>Gießen Sie die berechnete Masse/Volumen isotonischer NaCl in den Spritzenlauf und schalten Sie das Vakuum ein, um einen langsamen Tropf in die sterile 10 ml Durchstechflasche zu ermöglichen.</li>
	<li>Zeichnen Sie das Gewicht der Durchstechflasche auf und stellen Sie sicher, dass eine Arbeitslösung mit einem Wert von 0,1600 g/mL erstellt wird.</li>
</ol>3. Bestimmung der Körperzusammensetzung der großen braunen Fledermäuse (Eptesicus fucsus) mit D2O
HINWEIS: Die im Protokoll verwendete Lagerlösung VonD2O beträgt 0,1598 g/ml. Vor der Blutentnahme stellen Sie sicher, dass die Entfernung von bis zu 200 L Blut 10 % des gesamten Blutvolumens der Fledermaus beträgt und innerhalb der vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) festgelegten Richtlinien für die Blutentnahme liegt. Alle Tiere sollten gefastet oder Bauch gestreichelt werden, um einen leeren Magen zu gewährleisten. Eine kürzliche Mahlzeit könnte das Gewicht des Tieres verändern, was zu verwirrten Ergebnissen führt, da Berechnungen zur Bestimmung des Körperfetts auf der Körpermasse des Tieres beruhen.
<ol><li>Anästhetisieren Sie eine große braune Fledermaus.<ol>
<li>Verwenden Sie 5,0% Isofluran zur Induktion. Halten Sie eine stabile Anästhesieebene mit 0,5% bis 3,0% Isofluran.</li>
		<li>Bestimmen Sie die richtige Anästhesietiefe, indem Sie den Pedalentzugsreflex testen (die Zehen der Fledermaus kneifen). Die Fledermaus sollte nicht auf das Gefühl reagieren und die Atemfrequenz sollte langsam und stabil bleiben. Stellen Sie Isofluran nach Bedarf ein, um eine stabile Anästhesieebene aufrechtzuerhalten.</li>
		<li>Rekord-Isofluran-Spiegel, Herzfrequenz, Atemfrequenz, und andere Informationen, wie von IACUC gefordert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiegen Sie die große braune Fledermaus und notieren Sie das Gewicht auf 4 Dezimalstellen.</li>
	<li>Das Uropatagium (Schwanzmembran) über der zwischenmenschlichen Vene mit einem Alkohol-Prep-Pad reinigen und trocknen lassen. Tragen Sie eine dünne Schicht Petroleumgelee über die zwischenmenschliche Vene auf.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 29 G Nadel, um den dorsalen Teil der interfemoralen Vene zu durchstechen und 100 l Blut mit Kunststoff-Natriumheparinkapillarröhren zu sammeln. Sorgen Sie für eine ausreichende Vermischung des Vollblutes mit dem Natriumheparin, indem Sie jedes Rohr nach der Entnahme sanft rollen und das Rohr beschriften.</li>
	<li>Mit einer DXA-Maschine für kleine Säugetiere kalibriert, erhalten sie drei DXA-Scans der Fledermaus10.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Masse (in g) vonD2O zu injizieren, indem Sie das Fledermausgewicht in kg mit derD2O-Dosis von 0,75 g/kg multiplizieren. Bestimmen Sie das Volumen derberechneten D2O-Dosis (V), indem Sie das Gewicht derD2O-Dosis durch die Konzentration der Arbeitslösung dividiert. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq3.jpg">
</li>
	<li>Verwenden Sie eine Insulinspritze mit einer 29 G Nadel, die angebracht ist, um das berechnete Volumen vonD2O zu erstellen. Wiegen Sie dieD2O, Insulinspritze und Nadel. Auf 4 Dezimalstellen aufzeichnen.</li>
	<li>Injizieren Sie die D2O subkutan über die dorsale Hüftregion der anästhesierten Fledermaus.</li>
	<li>Lassen Sie Fledermaus von Anästhesie erholen und die Zeit der Injektion aufzeichnen.</li>
	<li>Unmittelbar nach der Injektion die nun leere Insulinspritze mit der 29 G Nadel abwägen. Zeichnen Sie die Gewichtung auf 4 Dezimalstellen auf.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Dosis vonD2O injiziert, indem Sie das Gewicht der Insulinspritze nach der Injektion von der Vorinjektions-D2 O gefüllten Insulinspritze subtrahieren. Auf 4 Dezimalstellen aufzeichnen.</li>
	<li>Innerhalb von 30 min nach der Blutentnahme verwenden Sie eine Hämatokritzentrifuge, um jedes Kapillarrohr für 5 min zu spinnen. Wenn die Hämatokritzentrifuge mehrere Geschwindigkeiten zulässt, stellen Sie 10.000 x gein.</li>
	<li>Verwenden Sie eine scharfe Schere, um das Kunststoffkapillarrohr zwischen Vollblut und Plasma zu schneiden. Verwenden Sie eine 200-L-Pipette, um das Plasma direkt in ein beschriftetes, 500-L-Speicherrohr zu vertreiben.</li>
	<li>Nach der Ausgleichsperiode, sammeln Sie weitere 100 L Blut aus der zwischenfmoralen Vene. HINWEIS: Die Ausgleichsperiode variiert je nach Art und wenn die Fledermäuse in Torpor gehen. Für große braune Fledermäuse, in der Regel 2 h ist ausreichend für die Gleichgewichtszeit.</li>
	<li>Trennen Sie Plasma in ein zweites markiertes, 500 L Mikrozentrifugen-Schrauben-Oberrohr, indem Sie Schritt 3.13 wiederholen. Proben bei -20 °C oder kälter bis zur Analyse lagern.</li>
</ol>4. Fourier-Transform-Infrarot-Spektrophotometrie-Analyse
<ol><li>Stellen Sie die Temperatur eines Sandbades auf 60 °C ein, um die Destillation zu erleichtern (die Trennung von Wasser und D2O von anderen Blutbestandteilen zu ermöglichen).</li>
	<li>Pipette 50 l jeder Plasmaprobe und Standard auf die Innenseite einer 1,5 ml konischen mikrozentrifugenrohren Kappe. Einschließlich Normen, die bekannte Konzentrationen vonD2O als Qualitätskontrolle enthalten. HINWEIS: Idealerweise hat jedes Tier drei Wiederholungen pro Probe und den Durchschnitt der drei gemeldeten Replikationen. Aufgrund des begrenzten Probenvolumens und des Probenvolumens, das für die von den Autoren verwendeten FT-IR-Geräte benötigt wird, wurden keine Wiederholungen für die Fledermausproben durchgeführt. Wenn eine Probe weniger als 50 l Plasma enthält, pipette die Probenmenge auf die konische Mikrozentrifugenrohrkappe und zeichnet das Volumen auf.</li>
	<li>Halten Sie die Mikrozentrifugenkappe auf den Kopf und schrauben Sie das 1,5 ml konische Mikrozentrifugenrohr auf die Kappe. Legen Sie das umgekehrte (umgedrehte) Rohr mit der Kappe mindestens 12 h (übernachtungsfrei) in Kontakt mit dem Sand in das Sandbad.</li>
	<li>Nach 12 h die Kappe entfernen und durch eine neue, saubere Kappe ersetzen. Pulsieren Sie das Mikrozentrifugenrohr für 10 s in einer Zentrifuge.</li>
	<li>Erstellen Sie folgende Normen: 0 ppm (0 mg D2O in 1 L destilliertem Wasser), 293 ppm (293 mg D2O in 1 L destilliertem Wasser), 585 ppm (585 mgD2O in 1 L destilliertes Wasser), 878 ppm (878 mg D2O in 1 L destilliertem Wasser) und 1170 ppm D2O (1170 mgD2O in 1 L destilliertem Wasser). HINWEIS: Die oben genannten Werte werden für eine Standardkurve vorgeschlagen. Alternative Werte wie 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm usw. können verwendet werden.</li>
	<li>Installieren Sie eine flüssige Übertragungszelle in das Fourier-transformierte Infrarotspektrophotometrie (FTIR) Spektrometer (Tabelle der Materialien). Füllen Sie die Zelle mit Methanol und verbinden Sie den Injektionsanschluss. Füllen Sie die Zelle langsam mit Hintergrundwasser, während Sie die Methanolspritze vorsichtig entfernen, um das Risiko von Luftblasen zu reduzieren. Schließen Sie Schläuche an den Ausgangsanschluss an, um das Entfernen der Proben nach der Analyse zu ermöglichen.</li>
	<li>Bereiten Sie die FTIR-Spektrometer-Software (Materialtabelle) für die Analyse von D2O in Wasser vor. Die Parametereinstellungen für die in diesem Protokoll verwendete Spektrometersoftware sind in Tabelle 1aufgeführt.</li>
	<li>Sammeln Sie eine Hintergrundprobe mit dem Verdünnungsmittel, 0,22 m-gefiltertem, destilliertem Wasser. Dabei sollte es sich um das gleiche Wasser handelt, das für die Normen verwendet wird.</li>
	<li>Injizieren Sie 40 l der 0 ppm D2O und nehmen Sie die Spektren auf. Speichern Sie die Spektren als CSV-Datei (CSV) (Comma separated Values).</li>
	<li>Setzen Sie die Injektion und Speicherung der Spektren aller Standards fort, um eine Standardkurve zu erstellen.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Hintergrund und die Standardkurve alle 60 bis 90 min.</li>
	<li>In jizieren Sie 40 l jeder destillierten Probe in die flüssigkeitsgebundene Übertragungszelle und speichern Sie die Spektren. HINWEIS: Ändern Sie das Injektionsvolumen der Normen und destillierten Proben basierend auf dem Volumen der flüssigen Übertragungszelle. Verwenden Sie eine flüssigkeitsübertragungszelle mit kleinerem Volumen, wenn das Probenvolumen unter 40 l liegt, oder verdünnen Sie 1:1 mit Hintergrunddestilliertem Wasser.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentration von D2O jeder Probe aus den FTIR-Spektren mit einem Tabellenkalkulationsprogramm, wie von Jennings et al.11 oder der Spektralsoftware beschrieben. Wenn Replikationen durchgeführt werden, verwenden Sie die durchschnittliche Konzentration, um die Körperzusammensetzung zu berechnen.</li>
</ol>5. Berechnung der Körperzusammensetzung
<ol><li>Konvertieren Sie die Deuteriumanreicherung (ppm) in Atomprozentkonzentration für jede Probe mit der folgenden Gleichung12: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq4.jpg"> wobei x die gemessene Deuteriumanreicherung (ppm) der Probe und 0,0001557 der im Wiener Standard Mean Ocean Water (VSMOW)13gemeldete Molanteil des Deuteriums ist.</li>
	<li>Berechnen Sie das Gesamtkörperwasser für jede Probe mit der folgenden Gleichung4,12,14: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq5.jpg">) wobei E die gemessene Anreicherung ist (Atom%) deuterium in der Probe nach Hintergrundkorrektur, B ist die Injektionsmasse in g, und 0,998 ist die Konzentration der injiziertenD2O. HINWEIS: Deuteriumaustausch mit labilem Wasserstoff verursacht eine 2% Überschätzung der gesamten Körperwassermasse. Das gesamte Körperwasser sollte korrigiert werden, indem die Gesamtgewichtschätzung der Körperwassermasse um 2 % des Körpergewichts verringert wird.</li>
	<li>Schätzen Sie die fettfreie Masse (schlanke Körpermasse und alle anderen nicht-Fett-Komponenten) jeder Fledermaus mit der folgenden Gleichung: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq6.jpg"> HINWEIS: Verwenden Sie den konventionell akzeptierten Wert von 0,732 für den fraktionierten Feuchtigkeitsgehalt der schlanken Körpermasse für gesunde, euhydrierte, nicht laktierende Fledermäuse. Der fraktionierte Feuchtigkeitsgehalt der fettfreien Masse kann sich in laktierenden großen Brauntönen auf Basis der postpartalen Woche15ändern. Für andere Arten verwenden Sie die in der Literatur veröffentlichten Werte oder bestimmen Sie den fraktionierten Feuchtigkeitsgehalt der mageren Körpermasse, bevor Sie Berechnungen der schlanken Körpermasse durchführen.</li>
	<li>Schätzen Sie die Körperfettmasse mit der folgenden Gleichung: <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq7.jpg">
</li>
	<li>Konvertieren Sie die Körperfettmasse in g in Prozent Körperfettmasse mit der folgenden Gleichung: <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq8.jpg">
</li>
</ol>6. Bestimmung der Wasserzusammensetzung in einem Fleischfresser (Felis catus, Hauskatze)
<ol><li>Bereiten Sie die Lagerlösung wie in Abschnitt 1 beschrieben vor.</li>
	<li>Wiegen Sie jede Katze auf die nächsten 3 Dezimalstellen und zeichnen Sie das Gewicht auf. Berechnen Sie die Dosis für jede Katze wie in Schritt 3.6 beschrieben mit einerD2O-Dosis von 0,70 g/kg.</li>
	<li>Bereiten Sie jede Dosis wie in den Schritten 3.7-3.8 beschrieben vor. mit einer 3 ml oder 5 ml Spritze mit einer 22 G Nadel anstelle einer Insulinspritze.</li>
	<li>Sammeln Sie 500 l Vollblut und verabreichen Sie anschließend subkutan die 0,7 g/kgD2O. Zentrifuge Vollblut bei 2.000 x g für 15 min und speichern Sie Plasma in 1,5 ml Mikrozentrifuge Schraube Top-Röhren bei -20°C bis zur Analyse.</li>
	<li>Sammeln Sie 500 l Vollblut 4 h nach der Injektion. Zentrifugieren Sie Vollblut bei 2.000 x g für 15 min und lagern Sie Plasma in 1,5 ml Mikrozentrifugen-Schraub-Top-Röhren bei -20 °C bis zur Analyse.</li>
	<li>Sammeln Sie 14 Tage nach der Injektion 500 L Vollblut. Zentrifugieren Sie Vollblut bei 2.000 x g für 15 min und lagern Sie Plasma in 1,5 ml Mikrozentrifugen-Schraub-Top-Röhren bei -20 °C bis zur Analyse. HINWEIS: Die Anzahl der Tage zwischen der Blutentnahme kann auf den experimentellen Bedürfnissen und der Zeit nach der Injektion basieren, in der D2O über den Hintergrundniveaus nachgewiesen werden kann. Vierzehn Tage war die Länge der diätetischen Behandlungsblöcke von Hooper et al.9.</li>
	<li>Führen Sie die FT-IR-Analyse gemäß Abschnitt 4 durch und berechnen Sie die Körperzusammensetzung gemäß Abschnitt 5 dieses Protokolls.</li>
	<li>Berechnen Sie den Wasserverbrauch in ml/Tag anhand der folgenden Gleichungen: <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq9.jpg"> <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq10.jpg"> <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq11.jpg"> wobei TBW Gesamtkörperwasser ist, sind die Anfangswerte D2O und EndD2O die in ppm in den Proben nach der InjektionD2O gemessenen Konzentrationen.</li>
</ol>

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<li>International Atomic Energy Agency. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Assessment+of+Body+Composition+and+Total+Energy+Expenditure+in+Humans+Using+Stable+Isotope+Techniques%22">Assessment of Body Composition and Total Energy Expenditure in Humans Using Stable Isotope Techniques</a>. , (2009).</li>
<li>International Atomic Energy Agency. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Introduction+to+Body+Composition+Assessment+Using+the+Deuterium+Dilution+Technique+with+Analysis+of+Saliva+Samples+by+Fourier+Transform+Infrared+Spectrometry%22">Introduction to Body Composition Assessment Using the Deuterium Dilution Technique with Analysis of Saliva Samples by Fourier Transform Infrared Spectrometry</a>. , (2011).</li>
<li>Shimamoto, H., Komiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Turnover+of+Body+Water+as+an+Indicator+of+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiological+Anthropology+and+Applied+Human+Science%22%5BJournal%5D)">The Turnover of Body Water as an Indicator of Health.</a> Journal of Physiological Anthropology and Applied Human Science. 19 (5), 207-212 (2000).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Verwendung von Deuteriumoxid zur Bestimmung von TBW wird seit den 1940erJahren 17 verwendet und wird beim Menschen und einer Vielzahl von Haus- und Wildtierarten4,6,7verwendet. Weitere zerstörungsfreie Techniken wurden entwickelt, darunter bioelektrische Impedanzanalyse (BIA), DXA und quantitative Magnetresonanz (QMR). Jede Methode hat Vor- und Nachteile, die vor der Auswahl einer bestimmten Methode z...

Körperzustands-Scoring-Systeme und Körperzustandsindizes sind gängige Techniken zur Beurteilung des Gesundheitszustands oder der Fitness einer Art1,2. Viele häusliche und zoologische Arten haben einzigartige Körperzustand Scoring (BCS) Systeme, die verwendet werden, um den Muskel eines Tieres und oberflächliches Fettgewebe3zu bewerten. Die BCS-Bewertung stützt sich jedoch auf den Bewerter, d. h., BCS ist eine objektive oder semiquantitative Messung, wenn sie von einem geschulten Bewerter bewertet wird. Bei Wildtierarten werden Körperzustandsindizes häufig anstelle von BCS verwendet und basieren auf einem Verhältnis von Körpermasse zu Körpergröße oder Körpermasse zu Unterarm2. Körperzustand Indizis werden oft durch die Auswirkungen der Nahrungssuche verwirrt und können durch Körpergröße sowie statistische und inferentialeProbleme4 verwirrt werden.
Eine Alternative zu Körperzustands-Scoring-Systemen und Körperzustandsindizes ist die Verwendung eines stabilen Isotops zur Bestimmung der Körperzusammensetzung. Ein häufig verwendetes stabiles Isotop ist Deuteriumoxid(D2O), eine nicht-radioaktive Form von Wasser, in dem die Wasserstoffatome Deuteriumisotope sind. Die in dieser Studie beschriebene Deuteriumoxid-Verdünnungsmethode kann eine nicht subjektive, quantitative und wiederholbare Technik sein, die zur Schätzung der Körperzusammensetzung beim Menschen5 und einer vielzahl n.S. 4,6,7verwendet wird. Diese Technik kann vorteilhaft für das Studium der Körperzusammensetzung in Wildtieren sein. Zum Beispiel kann es verwendet werden, um Längsänderungen in der Körperzusammensetzung zu bewerten, wie vor und nach einer Management-Aktion. Bei einigen Wildtierarten kann Deuteriumoxid jedoch den tatsächlichen Wassergehalt8überschätzen. Daher ist es bei der Anpassung der Technik für eine Art wichtig, die Methode zu validieren, indem die Deuteriumoxid-Methode mit der Schlachtkörperanalyse für nicht gefährdete Arten verglichen wird. Bei bedrohten und gefährdeten Arten sollte eine zerstörungsfreie Methode wie die duale Röntgenabsorptiometrie (DXA) als alternative Vergleichsmethode zur zerstörungsfreien Goldstandardmethode der vollständigen Schlachtkörperanalyse betrachtet werden.
Neben der Körperzusammensetzung kann dieD2O Verdünnungstechnik verwendet werden, um den Wasserverbrauch eines einzelnen Tieres9zu bestimmen. Diese einzigartige Anwendung von D2O kann nicht nur zur Beantwortung von Forschungsfragen verwendet werden, sondern kann auch für die Beurteilung des Wasserverbrauchs einzelner Tiere in großen sozialen Umgebungen nützlich sein.
Hier beschreiben wir die Anpassung der D2O Verdünnungstechnik zur Beurteilung der Körperzusammensetzung in einem Insektenfresser, großen braunen Fledermäusen (Eptesicus fuscus), und zur Beurteilung des Wasserverbrauchs in einem Fleischfresser, Katzen (Felis catis).

<table><tbody><tr><td>0,2 Mikron pyrogener Scheibenfilter</td><td>Argos Technologies</td><td>FN32S Nylon</td><td>, 30 mm Durchmesser, 0,22 μm, sterile</td></tr><tr><td>1,5 mL konische Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1415-9701</td><td>1,5 ml selbststehendes Mikrozentrifugenröhrchen, natur mit blauer Kappe</td></tr><tr><td>10 mL steriles Glasfläschchen für Injektion</td><td>Mountainside Medical Equipment</td><td>MS-SEV10</td><td>klare, sterile Glasinjektionseinheit</td></tr><tr><td>10-ml-Spritze</td><td>Becton Dickinson</td> 305219 <td>sterile 10-ml-Spritze einzeln verpackte</td><td></td></tr><tr><td>100-ml-Durchstechflasche aus sterilem Glas für die Injektion</td><td>Mountainside Medical Equipment</td><td>AL-SV10020</td><td>Injektionseinheit aus klarem, sterilem Glas</td></tr><tr><td>20-Gauge-Nadel</td><td>Exel</td><td>26417</td><td>Nadeln subkutanisch 20 g x 1" Kunststoffnabe (gelb) / normale Abschrägung</td></tr><tr><td>22-Gauge-Nadel</td><td>Exel</td><td>26411</td><td>Nadeln Injektion 22G x 1" Kunststoff Nabe (schwarz) / normal abgeschrägt</td></tr><tr><td>Deuteriumoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-25G</td><td>99,9 Atom % D</td></tr><tr><td>Isofluoran</td><td>Vetone</td><td>3060</td><td>Fluriso, Isofluran, USP</td></tr><tr><td>OMNIC Spectra Software</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>833-036200</td><td>FT-IR Standardsoftware</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Vaseline</td><td>305212311006</td><td>Vaseline, 100% reine Vaseline, originale, hautschützende</td></tr><tr><td>Kapillarröhrchen aus Kunststoff</td><td>Innovative Med Tech</td><td>100050</td><td>Natriumheparin-Antikoagulans, 50 &mu; L Kapazität, 30 mm Länge</td></tr><tr><td>Sealed Liquid Spectrophotometer SL-3 FTIR CAF2 Cell</td><td>International Crystal Laboratory</td><td>0005D-875</td><td>0,05 mm Weglänge</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>EMD Millipore</td><td>1.37017</td><td>geeignet für biopharmazeutische</td></tr><tr><td>Produktion Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Spektrometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269-169400</td><td>Auslaufmodell, neuere Modelle verfügbar</td></tr></tbody></table>

verwendung von deuteriumoxid als nicht-invasives, nicht-tödliches werkzeug zur beurteilung der körperzusammensetzung und des wasserverbrauchs bei säugetieren

Using Deuterium Oxide as a Non-Invasive, Non-Lethal Tool for Assessing Body Composition and Water Consumption in Mammals

Körperzustands-Scoring-Systeme und Körperzustandsindizes sind gängige Techniken zur Beurteilung des Gesundheitszustands oder der Fitness einer Art. Körperzustands-Scoring-Systeme sind evaluatorabhängig und haben das Potenzial, sehr subjektiv zu sein. Körperzustandsindizes können durch Futtersuche, die Auswirkungen des Körpergewichts sowie statistische und inferentiale Probleme verwirrt werden. Eine Alternative zu Körperzustands-Scoring-Systemen und Körperzustandsindizes ist die Verwendung eines stabilen Isotops wie Deuteriumoxid zur Bestimmung der Körperzusammensetzung. Die Deuteriumoxid-Verdünnungsmethode ist eine wiederholbare, quantitative Technik zur Schätzung der Körperzusammensetzung bei Menschen, Wildtieren und heimischen Arten. Zusätzlich kann die Deuteriumoxidverdünnungstechnik verwendet werden, um den Wasserverbrauch eines einzelnen Tieres zu bestimmen. Hier beschreiben wir die Anpassung der Deuteriumoxid-Verdünnungstechnik zur Beurteilung der Körperzusammensetzung bei großen braunen Fledermäusen (Eptesicus fuscus) und zur Beurteilung des Wasserverbrauchs bei Katzen (Felis catis).

Die Deuteriumoxid-Verdünnungstechnik kann verwendet werden, um die Körperzusammensetzung einer Vielzahl von Arten zu bewerten. Um die Anpassungsfähigkeit zu demonstrieren, berichten wir über den ersten Einsatz der Deuteriumoxid-Verdünnungstechnik bei einer nordamerikanischen insektenfressenden Fledermausart, Eptesicus fuscus, der großen braunen Fledermaus für repräsentative Ergebnisse. Ein Timing-Plateau wurde durch die Einnahme von Blutproben vor und nach D2O abgeschl...

Dieser Artikel beschreibt die Deuteriumoxid-Verdünnungstechnik bei zwei Säugetieren, einem Insektenfresser und Fleischfresser, um das gesamte Körperwasser, die magere Körpermasse, die Körperfettmasse und den Wasserverbrauch zu bestimmen.

Verwendung von Deuteriumoxid als nicht-invasives, nicht-tödliches Werkzeug zur Beurteilung der Körperzusammensetzung und des Wasserverbrauchs bei Säugetieren

Body condition scoring systems and body condition indices are common techniques used for assessing the health status or fitness of a species. Body ...

Mit diesem Protokoll kann Deuteriumoxid oder D2O, ein nicht radioaktives, stabiles Wasserisotopen, verwendet werden, um die Körperzusammensetzung und den Wasserverbrauch zu schätzen. Diese Technik ist nicht invasiv und kann daher zur Beurteilung der Körperzusammensetzung bei gefährdeten Arten sowie bei Menschen und Hausarten eingesetzt werden. Eine einzigartige Anwendung der Deuteriumoxid-Verdünnungstechnik ist die Fähigkeit, den Wasserverbrauch frei laufenden Wildtieren mit hohen Rückfangraten oder von sozial untergebrachten Tieren zu messen.Während Anästhesie nicht erforderlich ist, kann es für diejenigen, die nicht mit subkutanen Injektionen vertraut sind, einfacher sein, die Tiere zu beruhigen, bevor sie das Deuteriumoxid liefern. Das Verfahren mit Sarah Hooper und mir demonstrieren Amanda Eshelman und Ashley Cowan, Veterinärstudenten, und Alicia Roistacher, eine Studentin aus meinem Labor. Um eine 50-Milliliter-Stammlösung von neun Gramm pro Liter salinated Deuteriumoxid zu machen, wiegen Sie zuerst 450 Milligramm Natriumchlorid in pharmazeutischer Qualität und notieren die genaue Menge auf vier Dezimalstellen.Das gesamte Salz in ein sterilisiertes 100-Milliliter-Becherglas geben und 50 Gramm mehr als oder gleich 99,8% Deuteriumoxid in einem sterilen, abgestuften Zylinder messen. Erfassen Sie die genaue Menge an Deuteriumoxid auf vier Dezimalstellen, und übertragen Sie das Deuteriumoxid auf das sterile Becherglas von Natriumchlorid. Als nächstes befestigen Sie eine 20-Spur-Nadel an einem nichtpyrogenen, sterilen Scheibenfilter mit Submikronporen, die mit einem 10-Milliliter-Spritzenfass ausgestattet sind, und legen Sie die Nadel in das Septum einer sterilen, leeren 100-Milliliter-Durchstechflasche ein.Befestigen Sie ein Vakuumrohr an einer 22-Spur-Nadel, und legen Sie die Nadel in das Septum der 100-Milliliter-Durchstechflasche ein. Dann 10 Milliliter isosmotischestärke Natriumchlorid in den Spritzenlauf laden und langsam das Vakuum einschalten, bis die Deuteriumoxidlösung beginnt, langsam in die Durchstechflasche zu filtern. Gießen Sie die Deuteriumoxid-Lagerlösung weiter in den Spritzenlauf, bis das gesamte 50-Milliliter-Volumen gefiltert ist.Nachdem Sie eine fehlende Reaktion auf Zehenstiche in einer anästhesierten Fledermaus bestätigt haben, verwenden Sie ein Alkohol-Prep-Pad, um das Uropatagium über der zwischenmenschlichen Vene zu reinigen, und lassen Sie die desinfizierte Schwanzmembran trocknen. Tragen Sie eine dünne Schicht Petroleumgelee über die zwischenmenschliche Vene auf und verwenden Sie eine 29-Spur-Nadel, um den dorsalen Teil der interfemoralen Vene zu durchstechen. Verwenden Sie dann Kunststoff-Natriumheparin Kapillarrohre, um 100 Mikroliter Blut zu sammeln.Um eine ausreichende Vermischung des Vollblutes mit dem Natriumheparin zu gewährleisten, rollen Sie jede Tube nach der Blutentnahme vor der Etikettierung vorsichtig. Nach der Bestimmung der Masse des Deuteriumoxids in Gramm zu injizieren, laden Sie eine Insulinspritze mit einer 29-Spur-Nadel mit dem entsprechenden Volumen von Deuteriumoxid ausgestattet. Wiegen Sie die mit Deuterium beladene Insulinspritze und -nadel, indem Sie das Gewicht auf vier Dezimalstellen aufzeichnen, und injizieren Sie das gesamte Volumen von Deuteriumoxid subkutan über den dorsalen Hüftbereich der anästhesierten Fledermaus.Wir empfehlen, eine Präzisionsskala mit einem antistatischen Zugschild zu verwenden und sicherzustellen, dass er sich vor der Injektion am Kolben zurückzieht, um einen Unterdruck zu gewährleisten. Wägen Sie unmittelbar nach der Injektion die nun leere Insulinspritze und -nadel ab und notieren Sie das Gewicht auf vier Dezimalstellen. Verwenden Sie innerhalb von 30 Minuten nach der Blutentnahme eine Hämatokritzentrifuge, um jedes Kapillarrohr fünf Minuten lang bei 10.000 mal g zu drehen.Schneiden Sie mit einer scharfen Schere das Kunststoffkapillarrohr zwischen Vollblut und Plasma und verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um das Plasma direkt in ein markiertes 500-Mikroliter-Speicherrohr zu vertreiben. Sammeln und lagern Sie nach der Ausgleichsperiode weitere 100 Mikroliter Blut aus der interfemoralen Vene, wie gerade gezeigt. Für die FTIR-Spektrophotometrie-Analyse stellen Sie die Temperatur eines Sandbades auf 60 Grad Celsius ein, um die Destillation zu erleichtern, und fügen Sie 50 Mikroliter jeder Plasmaprobe und Standard in einzelne 1,5-Milliliter-konische Mikrozentrifugenkappen ein.Halten Sie die Mikrozentrifugenkappe auf den Kopf, schrauben Sie das 1,5-Milliliter-Konikonltorialrohr auf die Kappe und setzen Sie das invertierte Rohr mindestens 12 Stunden lang mit dem Sand im Sandbad in Kontakt. Legen Sie am nächsten Morgen eine neue, saubere Kappe auf jedes Rohr und pulsieren Sie die Mikrozentrifugenrohre für 10 Sekunden in einer Mikrozentrifuge. Installieren Sie eine flüssige Übertragungszelle in das FTIR-Spektrometer und füllen Sie die Zelle mit Methanol.Schließen Sie den Injektionsanschluss an und füllen Sie die Zelle langsam mit Hintergrundwasser, während Sie die Methanolspritze vorsichtig entfernen, um das Risiko von Luftblasen zu reduzieren. Schließen Sie Schläuche an den Ausgangsanschluss an, um die Entfernung der Proben nach der Analyse zu ermöglichen, und öffnen Sie die FTIR-Spektrometersoftware. Legen Sie die Parameter entsprechend der Tabelle fest, und sammeln Sie eine Hintergrundprobe mit dem Verdünnungsmittel, 0,22-Mikrometer-gefiltertem, destilliertem Wasser.Injizieren Sie 40 Mikroliter eines Null-Teile-Pro-Millionen-Deuteriumoxid-Standards, und erfassen und speichern Sie die Spektren als durch Kommas getrennte Wertedatei. Nach dem Einspritzen und Speichern der Spektren aller Standards, um eine Standardkurve zu erstellen, injizieren Sie 40 Mikroliter jeder destillierten Probe in die flüssige Übertragungszelle und speichern Sie die Spektren. Mit einer bekannten Ausgleichszeit können das gesamte Körperwasser, die schlanke Körpermasse und die Körperfettmasse für wild gefangene große braune Fledermäuse und gefangene große braune Fledermäuse bestimmt werden.Eine negative Körperfettmasse kann aufgrund eines oder mehrerer der folgenden Gründe berechnet werden: nicht die gesamte Dosis von Deuteriumoxid erhalten, während der Gleichgewichtsphase torpid werden, ungewöhnlich große Fettmassen und minimale magere Massen haben oder weniger als drei bis 5% Körperfett haben, wie durch duale Röntgenabsorptiometrie bestimmt. Hierwird wird ein repräsentativer Anteil an Körperfett gezeigt, der durch die Deuteriumoxid-Verdünnungstechnik im Vergleich zur dualen Röntgenabsorptiometrie bestimmt wird. Die beiden Techniken sind gut korreliert, mit der Körperfettmasse zeigt starke Korrelationen zwischen dem Körperfett und Körpergewicht und mit der Deuterium Oxid Verdünnung Technik nicht konsequent über oder unterschätzen die Körperfettmasse.Die Deuteriumoxid-Verdünnungsmethode wurde zuvor bei Katzen validiert, und die Technik wurde angepasst, um die Messung des täglichen Wasserverbrauchs von sozial untergebrachten Katzen während jedes Ernährungsblocks des Experiments zu ermöglichen. Denken Sie daran, dass diese Technik nur an gesunden Tieren durchgeführt werden sollte und dass Sie genau wiegen, aufzeichnen und die volle Dosis Deuteriumoxid an jedes Tier liefern sollten. Zur Validierung der Deuteriumoxid-Technik kann eine sekundäre Methode zur Bestimmung der Körperzusammensetzung, wie z. B. eine vollständige Schlachtkörperanalyse oder DEXA, abgeschlossen werden.Diese Technik ermöglichte es uns, eine sozial untergebrachte Katze zu identifizieren, die ungewöhnlich hohe Mengen Wasser verbrauchte, ohne jede Katze zu trennen, um ihren Wasserverbrauch zu messen.

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Research

Forschung

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Umwelt

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Segmentierung und Messung von FAT-Volumes in Murine Obesity Modellen mithilfe von Röntgen-Computertomographie

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Erfahren Sie die Deuteriumoxid-Verdünnungsmethode zur Bestimmung der Körperzusammensetzung und des Wasserverbrauchs bei Säugetieren. Diese nicht-invasive Technik ermöglicht präzise Messungen auch bei gefährdeten Wildtierarten.

Verwendung von Deuteriumoxid als nicht-invasives, nicht-tödliches Werkzeug zur Beurteilung der Körperzusammensetzung und des Wasserverbrauchs bei Säugetieren (Video) | JoVE Journal

Verwendung von Deuteriumoxid als nicht-invasives, nicht-tödliches Werkzeug zur Beurteilung der Körperzusammensetzung und des Wasserverbrauchs bei Säugetieren

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