Name: Verbesserung der Transplantation von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten über eine transiente Hemmung der Rho Kinase Aktivität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Erfahren Sie, wie die vorübergehende Hemmung der Rho-Kinase-Aktivität die Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten im Maus-Myokardinfarkt-Modell verbessert. Diese Methode steigert die Zelladhäsion und das Überleben.

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Die Autoren danken Dr. Joseph C. Wu (Stanford University) für die freundliche Bereitstellung des Fluc-GFP-Konstrukts und Dr. Yanwen Liu für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Studie wird von den National Institutes of Health RO1 Grants HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (zu J.Z.) und HL121206A1 (zu L.Z.) und einem R56-Stipendium HL142627 (zu W.Z.) unterstützt, einem American Heart Scientist 16SDG30410018 und die University of Alabama at Birmingham Faculty Development Grant (zu W.Z.).

Alle tierischen Verfahren in dieser Studie wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Alabama in Birmingham genehmigt und basierten auf den National Institutes of Health Laboratory Animal Care and Use Guidelines (NIH Publication No 85-23).
1. Vorbereitung von Kulturmedien und Kulturtafeln
<ol><li>
Mittlere Vorbereitung
	<ol>
<li>Für hiPSC medium 400 ml humane pluripotente Stammzelle (hPSC) Basalmedium (Materialtabelle 1) und 100 ml hPSC 5x Ergänzung mischen; lagern Sie die Mischung bei 4 °C.</li>
		<li>Für RPMI 1640/B27 minus Insulin (RB-) Medium, mischen 500 ml RPMI 1640 und 10 ml B27 Ergänzung minus Insulin.</li>
		<li>Für RPMI 1640/B27 (RB+) medium 500 ml RPMI 1640, 10 ml B27-Ergänzung und 5 ml Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)-Antibiotikum mischen.</li>
		<li>Zur Reinigung medium16mischen 500 ml glukosefreie RPMI 1640, 10 ml B27-Ergänzung, 5 ml Pen-Strep-Antibiotikum und 1.000 l Natrium-DL-Laktatlösung (bei einer Endkonzentration von 4 mM).</li>
		<li>Zur Neutralisierung der Lösung 200 ml RPMI 1640, 50 ml fetales Rinderserum (FBS), 2,5 ml Pen-Strep-Antibiotikum und 50 l Y-27632 (bei einer Endkonzentration von 10 m) mischen.</li>
		<li>Für Gefriermedium 9 ml FBS, 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) und 10 l Y-27632 (bei einer Endkonzentration von 10 m) mischen.</li>
		<li>Bei extrazellulärer Matrixlösung (EMS) tauen konzentrierte extrazelluläre Matrix (Materialtabelle 1) bei 4 °C, bis sie einen gleichmäßig endenden Flüssigkeitszustand erreicht hat. Vorkühl-Pipettenspitzen und -rohre vor der Herstellung von Matrix-Aliquots von je 350 L auf Eis und lagern Sie die Aliquots bei -20 °C. Vor dem Beschichten der Platten ein aufgetautes Aliquot in 24 ml eiskaltes DMEM/F12 Medium (EMS) verdünnen; das EMS bis zu 2 Wochen in 4 °C halten. HINWEIS: Führen Sie alle Beschichtungsschritte auf Eis durch, um eine Erstarrung der Kellermembranmatrix zu verhindern.</li>
		<li>Für Die Tyrodes Lösung 90% des letzten erforderlichen Volumens von Gewebekultur-Wasser nehmen, die entsprechende Menge der folgenden Reagenzien hinzufügen und rühren, bis sie gelöst sind. Verwenden Sie dann 1 N NaOH, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen. Fügen Sie zusätzliches Wasser zu einer Endkonzentration von 140 mmol/L Natriumchlorid, 1 mmol/L Magnesiumchlorid, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L Kaliumchlorid, 10 mmol/L Glukose und 1,8 mmol/L Calciumchlorid hinzu. Sterilisieren Sie durch Filtration mit einer 0,22 m Membran.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zellkulturplattenbeschichtung
	<ol>
<li>Für hiPSC-Kulturplatten 1 ml EMS auf jeden Brunnen einer 6-Well-Platte auftragen und die Platte mindestens 1 h bei 37 °C bebrüten. Aspirieren DMEM/F12 Lösung vor der Aussaat von Zellen.</li>
		<li>Für die Gelatinebeschichtung 0,2 g Gelatinepulver in Gewebekultur-Wasser auflösen, um eine 0,2% (w/v) Lösung zu bilden. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren bei 121 °C, 15 psi für 30 min. Beschichten Sie jeden Brunnen einer 6-Well-Platte mit 2 ml der Lösung und inkubieren Sie für 1 h bei 37 °C. Vor dem Passieren der Zellen, aspirieren Sie die Lösung und lassen Sie die Platte für mindestens 1 h bei Raumtemperatur in der Gewebekultur Haube trocknen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hiPSC Wartung und Cardiomyozyten Ddifferentiation
<ol><li>Kultur die hiPSCs in hiPSC medium (siehe Schritt 1.1.1) mit einer täglichen mittleren Veränderung, bis die Zellen 80%–90% Zusammenfluss pro Brunnen erreichen. HINWEIS: Für Wartungszwecke sind hiPSCs in der Regel alle 4 Tage für die Durchreise bereit.</li>
	<li>Um hiPSCs zu durchziehen, das Medium ansaugen und den Brunnen 1x mit 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS) waschen. Fügen Sie 0,5 ml Stammzellablösung (Tabelle der Materialien 1) zu jedem Brunnen hinzu und brüten bei 37 °C für 5–7 min. HINWEIS: Die Inkubationszeit hängt von der Dichte der Zellen und der Dissoziationsrate ab, die unter dem Mikroskop beobachtet werden kann.</li>
	<li>Neutralisieren Sie die Stammzellablösung mit 1 ml HiPSC-Medium, ergänzt mit 5 'M Y-27632. Sammeln Sie das Gemisch in einem 15 ml Zentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie das Rohr für 5 min bei 200 x g, aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, und setzen Sie dann die Zellen in 1 ml HiPSC-Medium mit 5 'M Y-27632 wieder auf.</li>
	<li>Säen Sie die hiPSCs auf eine neue EMS-beschichtete 6-Well-Platte im Verhältnis zwischen 1:6 und 1:18. Ändern Sie das Medium auf hiPSC Medium ohne Y27632 nach 24 h.</li>
	<li>Um die Zellen einzufrieren, setzen Sie die dissoziierten HiPSCs im Gefriermedium in einer Konzentration von 0,5–1 Mio. l wieder aus, legen Sie die Suspension in Kryovials und lagern Sie sie in einem Gefrierschrank von -80 °C. Die gefrorenen Fläschchen nach 24 h in flüssigen Stickstoff übertragen.</li>
	<li>Zur Unterscheidung: Ersetzen Sie das HiPSC-Medium durch 2 ml RB-Medium, ergänzt durch den 10-M-GSK-3-Inhibitor CHIR99021 (CHIR) bei 80 %–90%igem Zellzusammenfluss. Ersetzen Sie das Medium durch 3 ml RB-Medium nach 24 h und brüten Sie für weitere 48 h (Tag 3).</li>
	<li>Wechseln Sie am 3. Tag das Medium auf 3 ml RB-Medium mit 10 'M Wnt-Hemmer IWR1 für 48 h (Tag 5), und ersetzen Sie dann das Medium mit 3 ml RB-Medium und halten Sie es für 48 h (Tag 7).</li>
	<li>Ersetzen Sie am 7. Tag das Medium durch 3 ml RB-Medium und wechseln Sie das Medium alle 3 Tage in Zukunft. Spontanes Schlagen von hiPSC-CMs sollte zwischen den Tagen 7–10 beobachtet werden.</li>
</ol>3. hiPSC-CMs-Reinigung und kleine Molekül-Vorbehandlung
HINWEIS: Hochgereinigte, rekombinante Zelldissoziationsenzyme (Materialtabelle 1) wurden verwendet, um HiPSC-CMs zu dissoziieren.
<ol><li>Am 21. Tag nach der hiPSC-CM-Differenzierung das Medium aspirieren und die Zellen 1x mit sterilem PBS waschen. Inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 ml zelldissoziationsenzymen pro Brunnen für 5–7 min bei 37 °C. Pipette die Zellsuspension mit einer 1 ml Pipette, um die Zellen gründlich zu dissoziieren.</li>
	<li>Nachdem die Zellen dissoziiert sind, fügen Sie 1 ml neutralisierende Lösung zu jedem Brunnen hinzu, sammeln Sie das Zellgemisch in ein 15 ml Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 200 x g für 3 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in neutralisierender Lösung wieder auf.</li>
	<li>Pflanzen Sie die Zellen mit einer Dichte von 2 Millionen Zellen pro Brunnen auf gelatinebeschichtete 6-Well-Platten.</li>
	<li>Ersetzen Sie nach 24–48 h das Kulturmedium für 3–5 Tage durch Reinigungsmedium. HINWEIS: Die Reinigung ist abgeschlossen, wenn mehr als 90% der Zellen in jedem Mikroskop-Ansichtsfeld schlagen. Um weitere Schäden an den Kardiomyozyten zu vermeiden, verlängern Sie die Reinigungsdauer nicht über 5 Tage hinaus. Wenn die erste Runde nicht die notwendige Reinheit ergibt, ersetzen Sie das Reinigungsmedium für 1 Tag durch RB+ Medium, und schließen Sie dann eine zweite Reinigungsrunde ab.</li>
	<li>Vor der Transplantation die Zellen in der Behandlungsgruppe für 12 h in RB+ Medium mit 10 'M Y-27632 ergänzt. In ähnlicher Weise führen Sie verapamil Behandlung auf den Zellen im RB + Medium mit 1 M verapamil für 12 h (hiPSC-CMs+VER).</li>
	<li>Nach der Behandlung die hiPSC-CMs 1x mit PBS waschen und die Zellen mit 0,5 ml Zelldissoziationsenzymen pro Brunnen für maximal 2 min inkubieren. Wiederholt pipette die Zellsuspension, mit einer 1 ml Pipette, um die Zellen gründlich zu dissoziieren. Neutralisieren Sie die Zellen mit neutralisierender Lösung, sammeln Sie das Zellgemisch in einem 15 ml Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 200 x g für 3 min. Setzen Sie die Zellen in PBS in einer Konzentration von 0,1 Millionen Zellen/5 l zur Vorbereitung auf die Injektion aus.</li>
</ol>4. Myokardinfarkt und Zelltransplantation
HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente sind mit Autoklaven vorsterilisiert und werden während mehrerer Operationen über einen heißen Perlensterilisator(Materialtabelle 2) in aseptischem Zustand gehalten.
<ol><li>Anästhetisieren Sie NOD/scid-Mäuse (Materialtabelle 2) mit inhaliertem Isofluran (1,5%–2%). Überwachen Sie den Anästhesiespiegel durch die Reaktionen der Mäuse auf eine Zehenklemme. Legen Sie die optische Salbe des Tierarztes auf die Augen, um zu verhindern, dass sie während der Operation trocknen.</li>
	<li>Versorgung mit 0,1 mg/kg Buprenorphin subkutan für das Schmerzmanagement vor der Operation.</li>
	<li>Positionieren und sichern Sie die Maus in einer Supine-Position auf einem beheizten Operationstisch, entfernen Sie das Haar aus dem ventralen Halsbereich und den linken Thorax mit einer Enthaarungscreme, setzen Sie die Haut aus und desinfizieren Sie sie mit 70% Alkohol.</li>
	<li>Schneiden Sie einen 0,5 cm Großen Schnitt in der Mitte des Halses mit einer chirurgischen Schere, trennen Sie das subkutane Fett mit sterilen Zangen und setzen Sie die Luftröhre aus. Führen Sie die Intubationskanüle oral in die Luftröhre ein, schließen Sie die Kanüle an ein beatmungskleines Beatmungsgerät an und passen Sie die Belüftungseinstellungen an (stellen Sie das Gezeitenvolumen auf 100–150 l und die Atmungsrate auf 100x–150x pro min).</li>
	<li>Nachdem sich die Maus stabilisiert hat, schneiden Sie einen 0,5 cm Großen Schnitt in die Mitte der linken Brusthaut. Verwenden Sie Zangen, um die Muskelschicht unverblümt zu trennen und einen kleinen Schnitt im fünften interkostalen Raum zu machen, um die Brusthöhle freizulegen. Legen Sie den Retraktor in den Schnitt, um die Brusthöhle zu öffnen und die linke absteigende Herzkranzgefäße (LAD) zu lokalisieren. Unter einem sezierenden Operationsmikroskop ligate der LAD mit einem 8-0 nicht resorbierbare Naht.</li>
	<li>Unmittelbar nach der MI-Induktion 5 l hiPSC-CMs-RI, hiPSC-CMs+RI, hiPSC-CMs-VER, hiPSC-CMs+VER oderein gleiches PBS-Volumen in das Myokard der Maus an jedem Standort (3 x 105 Zellen/Tier, 1 x 105) Zellen/Standort), eine im Infarktbereich und zwei in den Bereichen um den Infarkt. HINWEIS: Da 5 l sehr geringes Volumen ist, ist es nicht einfach, das Volumen genau zu kontrollieren, indem man es direkt mit einer Spritze saugt. Der Deckel einer sterilen Petrischale kann umgedreht werden, und 5 l der Zellen können zuerst mit einer Pipette auf den Deckel abgelagert werden. Aufgrund der Oberflächenspannung breitet sie sich nicht aus, sondern kondensiert zu einer kleinen Flüssigkeitsmasse. Dies kann leicht absorbiert und in das Myokard der Maus injiziert werden.</li>
	<li>Beseitigen Sie Restluft in der Brusthöhle, indem Sie sie mit warmer isotonischer Salinelösung füllen. Nähen Sie die Rippen, Muskeln und die Haut nacheinander mit einer 6-0 resorbierbaren Naht. Schalten Sie die Isofluran-Anästhesie-Injektion aus. Halten Sie die Operationstiere auf dem Heizkissen und beobachten Sie sie genau, während sie das volle Bewusstsein wiedererlangen. Dann legen Sie die Tiere in einen sauberen Käfig. Bringen Sie die Tiere erst dann an die Gesellschaft anderer Tiere zurück, wenn sie vollständig geborgen sind.</li>
	<li>Nach der Operation injizieren Sie die Mäuse intraperitoneal mit Buprenorphin (0,1 mg/kg) alle 12 h für 3 aufeinander folgende Tage und injizieren Sie sie mit Ibuprofen (5 mg/kg) alle 12 h für einen Tag. Führen Sie nachfolgende Analysestudien zu bestimmten Zeitpunkten durch. HINWEIS: Befolgen Sie die Richtlinien Ihres örtlichen Tierschutzausschusses für Analgesie.</li>
</ol>5. Calcium Transient und KontraktilitätAufnahme
<ol><li>Autoklav 15 mm-Durchmesser Abdeckungen (Materialtabelle 2) und Pinzette in einem kleinen Glasbecher bei 121 °C, 15 psi für 15 min. Die Abdeckungen und Pinzette bei 4 °C vorkühlen.</li>
	<li>Mit der Pinzette legen Sie den Deckelinin in eine 12-Well-Platte und pipette 300 l extrazelluläre Matrix auf jeden Coverslip. HINWEIS: Lassen Sie die Matrix nicht die Kante des Deckslips überschreiten, um eine Reduzierung der Matrixbeschichtungsmenge zu verhindern. Inkubieren Sie die 12-Well-Platte in einem 37 °C Zellkultur-Inkubator für 1 h.</li>
	<li>Das Medium in der gelatinebeschichteten 6-Well-Platte mit gereinigten HiPSC-CMs ansaugen, 1x mit PBS waschen und dann mit 0,5 ml Zelldissoziationsenzymen für 1,5 min verdauen. 1 ml Neutralisationslösung hinzufügen, Pipette wiederholt für nicht mehr als 5x–10x mit einer 1 ml Pipette , und zentrifugieren Sie die Mischung bei 200 x g für 3 min.</li>
	<li>Die beschichtete extrazelluläre Matrix aus den Coverlips absaugen. Zählen Sie die Zellzahl und setzen Sie die Zellen in der neutralisierenden Lösung auf eine Konzentration von 40.000/300 l aus, und fügen Sie dann 300 l der Zellsuspension auf jeden Deckelschlupf hinzu. Die Platte in einem 37 °C-Inkubator besanieren.</li>
	<li>Nach 24 h, die neutralisierte Lösung vorsichtig ansaugen, 500 l RB+ Medium zu jedem Bohrgut der Platte hinzufügen und 2 Tage lang weiter kulturalisieren.</li>
	<li>Fügen Sie Y-27632 (10 M), Rho-Kinase-Aktivator (RA, 100 nM), Verapamil (1 M) oder ein gleiches PbS-Volumen in das Kulturmedium von hiPSC-CMs, 12 h vor Calciumtransienten und Kontraktilitätsdetektion hinzu. HINWEIS: Neben dem Nachweis des Kalziumtransienten und der Kontraktilität der Zellen nach 12 h chemischer Behandlung wurde der Nachweis dieser Parameter auch bei 12, 24, 48 und 72 h nach chemischer Entnahme getestet.</li>
	<li>Nehmen Sie die Platte heraus, entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Platte 1x mit PBS. Ändern Sie das Medium in ein phenolrot-freies DMEM, das 0,02 % (w/v) Destensidpolyol (Materialtabelle 1), 5 m Calciumindikator (Materialtabelle 1) enthält, und das entsprechende Y-27632 (10 m), RA (100 nM), verapamil (1 m) oder ein gleiches Volumen PBS und inkubieren Sie die Platte 30 min bei 37 °C.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie die Zellen 3x mit farbstofffreiem DMEM-Medium und lassen Sie das Medium 30 min ruhen, um den Mapping-Farbstoff zu entestert.</li>
	<li>Legen Sie den zellsäenden Deckel in eine offene Badkammer und legen Sie die Kammer in ein Mikroinkubationssystem ein, das mit einem automatischen Temperaturregler(Materialtabelle2) auf 37 °C ausgeglichen ist, mit der Lösung von Tyrode durchnässt und kontinuierlich Rho-Kinase-Inhibitor (RI), RA oder PBS zur Perfusionslösung.</li>
	<li>Verwenden Sie ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop (Materialtabelle 2) und einen Laser-Scanning-Kopf (Tabelle der Materialien 2), um spontane Kalziumtransienten aufzuzeichnen, indem Sie einen x-t-Linienscan verwenden, mit einem 488 nm Argonlaser für die Farbanregung und einem 515 x 10 nm Barrierefilter, um Emissionslicht zu sammeln. Zeichnen Sie die spontane Kontraktion von hiPSC-CMs mit der Differential Interference Contrast-Funktionalität des konfokalen Mikroskops auf (Materialtabelle 2). HINWEIS: Calciumtransientaufnahmen wurden mit der Software MATLAB R2016A (Tabelle der Materialien 4) verarbeitet und analysiert. Zellkontraktion selungsänderungstests wurden mit ImageJ-Software durchgeführt (Tabelle der Materialien 4).</li>
</ol>

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<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+cell+motility+by+carbon+ion+irradiation+via+the+Rho+signaling+pathway+and+its+inhibition+by+the+ROCK+inhibitor+Y-27632+in+lung+adenocarcinoma+A549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells.</a> Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).</li>
<li>Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC-beta+exacerbates+in+vitro+brain+barrier+damage+in+hyperglycemic+settings+via+regulation+of+RhoA%2FRho-kinase%2FMLC2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Zu den wichtigsten Schritten dieser Studie gehören die Erlangung reiner HiPSC-CMs, die Verbesserung der Aktivität von HiPSC-CMs durch Y-27632-Vorbehandlung und schließlich die Transplantation einer genauen Menge an HiPSC-CMs in ein Maus-MI-Modell.
Die wichtigsten Themen, die hier angesprochen wurden, waren, dass wir zunächst die glukosefreien Reinigungsmethoden19 optimiert und ein neuartiges effizientes Reinigungssystem etabliert haben. Das Systemverfahren umfasste die ...

Stammzellbasierte Therapien haben ein erhebliches Potenzial als Behandlung von Herzschäden durch MI1gezeigt. Die Verwendung differenzierter HiPSCs bietet eine unerschöpfliche Quelle für hiPSC-CMs2 und öffnet die Tür für die schnelle Entwicklung bahnbrechender Behandlungen. Es gibt jedoch noch viele Einschränkungen bei der therapeutischen Übersetzung, einschließlich der Herausforderung der stark niedrigen Transplantationsrate implantierter Zellen.
Dissoziierende Zellen mit Trypsin löst Anoikis3, die erst beschleunigt wird, wenn diese Zellen in raue Umgebungen wie das ischämische Myokard injiziert werden, wo die hypoxische Umgebung den Kurs in Richtung Zelltod beschleunigt. Von den verbleibenden Zellen wird ein großer Teil von der Implantationsstelle in den Blutkreislauf ausgewaschen und in der Peripherie verteilt. Einer der wichtigsten apoptotischen Pfade ist der RhoA/ROCK-Weg4. Basierend auf früheren Forschungen reguliert der RhoA/ROCK-Signalweg die aktin zytoskelettale Organisation5,6, die für Zellfunktionsstörungen verantwortlich ist7,8. Der ROCK-Hemmer Y-27632 wird häufig bei der somatischen und Stammzelldissoziation und Passaging verwendet, um die Zelladhäsion zu erhöhen und die Zellapoptose9,10,11zu reduzieren. In dieser Studie wird Y-27632 zur Behandlung von HiPSC-CMs vor der Transplantation verwendet, um die Zellengraftmentrate zu erhöhen.
Es wurden mehrere Methoden zur Verbesserung der Zellentransplantationsrate etabliert, wie Hitzeschock und Kellermembranmatrixbeschichtung12. Abgesehen von diesen Methoden kann die Gentechnologie auch die Proliferation von Kardiomyozyten13 oder die Umkehrung nichtmyokardischer Zellen in Kardiomyozyten14fördern. Aus bioengineering-Sicht werden Kardiomyozyten auf ein Biomaterialgerüst gesetzt, um die Transplantationseffizienz zu verbessern15. Leider sind die meisten dieser Methoden kompliziert und kostspielig. Im Gegenteil, die hier vorgeschlagene Methode ist einfach, kosteneffizient und effektiv, und sie kann als Basalbehandlung vor der Transplantation sowie in der Konjugation mit anderen Technologien eingesetzt werden.

<table><tbody><tr><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase (Lösung zur Stammzellablösung)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#07920</td><td></td></tr><tr><td>B27 minus Insulin</td><td>Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-504-044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x), hoher Glukosegehalt, HEPES, kein Phenolrot</td><td>Thermofisher</td><td>20163029</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM (Calciumindikator)</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Glukosefrei RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>72562</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (extrazelluläre Matrix)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR (humane pluripotente Stammzellen medium)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Streptokokken-Antibiotikum</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (Tensidpolyol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Rho-Aktivator II</td><td>Zytoskelett</td><td>CN03</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-DL-Laktat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (Zelldissoziationsenzyme)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-605-010</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td><stark>Name</td><td><>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung und Zubehör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III Biolumineszenz-Instrumente</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>15 mm Deckgläser</td><td>Warner</td><td>CS-15R15</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>NX50</td><td></td></tr><tr><td>Dual Automatic Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophorese-Netzteil</td><td>BIO-RAD</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitskamera</td><td>pco</td><td>1200 s</td><td></td></tr><tr><td>Laserscan-Kopf</td><td>Olympus</td><td>FV-1000</td><td></td></tr><tr><td>Offene Badkammer mit niedrigem Profil (wird in das obere Mikroinkubationssystem montiert)</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-42LP</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinkubationssystem</td><td>Warner Instruments</td><td>DH-40iL</td><td></td></tr><tr><td>Minivent Maus Beatmungsgerät</td><td>Harvard Apparat</td><td>845</td><td></td></tr><tr><td>NOD/SCID-Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>Precast Protein Gels</td><td>BIO-RAD</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Transfer Packs</td><td>BIO-RAD</td><td>1704156</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot System</td><td>BIO-RAD</td><td>Trans-Blot Turbo</td><td></td></tr><tr><td>Hot Bead Sterilisator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td><stark> Name</td><td>Unternehmen</strong</td><td>>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong<></td></tr><tr><td>strong>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-Nukleolin (Alexa Fluor 647)</td><td>Abcam</td><td>ab198580</td><td></td></tr><tr><td>Herz-Troponin T</td><td>R & D Systems</td><td>MAB1874</td><td></td></tr><tr><td>Cardiac Troponin C</td><td>Abcam</td><td>ab137130</td><td></td></tr><tr><td>Cardiac Troponin I</td><td>Abcam</td><td>ab47003</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-Esel Anti-Maus</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>715-175-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-Esel Anti-Kaninchen</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Fitc-Esel Anti-Maus</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>715-095-150</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab22555</td><td></td></tr><tr><td>Menschliches kardiales Troponin T</td><td>Abcam</td><td>ab91605</td><td></td></tr><tr><td>Integrin &beta; 1</td><td>Abcam</td><td>ab24693</td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>EMD Millipore</td><td>ab9260</td><td></td></tr><tr><td>N-Cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab18203</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Myosin Light Chain 2</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3671s</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>R2016A</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.52g</td><td></td></tr></tbody></table>

verbesserung der transplantation von humaninduzierten pluripotenten stammzellen abgeleiteten kardiomyozyten über eine transiente hemmung der rho kinase aktivität

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Ein entscheidender Faktor bei der Verbesserung der Wirksamkeit der Zelltherapie bei der Myokardregeneration ist die sichere und effiziente Erhöhung der Zellentransplantationsrate. Y-27632 ist ein hochwirksamer Inhibitor der Rho-assoziierten, coiled-coil-haltigen Proteinkinase (RhoA/ROCK) und wird verwendet, um Dissoziations-induzierte Zellapoptose (Anoikis) zu verhindern. Wir zeigen, dass die Y-27632-Vorbehandlung für humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs+RI) vor der Implantation zu einer Verbesserung der Zellengraftmentrate in einem Mausmodell des akuten Myokardinfarkts (MI) führt. Hier beschreiben wir ein komplettes Verfahren der HiPSC-CMs-Differenzierung, -Reinigung und -Zellvorbehandlung mit Y-27632 sowie die daraus resultierende Zellkontraktion, Kalziumtransientenmessungen und Transplantation in Maus-MI-Modelle. Die vorgeschlagene Methode bietet eine einfache, sichere, effektive und kostengünstige Methode, die die Zellentransplantationsrate deutlich erhöht. Diese Methode kann nicht nur in Verbindung mit anderen Methoden zur weiteren Verbesserung der Zelltransplantationseffizienz eingesetzt werden, sondern bietet auch eine günstige Grundlage für die Untersuchung der Mechanismen anderer Herzerkrankungen.

Die in dieser Studie verwendeten HiPSC-CMs wurden von menschlichem Ursprung mit luziferase Reporter-Gen abgeleitet; Daher wurde die Überlebensrate der transplantierten Zellen in vivo durch Biolumineszenz-Bildgebung (BLI)17 (Abbildung 1A,B) nachgewiesen. Für histologische Herzabschnitte wurden humanspezifische sintherzische Troponin T (hcTnT) und humane Kernantigenzellen (HNA) als transplantierte hiPSC-CMs klassifiziert...

In diesem Protokoll zeigen wir und erläutern, wie man humaninduzierte pluripotente Stammzellen zur Kardiomyozytendifferenzierung und -reinigung verwendet und weiter, wie die Transplantationseffizienz mit dem Rho-assoziierten Proteinkinase-Inhibitor verbessert werden kann. Vorbehandlung in einem Maus-Myokardinfarktmodell.

Verbesserung der Transplantation von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten über eine transiente Hemmung der Rho Kinase Aktivität

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Unsere Daten zeigen, dass die vorübergehende Hemmung der Rhokinase-Aktivität die Adhäsion, das Überleben und die Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten nach der Transplantation in die infarktierten Tierherzen verbessert. Wir bieten eine einfache, kostengünstige, während hocheffiziente Methode, um die Transplantation von transplantierten hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten in den verletzten Tierherzen zu erhöhen. Da diese Technik die Zellentransplantationsraten bei akutem Herzinfarkt und Herzinsuffizienz sicher und effizient verbessern kann, trägt sie zur daraus resultierenden Verbesserung der Herzfunktion, der Vaskularitäten und der Apoptose bei.Obwohl wir unsere Protokolle nur in hiPSCs getestet haben, können diese Methoden auf andere Zelltypen angewendet werden, wie embryonale Stammzellen, mesenchymale Stammzellen usw. Die Dosis und Dauer der Y-27632 Behandlung ist entscheidend. Die visuelle Demonstration kann alle wichtigen Schritte im Protokoll detailliert demonstrieren, was für jemanden von Vorteil ist, der diese Technik noch nie zuvor ausgeführt hat.Am 21. Tag nach der hiPSC-CM-Differenzierung das Medium aspirieren und die Zellen einmal mit sterilem PBS waschen. Inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 Millilitern zelldissoziationsenzymen pro Brunnen bei 37 Grad Celsius für fünf bis sieben Minuten. Nach der Inkubationszeit die Zellsuspension wiederholt mit einer Ein-Milliliter-Pipette pipette, um die Zellen gründlich zu dissoziieren.Dann fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter neutralisierende Lösung hinzu, sammeln Sie die Zellmischung in einem 15-Milliliter-Zentrifugenrohr und zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 200 mal g. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und die Zellen in der neutralisierenden Lösung wieder aussetzen. Dann pflanzen Sie die Zellen auf gelatinebeschichtete, sechswellige Platten mit einer Dichte von zwei Millionen Zellen pro Brunnen neu.Nach 24 bis 48 Stunden das Kulturmedium für drei bis fünf Tage durch das Reinigungsmedium ersetzen. Vor der Transplantation, Kultur die Zellen in der Behandlungsgruppe für 12 Stunden in RB-plus Medium ergänzt mit 10-Mikromolar Y-27632. In ähnlicher Weise, führen Verapamil Behandlung auf den Zellen im RB-plus Medium mit einem Mikromol verapamil für 12 Stunden.Waschen Sie die HiPSC-CMs nach der Behandlung einmal mit PBS und inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 Mikrolitern zelldissoziierender Enzyme pro Brunnen für maximal zwei Minuten. Pipette die Zellsuspension mit einer Ein-Milliliter-Pipette, um die Zellen gründlich zu dissoziieren. Als nächstes neutralisieren Sie die Zellen mit neutralisierender Lösung, sammeln Sie die Zellmischung in einem 15-Milliliter-Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 200 mal g für drei Minuten.Nach der Zentrifugation die Zellen in PBS in einer Konzentration von 0,1 Millionen Zellen pro fünf Mikroliter zur Vorbereitung auf die Injektion wieder aussetzen. Unmittelbar nach der myokarddialen Infarktinduktion fünf Mikroliter Kontroll-HiPSC-CMs, Y-27632-vorbehandelte HiPSC-CMs, verapamil-behandelte HiPSC-CMs oder ein gleiches PBS-Volumen in das Myokard der Maus an jedem Standort, einen im Infarktbereich und zwei in den Bereichen um den Infarkt. 12 Stunden vor der Durchführung des Kalziumtransienten- und Kontraktilitätsnachweises 10-Mikromolar Y-27632, 100-Nanomolar RA, Einmikromollar verapamil oder ein gleiches PBS-Volumen in das Kulturmedium von hiPSC-CMs geben.Als nächstes entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Platte einmal mit PBS. Ändern Sie das Medium in ein phenolrotfreies DMEM, das 0,02 Gewichtsprozent des Tensidpolypols, den Calciumindikator für Fünfmikromolare und den entsprechenden Y-27632, RA, verapamil oder ein gleiches PBS-Volumen enthält, und brüten die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation den Überstand entsorgen, die Zellen dreimal mit dem farbstofffreien DMEM waschen und das Medium 30 Minuten ruhen lassen, um den Mapping-Farbstoff zu entestert.Legen Sie den zellsäenden Deckel in eine offene Badkammer und legen Sie die Kammer in ein Mikroinkubationssystem ein, das mit einem automatischen Temperaturregler auf 37 Grad Celsius ausgeglichen ist. Durchfülle es mit der Tyrodes-Lösung und füge der Perfusionslösung kontinuierlich RI, RA oder PBS hinzu. Verwenden Sie ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop und einen Laser-Scanning-Kopf, um spontane Kalziumtransienten aufzuzeichnen, indem Sie einen x-t-Linienscan verwenden.Zeichnen Sie die spontane Kontraktion von hiPSC-CMs mit der Differentialinterferenzkontrastfunktion des konfokalen Mikroskops auf. Die Überlebensrate der transplantierten Zellen wurde durch die erhöhte Luziferase-Aktivität bestätigt. Die erhöhte humane Herztroponin T und menschliche nukleare Antigenexpression zeigten, dass y-27632 Vorbehandlung die Zellengraftmentrate signifikant verbessern konnte.Y-27632 vorbehandelte Zellen zeigten eine größere und definiertere stabförmige zytoskelettale Struktur. Auch die Y-27632-Vorbehandlung verringerte DIE TUNEL-positiven Zellen, was auf die reduzierte transplantierte HiPSC-CM-Apoptose in vivo hindeutet. Western Blot schlug vor, dass Y-27632 Vorbehandlung erhöhte Expression von Integrin beta-1 und N-Cadherin und verringerte die Expression von Phospho-Myosin-Lichtkette 2.Diese Änderung wurde 72 Stunden nach Y-27632 Rückzug normalisiert. In-vitro-Maus-HL-1-Zellanhaftungsexperimente zeigten, dass die Y-27632-Vorbehandlung die HiPSC-CM-Adhärenz im Vergleich zu HL-1 signifikant erhöhte. Die Y-27632-Vorbehandlung reduzierte die kontraktile Kraft, die maximale transiente Fluoreszenz des Kalziums und die transiente Calciumdauer.Y-27632 Präbehandlung reguliert Ekardiomyozytenkontraktion durch signifikante Verringerung der Expression von cTnI und cTnT. Ähnlich wie bei Y-27632 erhöhte die Verapamil-Vorbehandlung die Luziferase-Aktivität und die Anzahl der hcTnT/HNA-Doppel-positiven Zellen. Der wichtigste Schritt ist die Kultur zellen in der Behandlungsgruppe für 12 Stunden in Rb-plus Medium ergänzt mit 10-Mikromolar Y-27632.Basierend auf dieser Methode ist die langsame Freisetzung von Y-27632 zur weiteren Erhöhung der Zellentransplantationsrate eine vielversprechende Strategie. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, die Physiologie und Funktion von HiPSC von CMs in vivo zu untersuchen. Das kleine Molekül CHIR99021, das zur Differenzierung von Kardiomyozyten verwendet wird, ist gefährlich, was zu Atemwegsreizungen führen kann.Bitte nehmen Sie keinesfalls ein oder inhalieren Sie sie.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Kardioblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen kardialen Vorläuferzellen und funktionelle Kardiomyozyten für Herz-Kreislauf-Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Pluripotenten Stammzellen, entweder embryonale oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), eine wertvolle Quelle der menschlichen differenzierten Zellen, einschließlich Herzmuskelzellen. Hier werden wir auf die kardiale Induktion der iPS-Zellen zu konzentrieren, die zeigen, wie man sie benutzt, um funktionelle menschliche Herzmuskelzellen durch eine Embryoidkörpern-basiertes Protokoll zu erhalten.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Intramyokardialer Zellabgabe in murinen Modellen von kardiovaskulären Erkrankungen, wie Hypertonie oder Myokardinfarkt, wird häufig verwendet, um das therapeutische Potential von verschiedenen Zelltypen in der Regenerationsstudien getestet. Daher wird eine ausführliche Beschreibung und eine klare Visualisierung dieses chirurgische Verfahren helfen, die Grenzen und Vorteile der Herz-Kreislauf-Zelle therapeutische Analysen in kleinen Nagern zu definieren.

Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine

Der Artikel beschreibt die detaillierte Methode zur menschlichen pluripotenten Stammzellen differenzieren zu Herzmuskelzellen wirksam durch selektives Modulieren des Wnt-Signalwegs, gefolgt von Durchflusszytometrie-Analyse von Referenzmarkierungen, um die Homogenität und Identität der Population abzuschätzen.

High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

Hier beschreiben wir ein robustes Protokoll für die Ableitung menschlicher Kardiomyozyten, das die modulierte kardiale Differenzierung kleiner Moleküle und die durch Glukoseentzug vermittelte Kardiomyozytenreinigung kombiniert und die Produktion von gereinigten Kardiomyozyten für die Zwecke der Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und des Wirkstoffscreenings ermöglicht.

Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation

Wir präsentieren drei neue und effizientere Protokolle für den menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in Kardiomyozyten, Endothelzellen differenzieren und glatten Muskelzellen und eine Fördermethode, die das Einwachsen von transplantierten Zellen verbessert durch Zellinjektion mit Patch-vermittelten Cytokin-Lieferung zu kombinieren.

Pluripotente Stammzellen Herzzellen für Myocardial Repair Abgeleitet

Hier präsentieren wir eine robuste Methode zur primären embryonale Fibroblasten in funktionellen Herzmuskelzellen durch Überexpression des GATA4, Hand2, Mef2c und Tbx5, MiR-1 und MiR-133 (GHMT2m) neben Hemmung der TGF-β-Signal neu zu programmieren. Unser Protokoll generiert schlagende Herzzellen bereits 7 Tage nach Transduktion mit bis zu 60 % Wirkungsgrad.

Unterdrückung der Pro-fibrotische Signalisierung potenziert Faktor-vermittelten Reprogrammierung von Maus embryonalen Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten

Hier stellen wir ein Protokoll zur robusten Erzeugung und Erweiterung menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patienteneigenen peripheren Blutes vor.

Erzeugung und Expansion menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patientenperipheren Blutes

Die ultraschallgesteuerte Zellabgabe um die Stelle des Myokardinfarkts bei Mäusen ist eine sichere, effektive und bequeme Art der Zelltransplantation.

Ultraschallgesteuerte induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten-Implantation bei myokardinfarktierten Mäusen

Humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) bieten eine Alternative zur Verwendung von Tieren für das präklinische Kardiotoxizitäts-Screening. Eine Einschränkung für die weit verbreitete Einführung von hiPSC-CMs im präklinischen Toxizitätsscreening ist der unreife, fetale Phänotyp der Zellen. Hier werden Protokolle für eine robuste und schnelle Reifung von hiPSC-CMs vorgestellt.

Hochdurchsatz-Kardiotoxizitäts-Screening unter Verwendung von reifen, humaninduzierten pluripotenten Stammzell-Kardiomyozyten-Monoschichten

Die Steuerung von Herzzellen und -gewebe mit Licht ermöglicht eine berührungslose Stimulation, wodurch der natürliche Zustand und die Funktion der Zellen erhalten bleiben, was sie zu einem wertvollen Ansatz sowohl für die Grundlagenforschung als auch für therapeutische Anwendungen macht.

Ein kardiales mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Ca2+ -Ausbreitung durch nicht-genetische optische Stimulation

Erfahren Sie, wie die vorübergehende Hemmung der Rho-Kinase-Aktivität die Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten im Maus-Myokardinfarkt-Modell verbessert. Diese Methode steigert die Zelladhäsion und das Überleben.

Verbesserung der Transplantation von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten über eine transiente Hemmung der Rho Kinase Aktivität (Video) | JoVE Journal

Verbesserung der Transplantation von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten über eine transiente Hemmung der Rho Kinase Aktivität

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