Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analyse des Fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri durch Multiplex-PCR und Kapillarelektrophorese

Dieses MLB-Genotypisierungsprotokoll hat unser Verständnis der Epidemiologie und der globalen Populationsstruktur von Yersinia ruckeri, einem international wichtigen Fischpathogenbakterium, erheblich verbessert. Im Vergleich zu den zuvor etablierten Yersini ruckeri Typisierungsschemata bietet es eine sehr hohe Dehnungsauflösung. Das Verfahren ist einfach, billig und vergibt tragbare Ergebnisse, die leicht in Laboratorien verglichen werden können.

Die Technik verbessert die diagnostische Spezifität erheblich und ermöglicht die Rückverfolgung von Infektionen. Zum Beispiel können wir jetzt oft virulente Yersinia ruckeri Klone unterscheiden, die vor dem Hintergrund nicht-virulenter Umweltbelastungen existieren. Demonstriert wird das Verfahren von Saima Nasrin Mohammad, einer Technikerin in unserem Labor.

Um zu beginnen, verwenden Sie sterile Impfschlaufen, um Yersinia ruckeri reine Kulturen auf jedem geeigneten Agar-Typ auf Petri-Gerichte zu säen. Bei 22 Grad Celsius für ein bis zwei Tage oder 15 Grad Celsius für drei bis vier Tage inkubieren. Danach, mit Impfschleifen, wählen Sie eine einzige repräsentative Kolonie aus jeder Petrischale und übertragen Sie auf 1,5-Milliliter Zentrifugenrohre, die 50 Mikroliter ultra gereinigtes Wasser enthalten, um wieder zu suspendieren.

Wirbel kurz und inkubieren für sieben Minuten auf einem Heizblock bei 100 Grad Celsius. Dann zentrifugieren Sie bei 16.000 g für drei Minuten und verwenden Sie eine Pipette, um die überstande Schablonen-DNA sorgfältig in leere 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhren zu übertragen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort oder speichern Sie die DNA bei 20 Grad Celsius.

Zur Herstellung von Mastermischungen berechnen Sie zunächst die Reagenzvolumina nach der Anzahl der zu analysierenden Bakterienproben, wobei auch eine negative und eine positive Kontrolle und ein endgültiges Überschussvolumen von 10 %, wie im Manuskript beschrieben, berücksichtigt werden. Beachten Sie, dass unterschiedliche Primerkonzentrationen verwendet werden. In zwei separaten Zentrifugenröhren, einer pro PCR-Assay, multiplex PCR plus Master-Mix, Primer und RNase-freies Wasser hinzufügen.

Vortex mischt der vorbereitete Master sanft bei niedriger Geschwindigkeit und verteilt dann 22 Mikroliter jedes Master-Mix separat in einzelne Brunnen auf PCR-Streifen oder Platten. Fügen Sie dann drei Mikroliter der vorbereiteten DNA-Vorlage zu jedem Brunnen enthaltenden Master-Mix hinzu;zwei Brunnen pro Bakterienprobe, einer für jeden Test. Verwenden Sie DNA von einem verifizierten Yersinia ruckeri Stamm für eine positive Kontrolle, und ultra gereinigtes Wasser für eine negative Kontrolle.

Kurz versiegeln und zentrifugieren. Laden Sie die vorbereiteten Reaktionen auf einen PCR-Thermocycler und richten Sie das Programm entsprechend dem Manuskript ein. Das Programm wird in weniger als drei Stunden abgeschlossen.

Nach den Empfehlungen des Herstellers, fügen Sie Agarose GelPulver in einem Mal TBE Puffer zu erreichen 1,5 Gewicht / Volumen Prozent und Wärme zu lösen. Vor dem Gießen die gelöste Gellösung kurz unter fließendem Wasser abkühlen lassen, 5 Mikroliter fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff pro 50 Mikroliter Gellösung hinzufügen und mischen. Montieren und nivellieren Sie das Gussfach.

Fügen Sie entsprechend der Anzahl der Proben Kegel hinzu. Gießen Sie die Gellösung in den Guss und warten Sie, bis sie erstarrt. Danach tauchen Sie den Guss, der das Gel enthält, in einem TBE-Puffer in einem Gelelektrophoresesystem unter.

Mischen Sie fünf Mikroliter der PCR-Produkte zusammen mit zwei Mikrolitern Ladefarbstoff in neuen PCR-Streifen. Fünf Mikroliter der Mischungen in die Brunnen im Gel geben. Sparen Sie mindestens einen gut leer.

Fügen Sie fünf Mikroliter DNA-Leiter in den leeren Brunnen als Referenz. Stecken Sie die Elektroden ein und führen Sie das Gel mit 110 Volt pro 15 Zentimeter für etwa eine Stunde. Verwenden Sie ein UV-basiertes Gel-Bildgebungssystem, um das Vorhandensein mehrerer Bänder zu überprüfen, die PRC-Amplicons darstellen.

Nach bestätigung von PCR-Amplicons verwenden Sie neue PCR-Streifen oder Platten, um PCR-Produkte eins bis zehn in gereinigtem Wasser zu verdünnen. Wirbel und Zentrifuge kurz. Bereiten Sie während der Arbeit in einem Rauchschrank eine Mastermischung in einem Zentrifugenrohr vor, das aus Formamid und Referenzgröße besteht.

Verwenden Sie gemäß der Anzahl der zu analysierenden PCR-Produkte reagenzien, wie im Manuskript beschrieben. Erlauben Sie ein Überschussvolumen von 10 %. Wirbel kurz und verteilen Sie 9,5 Mikroliter in einzelne Brunnen auf einer PCR-Platte passend für das verfügbare Kapillarelektrophoresesystem.

Fügen Sie dann 0,5 Mikroliter verdünntes PCR-Produkt hinzu. Kurz versiegeln und zentrifugieren. Dann laden Sie die Platte mit den Proben in einen PCR-Thermocycler und denaturieren Sie die Proben bei 95 Grad Celsius für drei Minuten, bevor Sie auf unbestimmte Zeit auf vier Grad Celsius abkühlen.

Zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1000 g, entfernen Sie vorsichtig die Dichtung und laden Sie die Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers auf ein kalibriertes Kapillarelektrophoresesystem. Führen Sie die Kapillarelektrophorese der Fragmentanalyse mit Reagenzien entsprechend dem Gerät Ihrer Wahl durch und passen Sie die Laufbedingungen entsprechend der Beschreibung im Manuskript an. Für Yersinia ruckeri VNTR Kapillarelektrophorese Größe Aufrufen, importieren Sie zuerst Kapillarelektrophorese Ergebnisdateien in Gene Mapper 5 Software.

Legen Sie die Analysemethode auf Microsatellite Default fest, wählen Sie die entsprechende Produktauswahl unter Größenstandard aus, und drücken Sie dann die Schaltfläche Analysieren. Überprüfen Sie im Größenübereinstimmungseditor die korrekte Identifizierung von Größenstandardfragmenten und korrigieren Sie sichtbar fehlerhafte Zuordnungen. Wählen Sie dann das zu lesende Beispiel aus, drücken Sie die Schaltfläche Plot anzeigen, und drücken Sie Control A, um die Ansicht der Größentabelle zu aktivieren.

Halten Sie im oberen Bereich die Taste "Steuerung" gedrückt, während Sie auf die fünf Spitzen klicken, die die VNTR-Amplicons darstellen. Drücken Sie Control G, um die Größentabelle zu filtern, wobei nur die Merkmale der fünf hervorgehobenen Spitzen angezeigt werden, und notieren Sie die Größenaufrufe für jeden VNTR-Standort für die nachgelagerte Anwendung. Um verzerrte Amplikon-Mobilitätsmuster während der Kapillarelektrophorese zu berücksichtigen, berechnen Sie genaue VNTR-Wiederholungszahlen, indem Sie die erworbenen Größenaufrufe in Kombination mit den lokusspezifischen Variablen verwenden.

Die Formel kann in einer Tabellenvorlage für die Automatisierung implementiert werden. In der Kalkulationstabelle zählt die runde berechnete VNRT-Wiederholung vor der Nachgelagerten Analyse auf die nächste ganze Zahl. Erstellen Sie in der BioNumerics-Software eine neue Datenbank, und aktivieren Sie das MLVA-Plugin.

Drücken Sie im Experimenttypbedienfeld die Option Neuer Versuchstyp erstellen, wählen Sie Zeichentyp aus, und verwenden Sie die Standardeinstellungen, wenn Sie danach gefragt werden. Wählen Sie dann das neue Experiment aus, und fügen Sie für jeden der 10 VNTR-Loci neue Zeichen hinzu, wobei Null bis 100 als Wertebereich verwendet wird. Importieren Sie yersinia ruckeri VNTR-Wiederholungszahlen und Methodendaten, indem Sie Importfelder und Zeichen auswählen.

Suchen Sie die Datei, in der diese gespeichert ist, und treffen Sie eine Auswahl in der Spalte Zieltyp. Für die VNTRs bedeutet dies, dass der entsprechende Zeichenwert ausgewählt wird, während die verschiedenen Metadaten als Eingabeinfofelder klassifiziert werden. Die getroffenen Entscheidungen können als Vorlage gespeichert werden, um den Prozess für später zu vereinfachen.

Wählen Sie importierte Stichproben aus, die für die MST-Clusteranalyse bestimmt sind, und klicken Sie dann im Bereich Vergleiche auf die Schaltfläche Neue Vergleiche erstellen. Ordnen Sie die Samples bei Bedarf für die visuelle Darstellung des MST farbigen Gruppen zu, z. B. entsprechend einer bestimmten Metadatenfunktion. Wählen Sie dann Erweiterte Clusteranalyse und MST für kategoriale Daten aus, um ein MST-Diagramm basierend auf den ausgewählten Stichproben zu generieren.

Ändern Sie die visuelle Darstellung des MST weiter, indem Sie Partitionsparameter, Querlängen, Knotenverzweigungsbeschriftungusw. hinzufügen. Exportieren Sie bei Bedarf den fertigen MST in ein gewünschtes Format mit der Auswahl des Exportbilds. Nach Multiplex-PCR überprüft das Gelelektrophoresebild das Vorhandensein mehrerer Amplicons in allen 12 Spuren, die Proben enthalten, wobei die erste Spur die verwendete DNA-Leiter darstellt.

Bei Elektropherogrammen, die aus der Kapillarelektrophorese resultieren, können die verschiedenen VNTR-Loci anhand einer Kombination aus Größe und Farbstoffbeschriftung identifiziert werden. Orange Peaks stellen den verwendeten Größenstandard dar. Ein Beispiel für minimalen Spannbaum, basierend auf MLVA-Profilen von Yersinia Ruckeri Isolaten, die in fünf verschiedenen norwegischen Farmen aus atlantischem Lachs gewonnen wurden, wird gezeigt.

Eine deutliche Cluster-Tendenz, die mit dem Ursprung landwirtschaftlicher Betriebe verbunden ist, ist zu beobachten. Die Identifizierung verschiedener Yersini-Ruckeri-Klone durch MLVA, die beispielsweise in bestimmten geographischen Regionen von Fischarten dominieren, wurde bereits genutzt, um die Impfstrategien gegen diesen Erreger zu verbessern.