Name: Bewertung der synaptischen Multiplizität mit Whole-Cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Lernen Sie die Whole-Cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie zur Bewertung synaptischer Multiplizität in Neuronen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung synaptischer Dynamik und Plastizität in verschiedenen Gehirnregionen.

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J.s. erhielt Ontario Graduate Stipendium. W.I Stipendium ein neue Ermittler aus Mental Health Research Kanada. Diese Arbeit wird unterstützt durch Betriebskostenzuschüsse, Wi aus den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) und des Canadian Institute for Health Research (PJT 148707).

Alle Tierversuche werden von Animal Care Committee der University of Western Ontario im Einklang mit dem Canadian Council über Animal Care Leitlinien (AUP #2014-031) genehmigt.
(1) Lösungen
<ol><li>
Slicing Lösung
	<ol>
<li>Die Zusammensetzung der Slice-Lösung finden Sie unter Tabelle 1 .</li>
		<li>Bereiten Sie im Voraus eine 20-fach-Stammlösung und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
		<li>Lösen Sie für 1 X Schneid-Lösung Nahco33, Glukose und Saccharose in DdH2O und zugeben Sie 20 X Brühe. Sicherzustellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 315-320 mOsm und speichern Sie die Lösung für nicht mehr als 1 Woche bei 4 ° C.</li>
		<li>Füllen Sie zwei Becher mit 100 mL Lösung aufschneiden und mit Parafilm abdecken. Entspannen Sie die Lösung in einer Tiefkühltruhe, bis die Lösung (ca. 20 min bei-80 ° C Gefrierschrank) teilweise gefroren wird. Mit einem Gas-Verteilerrohr, Blase beide Becher des Schneidens Lösung mit 95 % O25 % CO2 für 20 min auf Eis.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="5">Lösungskonzentrationen (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Schneiden</td>
			<td>Normale ACFS</td>
			<td>Niedrige Ca2 + ACFS</td>
			<td>SR+ ACFS</td>
			<td>Pipette/interne</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>87</td>
			<td>126</td>
			<td>126</td>
			<td>126</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0,5</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>SrCl2
</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2.5</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>7</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.25</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nahco33
</td>
			<td>25</td>
			<td>26</td>
			<td>26</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glukose</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Saccharose</td>
			<td>75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>K-Gluconat</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>116</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na-Gluconat</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2-EGTA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2ATP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na3GTP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>0,3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Die Zusammensetzung der verschiedenen Lösungen.
<ol start="2"><li>
ACFS (für Slice Wiederherstellung und Wartung)
	<ol>
<li>Finden Sie in Tabelle 1 die Zusammensetzung der ACFS.</li>
		<li>Bereiten Sie im Voraus eine 20-fach-Stammlösung und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
		<li>Lösen Sie für 1 X ACFS Nahco33 und Glukose im DdH2O auf und zugeben Sie 20 X Brühe. Sicherstellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 298-300 mOsm. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 1 Tag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ACFS (niedrige Ca2 + für die Aufnahme)
	<ol>
<li>Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des niedrigen Ca2 + ACFS.</li>
		<li>Bereiten Sie im Voraus eine 20-fach-Stammlösung und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
		<li>Für 1 x niedrig Ca2 + ACFS, auflösen, Nahco33 und Glucose in ddH2O und fügen Sie 20 x (CaCl2 und MgCl2 frei) Lager, CaCl2 und MgCl2 angegebenen Konzentrationen. Sicherstellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 298-300. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 1 Tag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ACFS (Sr2 + für die Aufnahme)
	<ol>
<li>Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des Sr2 + ACFS.</li>
		<li>Bereiten Sie im Voraus eine 20-fach-Stammlösung und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
		<li>Für 1 x Sr2 + ACFS, auflösen, Nahco33 und Glukose im DdH2O und fügen Sie 20 x (CaCl2 und MgCl2 frei) Lager, SrCl2 und MgCl2 angegebenen Konzentrationen. Sicherstellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 298-300. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 1 Tag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Interne Lösung
	<ol>
<li>Die Zusammensetzung der K-Gluconat basierte interne Lösung finden Sie unter Tabelle 1 .</li>
		<li>Fügen Sie 15 mL Molekularbiologie Grade Wasser um 20 mL der internen Lösung zu machen hinzu, eine 50 mL-Tube. Führen Sie die folgenden Schritte auf dem Eis.</li>
		<li>Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor der Zeit 1 M Lager Konzentrationen in der molekularen Biologie Klasse Wasser. Hinzufügen (in mL): 2,32 K-Gluconat, 0,24 Na-Gluconat, 0,20 HEPES, 0,16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 0,04 MgCl2 bis 50 mL-Tube.</li>
		<li>100 µL von 0,3 M Na3GTP hinzufügen.</li>
		<li>Wiegen Sie 44,08 mg K2ATP in einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch und fügen Sie 1 mL Molekularbiologie Grade Wasser dann fügen Sie 50 mL-Tube hinzu.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2-7,4 mit 1 M KOH. Sicherstellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 283-289 mOsm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Slice-Vorbereitung
<ol><li>
Werkzeuge vorzubereiten
	<ol>
<li>Die Recovery-Kammer (gebaut von einem 250 mL-Becherglas mit 4 Brunnen und Netting) 200 mL ACFS hinzu, und legen Sie die Recovery-Kammer in einem Wasserbad (35 ° C).</li>
		<li>Die Kammer mit einer Paraffin-Folie abdecken und Blase ständig der ACFS mit 95 % O25 % CO2 mit einer Glas-Verteilerrohr für mindestens 20 Minuten.</li>
		<li>Die Zerlegung durch das Einrichten der Werkzeuge (Skalpell, abgewinkelte feine Schere, Pinzette, feine Pinsel, Plastiklöffel) vorbereiten.</li>
		<li>Füllen Sie eine 60 mL-Spritze mit ca. 15 mL der eiskalte slicing Lösung aus Schritt 1.1.4.</li>
		<li>Bereiten Sie die Dissektion Plattform, indem ein Filterpapier auf den Deckel des well-Platte.</li>
		<li>Bereiten Sie die Slice Kammer indem du es in die Schale und das Tablett mit Eis füllen.</li>
		<li>Richten Sie die Vibratome durch die Sicherung einer Einweg Klinge in den Klingenhalter.</li>
		<li>Machen Sie eine Transferpipette durch die Spitze einer Pasteurpipette brechen und platzieren ein Gummiball über die gebrochene Ende.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gehirn der Maus zu sezieren
	<ol>
<li>Betäuben Sie das Tier in einer Kammer mit 4 % Isofluran gesättigt, bis spinale Reflexe fehlen.</li>
		<li>Das Tier mit einer Guillotine enthaupten und schnell das Gehirn zu entfernen.<ol>
<li>Machen Sie einen Mittellinie Einschnitt mit einer Skalpellklinge Nr. 22 von rostral zur kaudalen.</li>
			<li>Schälen Sie die Kopfhaut seitlich auf jeder Seite des Kopfes.</li>
			<li>Verwendung feine Schere, schneiden Sie den Schädel auf der einen Seite von kaudalen rostral (darunter auch die Seite der Stirnbeine), Verwendung Vorsicht nicht auf das Gehirn schädigen.</li>
			<li>Verwendung Zangen, heben Sie das Stück Schädel aus Gehirn und schnell abkühlen das Gehirn mit 15 mL eiskaltes slicing-Lösung mit der Spritze aus Schritt 2.1.4.</li>
			<li>Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel.</li>
			<li>Ort des Gehirns in einem der Becher gefüllt mit eiskalten slicing-Lösung (aus Schritt 1.1.4) sprudelte mit 95 % O25 % CO2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Scheiben von Maus Hypothalamus vorbereiten
	<ol>
<li>Das Gehirn für die gewünschte Hirnareal zu blockieren und Schnittwinkel (z. B. für koronalen Hypothalamus Scheiben schneiden Sie das Gewebe rostral zur optischen Chiasmus und caudale, der Pons mit einer Klinge und der kaudalen Block hat eine flache Oberfläche senkrecht auf der Basis des Gehirns zu gewährleisten).</li>
		<li>Mit einer geschnittenen Stück Filterpapier, das Gehirn von der vorderen Seite holen und die hintere Seite das Halteblech mit Sekundenkleber verkleben.</li>
		<li>Schnell das Halteblech in das slicing Kammer und füllen Sie die Kammer mit slicing Lösung aus den zweiten Becher im Schritt 1.1.4.</li>
		<li>Das Slice Kammer und Eis Fach auf der Vibratome zu sichern.</li>
		<li>Definieren Sie den Schneid Bereich (Front- und Seitenzahnbereich zum Gehirn) und beginnen Sie, 250 µm Dicke koronalen Scheiben schneiden. Empfohlene Parameter: 0.10 mm/s, Amplitude Geschwindigkeit 2 mm.</li>
		<li>Schneiden Sie die Scheiben auf die entsprechende Größe für die gewünschte Hirnareal.</li>
		<li>Die Scheiben bei 35 ° C für 30-45 min zu erholen. Dann entfernen Sie die Recovery-Kammer aus dem wärmenden Bad und ermöglichen die Scheiben bei Raumtemperatur für eine zusätzliche 30 min. halten Scheiben bei Raumtemperatur für den Rest des Tages erholen und weiterhin das Bad ständig mit 95 % O25 % Blase CO2 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Whole-Cell Patch ClampRecording
<ol><li>
Ziehen Sie die Patch-Pipetten
	<ol>
<li>Mit den vorgeschlagenen Parametern für die Aufnahme aus der Pipette Abzieher Handbuch ganz-Zelle ziehen Sie Patch Pipetten aus dicken Mauern umgebene Glas eine Pipette Widerstand von 3-5 MΩ.</li>
		<li>Mit Hilfe einer Microsyringe (kommerzielle oder hausgemachte), Füllung einer Pipettenspitze mit gefilterten interne Lösung. Eine Microsyringe machen, brennen die Spitze eine 1 mL Spritze und ermöglichen die Spitze zu schaffen fallen eine lange feine Spitze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Die ganz-Zell Konfiguration zu erhalten
	<ol>
<li>Legen Sie die Aufnahme Pipette direkt über die Scheibe und Offset Pipette in Klammer Spannungsmodus aktuell. Leichten positiven Druck auf die Pipette und sperren den Absperrhahn.</li>
		<li>Wählen Sie eine gesunde Zelle mit einer intakten Membrane und nähern Sie sich die Zelle mit der Pipette. Der Überdruck sollte dazu führen, dass eine leichte Störung im Gewebe (z. B. eine langsame Welle im Gewebe bei der Eingabe).</li>
		<li>Weiterhin langsam auf die Zelle mit diagonalen Bewegungen, bis die Pipette ein kleines Grübchen auf der Zelloberfläche bildet die Pipette näher zu bringen.</li>
		<li>Die Überdruck-Sperre. Die Zelle beginnt, eine Dichtung zu bilden und der Widerstand steigt über 1 GΩ. In Spannung Klemme, halten die Zelle am-68 mV.</li>
		<li>Ziehen Sie leicht weg von der Zelle diagonal, Überdruck aus der Zelle zu entfernen.</li>
		<li>Für die schnellen und langsamen Pipette Kapazität zu kompensieren.</li>
		<li>Anwenden einer kurzen Absaugung durch das Rohr an der Pipette Halter zu brechen durch die Zelle ganz-Zell Konfiguration angeschlossen.</li>
		<li>Umstellung auf Zelle Modus auf der Membran testen Fenster in eine Elektrophysiologie Datenerfassung und Analyse-Software (z.B., Clampex).</li>
		<li>Durchführen Sie vor jeder Spannung Klemme Aufnahme einen Membran-Test mit der gleichen Software und erfassen Sie die relevanten Parameter in einem Labor-Buch (Membran Widerstand, Zugang Widerstand und Kapazität).</li>
		<li>Behalten Sie die Temperatur des Bades Aufnahme bei 27-30 ° C und die Durchflussmenge bei 1,5-2,0 mL/min für spätere Experimente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Vielfalt Experimente
<ol><li>
Experiment 1: Schätzung Multiplizität mit 4-AP
	<ol>
<li>In Spannung Klemme, halten die Zelle am-68 mV. Mit der gleichen Software, Aufzeichnen der sEPSCs während das Bad mit niedrigen Ca2 + ACFS Vorrichtung. Rekord für mindestens 5 Minuten nach dem Start des ganz-Zell Konfiguration um eine stabile Basislinie Aufnahme zu gewährleisten, da die synaptische Aktivität kurz nach dem Durchbruch der Membran hoch sein kann.</li>
		<li>Mit einer Mikropipette hinzu der ACFS 4-AP und Bad gelten 30 µM 4-Fewo Datensatz sEPSCs für mindestens 10 Minuten bis die volle Wirkung zu erhalten.</li>
		<li>Der ACFS mit 4-AP fügen Sie 0,5 µM TTX und 10 µM Cd2 hinzu + und zeichnen Sie der mEPSCs mindestens 10 min lang auf.</li>
		<li>Verwenden Sie für offline-Analyse die letzten 1 min Baseline unmittelbar vor der Anwendung von 4-AP (in niedrigen Ca2 + ACFS), 10. min 4-AP-Anwendung und der 10. min TTX Anwendung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Experiment 2: Synchronisierung Vesikel Version mit Sr2 +
	<ol>
<li>Während das Bad mit normalen Ca2 + ACFS (das gleiche wie das Bad ACFS) Rekord sEPSCs für mindestens 5 min Vorrichtung.</li>
		<li>Wechseln Sie von der normalen Ca2 + ACFS und beginnen Sie Vorrichtung Sr2 + ACFS (aus Schritt 1.4) und Rekord sEPSCs.</li>
		<li>Vergleichen Sie für offline-Analyse um festzustellen, ob die große Amplitude sEPSCs durch die synchrone Freisetzung von Vesikeln sind, die letzten 1 min Baseline (im normalen ACFS) inder 10 Minute Sr2 + ACFS Anwendung .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Experiment 3: test für multivesicular Version Γ- DGG
	<ol>
<li>In niedrigen Ca2 + ACFS Rekord sEPSCs mindestens 5 min lang.</li>
		<li>Der ACFS durch die Perfusion System 30 µM 4-AP hinzufügen. Rekord sEPSCs mindestens 10 min lang.</li>
		<li>Der ACFS mit 4-AP 200 µM γ-DGG hinzu und zeichnen Sie der sEPSCs mindestens 10 min lang auf.</li>
		<li>Wie ein Kontrollexperiment in einer eigenen Zelle führen Sie Schritte 1-3, aber gelten eine niedrige Konzentration (125 nM) des DNQX anstelle von γ-DGG.</li>
		<li>Analysieren Sie für offline-Analyse die letzte min jeder Droge-Anwendung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Experiment 4: Stimulieren Sie afferenten Inputs um Aktionspotential abfeuern zu erhöhen.
	<ol>
<li>Rekord sEPSCs in normalen Ca2 + ACFS.</li>
		<li>Stimulieren Sie die Afferenzen mit einer monopolaren Glaselektrode gefüllt mit ACFS mit einer Rate von 20 Hz für 2 s und wiederholen Sie 10-Mal mit einem Inter Platzen Intervall von 20 sec.</li>
		<li>Für die Analyse 5.000 ms vor dem ersten Impuls als Grundlage zu verwenden und im Vergleich zu den 10-300 ms nach der endgültigen Reiz und dann die durchschnittliche Veränderung der Amplitude und Frequenz über 10 Versuche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Analyse
<ol><li>Analysieren Sie sEPSCs und mEPSCs mit einem Programm, die erkennt und analysiert synaptische Ströme (z. B. Mini-Analyse-Software).<ol>
<li>Mit dieser Software, verwenden Sie die empfohlene Erkennung Parameter zur Erkennung von AMPA-Rezeptor-EPSCs (oder GABA-Rezeptor-EPSCs bei hemmende Strömungen einer Aufnahme).</li>
		<li>Verwenden Sie die Nonstop Analysefunktion , um EPSCs in der Aufnahme zu erkennen.</li>
		<li>Manuell scannen jede Aufnahme um sicherzustellen, das Programm wird jedes Ereignis genau erkennen (z. B. sorgen Veranstaltungen werden nicht verpasst oder doppelt gezählt).</li>
		<li>Exportieren Sie die Ereignisdaten zu, indem Sie Sie in die Zwischenablage kopieren und fügen Sie ihn in ein Daten-Management-Software (z. B. Excel)</li>
		<li>Berechnen Sie die durchschnittliche Frequenz oder Amplitude für jede medikamentöse Behandlung und durchzuführen Sie relevanten statistische Analysen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben

Eine wichtige Voraussetzung für eine erfolgreiche Patch Clamp Elektrophysiologie Experiment ist gesunde Scheiben/Zellen erhalten. Unsere beschriebenen Protokoll ist optimiert für Hypothalamus Scheiben, die PVN Neuronen enthalten. Anderen Gehirn benötigten Bereichen modifizierte Lösungen und slicing Methoden21,22,23,24. Für die Aufnahme ist es wichtig, stabile Aufnahmen akzeptieren nur durch stä...

Synaptische Übertragung ist ein grundlegender Mechanismus für die Kommunikation zwischen den Neuronen, und daher Gehirnfunktion. Synaptische Übertragung ist auch labil und kann seine Wirksamkeit eine aktivitätsabhängige ebenso wie in Reaktion auf modulierende Signale1ändern. So wurde das synaptischen Funktion untersuchen ein Schlüsselfokus der neurowissenschaftlichen Forschung. Ganze Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie ist eine vielseitige Technik, die uns zu verstehen, durch Erarbeitung experimenteller Designs und Datenanalysen, detaillierte biophysikalische und molekulare Mechanismen der synaptischen Übertragung ermöglicht. Ein häufig verwendeter Ansatz vielleicht aufgrund der Einfachheit der Technik und Konzept, ist die Messung der Miniatur exzitatorischen/inhibitorischen postsynaptischen Ströme (mE / IPSCs) unter Spannung Klemme Konfiguration2,3, 4 , 5 , 6. einzelne mPSCs repräsentieren den Fluss von Ionen durch Ionotropic postsynaptischen Rezeptoren (z. B. AMPA und GABA-A -Rezeptoren) in Reaktion auf die Bindung von ihren jeweiligen Neurotransmitter aus den präsynaptischen Terminal 7 freigegeben . Da die Aufnahme im Beisein der Voltage-gated Na+ -Kanal-Blocker Tetrodotoxin (TTX) vorliegt, das Release ist Aktionspotential-unabhängig und beinhaltet normalerweise eine einzelne synaptische Vesikel, die Neurotransmitter enthält. Ausgehend von dieser Annahme, ist die durchschnittliche Amplitude der mPSCs allgemein als grobe Schätzung für die Quanten Größe verwendet, die steht für die Anzahl und die Funktionalität der postsynaptischen Rezeptoren gegen eine single-Auskopplung-Website. Auf der anderen Seite gilt als die Frequenz des mPSCs, eine Kombination aus der Gesamtzahl der Synapsen auf der postsynaptischen Zelle und Eintrittswahrscheinlichkeit durchschnittliche Freigabe beenden zu vertreten. Diese Parameter messen jedoch nicht eine weitere Variable Multiplicativity von Synapsen und synaptische Vielfalt – das ist wichtig für die Effizienz der synaptischen Übertragung.
Basierend auf der Quanten Theorie der synaptischen Übertragung7,8,9, die Stärke einer gegebenen Verbindung zwischen zwei Neuronen ist abhängig von drei Faktoren: die Anzahl der funktionellen Synapsen (N), die postsynaptischen Reaktion auf die Veröffentlichung einer einzigen synaptischen Vesikel (Quanten Größe; Q) und die Wahrscheinlichkeit der Freisetzung von Neurotransmittern (P-R). Synaptische Multiplizität ist äquivalent zu N. Die Entwicklung der synaptischen Vielheit oder das Beschneiden der multiplikativen Synapsen ist Kunststoff während der Entwicklung und in anderen Krankheit Staaten3,4,6,10. Aus diesem Grund hat Charakterisierung synaptischen Vielzahl wichtige Implikationen für die Effizienz der synaptischen Übertragung in Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Techniken, wie z. B. Elektronenmikroskopie können strukturelle Beweise der synaptischen Multiplizität identifizieren, indem er erkennt mehrere synaptischen Kontakte mit Ursprung aus dem gleichen Axon auf der gleichen postsynaptischen Neuron-11,12, 13,14. Diese strukturell identifizierten Multisynapses kann jedoch funktional Stille15,16. Genaue funktionelle Untersuchung des N erfordert technisch anspruchsvolle elektrophysiologische Ansätze wie gekoppelten ganz-Zell-Aufnahmen, die erkennen, ob eine bestimmte Verbindung mehrerer Standorte der funktionalen Release hat und minimale Stimulation-Ansätze, die darauf abzielen, ein einziges vermeintliche Axon zu rekrutieren.
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode für die Schätzung der synaptischen Vielfalt durch die Annahme einer Methode, die ursprünglich von Hsia Et al.2entwickelt. Diese Technik beinhaltet die Messung der spontanen PSCs (sPSCs) und mPSCs mit ganze Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie, was uns erlaubt, die Schätzung des synaptischen Vielfalt über alle Eingaben für ein bestimmtes Neuron.  Da zuvor definierten, synaptische Mannigfaltigkeit die Anzahl der Synapsen zwischen eines bestimmten Prä- und postsynaptischen Neurons widerspiegelt. Wenn mehrere Synapsen synchron durch ein Aktionspotential rekrutiert werden, werden mit hoher Wahrscheinlichkeit zeitliche Summierung der einzelnen (d.h. Quanten) EAP, erzeugen eine größere Amplitude PSC.  MPSC Aufnahmen (in denen Aktionspotentiale durch TTX blockiert sind), die Wahrscheinlichkeit der zeitliche Summierung der einzelnen (nicht-synchrone) mPSCs ist gering. Mit dieser Begründung, werden synaptische Multiplizität abgeschätzt durch den Vergleich der sPSC Amplitude (mit Aktionspotential-abhängige Version) auf die mPSC Amplitude.
Um die Existenz der Multiplizität untersuchen beschreiben wir vier Experimente und ihre Analysen mit glutamatergen EPSCs als Beispiel. Jedoch kann der gleiche Ansatz verwendet werden, für die schnelle Übertragung der GABAergen/glycinergen (IPSCs). Eine kurze Begründung für jedes Experiment wird nachfolgend beschrieben. Zunächst, wie oben erläutert, synaptische Multiplizität abgeschätzt werden durch den Vergleich der Amplitude der sEPSCs zu mEPSCs. Es gibt zwei Anforderungen für diesen Ansatz; (1) präsynaptischen Axone müssen eine ausreichende Anzahl von Aktionspotentialen Feuer, während der Aufnahme, und (2) PR muss hoch sein, so dass mehrere Synapsen Neurotransmitter bei der Ankunft ein Aktionspotenzial freigeben. Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, sEPSCs sind zuerst aufgenommen in niedrigen Ca2 + künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS), und dann in der Gegenwart eine niedrige Konzentration von K+ -Kanal-Antagonisten, 4-Aminopyridine (4-AP) Aktion erhöhen möglichen Zündung und PR. Dann feuern Aktionspotential TTX und Pr sank um ein Voltage-gated Ca2 + -Kanal-Blocker Cd2 +wehrt. Die Amplitude der sEPSCs (mit 4AP) ist im Vergleich zu der mEPSC (mit 4AP, TTX und Cd2 +). Im zweiten Experiment ist Ca2 + äquimolaren Sr2 + in der ACFS, Vesikel Release Synchronisierung abgelöst. Als Ca2 + für die synchrone Version von Vesikeln erforderlich ist, sollte Ersatz mit Sr2 + großer Amplitude sEPSCs beseitigen, die Vielheit bezeichnend sind. Drittens, mechanistisch, Multiplizität kann ergeben sich aus entweder mehrere synaptischen Kontakte gleichen postsynaptischen Neuron oder multivesicular Version (d. h. mehrere Bläschen innerhalb einer einzigen synaptischen Kontakt freigegeben)17,18. Um zwischen den beiden Arten der Vielheit zu unterscheiden, verwendet das dritte Experiment eine geringe Affinität, schnelle trennendem kompetitiver Antagonist des AMPA-Rezeptoren, γ-D-Glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , um festzustellen, ob groß sEPSC sind das Ergebnis der zeitliche Summation der unabhängigen Synapsen oder multivesicular Version, die auf einer überlappenden Bevölkerung der postsynaptischen Rezeptoren. Im Falle großer Amplitude Veranstaltungen von multivesicular Release werden γ-DGG weniger effektiv bei der Hemmung größer im Vergleich zu kleineren sEPSCs während der großen sEPSCs, die durch die zeitliche Summierung von mehreren synaptischen Kontakte entstehen in ähnlicher Weise betroffen sind Γ-DGG. Im vierten Versuch ist eine physiologische Methode zum Aktionspotential brennen, nämlich afferenten synaptic Stimulation zu erhöhen. Platzt der synaptischen Aktivität können vorübergehend erhöhen/die spontane Aktionspotential abfeuern und Freigabe Wahrscheinlichkeit angeregten Afferenzen erleichtern. Dieser Ansatz ermöglicht daher Multiplizität in physiologischer Weise manifestieren.
Das folgende Protokoll beschreibt die Methode für die Durchführung dieser Experimente im Hypothalamus Gewebe Maus. Insbesondere werden Corticotropin releasing Hormon (CRH) Neuronen des Nucleus paraventrikulären des Hypothalamus (PVN) verwendet. Wir beschreiben die Verfahren für die Durchführung der gesamten Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie und erläutern die spezifischen Experimente für synaptische Vielheit zu testen.

<table><tbody><tr><td>1 mL Spritze</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 Klingen</td><td>Fisher Scientific/andere</td><td>35698</td><td></td></tr><tr><td>22 Klingen</td><td>VWR/andere</td><td>21909-626</td><td></td></tr><tr><td>22 &mu; M Spritzenfilter</td><td>Milipore</td><td>09-719-000</td><td></td></tr><tr><td>Adson foreceps</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8547</td><td></td></tr><tr><td>Abgewinkelte scharfe Schere</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8437</td><td></td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10</td><td></td></tr><tr><td>Doppelschneidige Klinge</td><td>VWR</td><td>74-0002</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Sigma/andere</td><td>1001090</td><td></td></tr><tr><td>Feiner Pinsel</td><td>Fisher/diverse</td><td>15-183-35/diverse</td><td></td></tr><tr><td>Gasdispersionsrohr</td><td>VWR</td><td>LG-8680-120</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Fresenius Kabi/andere</td><td>M60303</td><td></td></tr><tr><td>Krazy Kleber</td><td>diverse</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>Mini Analyse</td><td>Synaptosoft</td><td>MiniAnalysis 6</td><td></td></tr><tr><td>Osmomoter</td><td>Wescor Inc</td><td>Modell 5600</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipette</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>ph meter</td><td>Mettler Toledo</td><td>FE20-ATC</td><td></td></tr><tr><td>Gummibirne</td><td>VWR</td><td>82024-550</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff Nr. 3</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8350</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff Nr. 4</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8356</td><td></td></tr><tr><td>Einschneidige Klinge</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Slicer</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Wasseraufbereitungssystem</td><td>Millipore</td><td>Milli-Q Academic A10</td><td></td></tr><tr><td>Well Plattendeckel</td><td>Fisher/diverse</td><td>07-201-590/verschiedene</td><td></td></tr><tr><td><starke>Chemikalien/Reagenzien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-AP</td><td>Sigma</td><td>275875</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Molekularsonden</td><td>B1204</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*2H2</td><td>O Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CdCl2</td><td>sigma</td><td>202908</td><td></td></tr><tr><td>DNQX</td><td>Tocris</td><td>189</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>K2-ATP</td><td>Sigma</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>K-Gluconat</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2*6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Molekularbiologische Qualität Wasser</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>Na-gluconat</td><td>Sigma</td><td>S2054</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>71504</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>SrCl</td><td>Sigma</td><td>255521</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Bioshop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Alamone Labs</td><td>T-550</td><td></td></tr><tr><td>yDGG</td><td>Tocris</td><td>6729-55-1</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der synaptischen multiplizität mit whole-cell patch-clamp-elektrophysiologie

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In das zentrale Nervensystem bilden ein paar Neuronen oft mehrere synaptischen Kontakte und/oder funktionalen Neurotransmitter Freisetzungsstandorten (synaptische Multiplizität). Synaptische Vielheit ist aus Kunststoff und Änderungen während der Entwicklung und in verschiedenen physiologischen Bedingungen, wird ein wichtiger Faktor für die Effizienz der synaptischen Übertragung. Hier erläutern wir Experimente für die Schätzung des Grades der Vielzahl von Synapsen auf einen bestimmten postsynaptischen Neuron mit ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten zu beenden. Insbesondere ist Voltage-Clamp-Aufnahme verwendet, um die Differenz zwischen der Amplitude des spontanen exzitatorischen postsynaptischen Ströme (sEPSCs) und Miniatur exzitatorischen postsynaptischen Ströme (mEPSCs) zu vergleichen. Die Theorie hinter dieser Methode ist, dass afferenten Inputs, die Vielfalt zu zeigen große, Aktionspotential-abhängigen sEPSCs durch die synchrone Version angezeigt werden, die bei jedem synaptischen Kontakt auftritt. Im Gegensatz dazu wird Aktionspotential-unabhängige Version (das asynchrone) kleiner Amplitude mEPSCs generieren. Dieser Artikel beschreibt eine Reihe von Experimenten und Analysen, die Existenz der synaptischen Vielheit zu charakterisieren und beschreibt die Anforderungen und Grenzen der Technik. Diese Technik kann angewendet werden, wie verschiedene Verhaltensstörungen, pharmakologische oder ökologischen Eingriffe in Vivo betreffen die Organisation der synaptischen Kontakte in verschiedenen Gehirnregionen zu untersuchen.

Das obige Protokoll beschreibt eine Methode für die Verwendung von ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie, um den Grad der synaptischen Vielfältigkeit, mit der Maus Hypothalamus Neuronen als Beispiel zu untersuchen. Diese Scheibe Präparationstechnik sollte gesunde vitaler Zellen ergeben, die nicht über eine geschwollene Membran oder Kern (Abbildung 1). Jeder Schritt im Protokoll ist wichtig für die Gesundheit des Gewebes und der Qualität der Aufnahmen.
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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Beurteilung der funktionalen synaptischen Mannigfaltigkeit mit ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten.

Bewertung der synaptischen Multiplizität mit Whole-Cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Im Gehirn bilden ein Paar Von Neuronen oft mehrere synaptische Kontakte, die als synaptische Multiplizität bezeichnet wird. Eine genaue Untersuchung der synaptischen Vielfältigkeit erfordert jedoch technisch anspruchsvolle Experimente. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur groben Abschätzung der synaptischen Multiplizität mit Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie.Diese Methode kann auf jede Art und Gehirnbereich angewendet werden, um synaptische Vielfalt zu untersuchen. Diese Methode erfordert Grundfertigkeiten in der Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie. Die Beschaffung hochwertiger Aufnahmen mit geringem und stabilem Zugriffswiderstand ist für die genaue Interpretation der Daten von entscheidender Bedeutung.Um eine Ganzzellenkonfiguration zu erhalten, legen Sie die Aufnahmepipette knapp über der Scheibe und den Offsetpipettenstrom in den Spannungsklemmenmodus. Tragen Sie leichten positiven Druck auf die Pipette auf, und verriegeln Sie den Hahn. Wählen Sie als Nächstes eine gesunde Zelle mit einer intakten Membran aus und nähern Sie sich mit der Pipette dem Gewebe.Der positive Druck sollte eine leichte Störung des Gewebes verursachen. Bringen Sie die Pipette in einer diagonalen Bewegung langsam näher an die Zelle heran, bis sich auf der Zelloberfläche ein kleines Grübchen bildet. Lösen Sie dann die positive Drucksperre.Die Zelle beginnt, eine Dichtung zu bilden, und der Widerstand wird über einem Gigaohm steigen. In Spannungsklemme halten Sie die Zelle bei minus 68 Millivolt. Ziehen Sie anschließend die Pipette leicht diagonal von der Zelle weg, um überdendruckbaren Druck zu entfernen.Kompensieren Sie die schnelle und langsame Pipettenkapazität. Tragen Sie eine kurze Absaugung durch das Rohr auf, das mit dem Pipettenhalter verbunden ist, um die Zelle zu durchbrechen und eine Ganzzellkonfiguration zu erhalten. Wechseln Sie dann in einer elektrophysiologischen Datenerfassungs- und Analysesoftware in den Zellmodus im Membrantestfenster.Halten Sie die Temperatur des Aufnahmebades bei 27 bis 30 Grad Celsius und die Durchflussrate bei 1,5 bis zwei Milliliter pro Minute für nachfolgende Experimente. In einer Multiplizitätssynapse synchronisiert ein Aktionspotenzial die Freisetzung von Neurotransmittern und erzeugt einen größeren postsynaptischen Strom. Blockierendes Wirkungspotenzial und kalziumabhängige vesikuläre Freisetzung mit TTX und Cadmium verhindert die postsynaptische Stromsumsumation und verringert die Amplitude.Wenn es keine Multiplizität gibt, ändert das Blockieren des Aktionspotenzials die Amplitude nicht. In Experiment eins, um die Multiplizität zu schätzen, halten Sie die Zelle bei minus 68 Millivolt, während Sie sie mit niedrigem Kalzium-aCSF durchdringen. Zeichnen Sie die spontanen EPSCs für mindestens fünf Minuten auf, um eine stabile Ausgangsbasis zu gewährleisten.Als nächstes fügen Sie 30 Mikromolaren 4-AP zum aCSF hinzu, um handlungspotentialabhängige Ereignisse zu erhöhen, und zeichnen Sie spontane EPSCs für mindestens 10 Minuten auf, um die volle Arzneimittelwirkung zu erzielen. Fügen Sie dann 0,5 Mikromolaren TTX und 10 Mikromolaren Cadmium zum aCSF mit 4-AP hinzu und nehmen Sie die Miniatur-EPSCs für mindestens 10 Minuten auf. Für die Offline-Analyse verwenden Sie die letzte 1 Minute der Baseline unmittelbar vor der Anwendung von 4-AP, die 10. Minute der 4-AP-Anwendung und die 10. Minute der TTX-Anwendung.In diesem Experiment wird extrazelluläres Kalzium durch Strontium ersetzt, um die Freisetzung synaptischer Vesikel zu desynchronisieren. Wenn eine Multiplizität vorhanden ist, sollte dies daher die Amplitude postsynaptischer Ströme verringern. In Experiment zwei nehmen Sie spontane EPSCs für mindestens fünf Minuten auf, während sie die Zelle mit normalem Kalzium aCSF durchdringen.Um die Freisetzung von Vesikel zu desynchronisieren, beginnen Sie mit der Durchlässigung der Zelle mit Strontium aCSF und nehmen Sie spontane EPSCs auf. Um zu ermitteln, ob die spontanen EPSCs mit großer Amplitude auf die synchrone Freisetzung von Vesikeln zurückzuführen sind, vergleichen Sie die letzte Minute der Baseline mit der 10. Minute der Strontium-aCSF-Anwendung. Die Multiplizität kann eine multivesikuläre Freisetzung beinhalten, die eine höhere Neurotransmitterkonzentration in der synaptischen Spalte verursacht.Die Zugabe von Gamma-DGG, einem AMPA-Rezeptor-Antagonisten mit geringer Affinität, führt zu einer weniger wirksamen Hemmung größerer multiquantaler Ströme im Vergleich zu kleineren uniquantalen postsynaptischen Strömen. Ohne multivesikuläre Freisetzung wird Gamma-DGG bei größeren und kleineren postsynaptischen Strömen gleichermaßen wirksam sein. In Experiment drei, um die multivesikuläre Freisetzung zu testen, nehmen Sie spontane EPSCs in low-calcium aCSF für mindestens fünf Minuten auf.Fügen Sie 30 Mikromolaren 4-AP über das Perfusionssystem zum aCSF hinzu. Nehmen Sie die spontanen EPSCs für mindestens 10 Minuten auf. Fügen Sie dann 200 Mikromolaren Gamma-DGG zum aCSF mit 4-AP hinzu und zeichnen Sie die spontanen EPSCs für mindestens 10 Minuten auf.Als Kontrollexperiment in einer separaten Zelle wiederholen Sie die Prozeduren, wenden jedoch eine niedrige Konzentration von DNQX anstelle von Gamma-DGG an. Für die Offline-Analyse, analysieren Sie die letzte Minute jeder Anwendung. Ausbrüche synaptischer Aktivität können vorübergehend spontane Aktionspotenziale erhöhen, die die Wahrscheinlichkeit der stimulierten Afferents auslösen und loslassen.Wenn Neuronen eine Vielzahl aufweisen, sollte die Zunahme der Aktionspotentiale zu einer vorübergehenden Erhöhung der Amplitude postsynaptischer Ströme führen. In Experiment vier nehmen Sie spontane EPSCs in normalem Kalzium-aCSF auf. Um das Wirkungspotenzial zu erhöhen, stimulieren Sie die Afferents mit einer monopolaren Glaselektrode, die mit einer CSF-Rate von 20 Hertz für zwei Sekunden gefüllt ist, und wiederholen Sie 10 Mal mit einem Inter-Burst-Intervall von 20 Sekunden.Verwenden Sie für die Analyse 5.000 Millisekunden spontane EPSCs vor dem ersten Stimulus als Basiswert und vergleichen Sie die spontanen EPSCs von 10 bis 300 Millisekunden nach dem endgültigen Stimulus. Nehmen Sie dann die durchschnittliche Amplitude und Frequenzänderung über 10 Versuche. Analysieren Sie spontane EPSCs und Miniatur-EPSCs mit einem Programm, das synaptische Ströme erkennt und analysiert.Verwenden Sie die vorgeschlagenen Erkennungsparameter und die Nonstop-Analysefunktion, um AMPA-Rezeptor-vermittelte EPSCs zu erkennen. Scannen Sie jede Aufzeichnung manuell, um sicherzustellen, dass das Programm jedes Ereignis genau erkennt. Exportieren Sie die Ereignisdaten, indem Sie sie in die Zwischenablage kopieren, und fügen Sie sie in eine Datenverwaltungssoftware ein.Als Nächstes berechnen Sie die durchschnittliche Häufigkeit und Amplitude für jede medikamentöse Behandlung und führen Die relevanten statistischen Analysen durch. In einem hier gezeigten Beispiel erhöht 4-AP sowohl die Amplitude als auch die Frequenz spontaner EPSCs. Die nachfolgende Anwendung von TTX und Cadmium verringert sowohl die Amplitude als auch die Frequenz.Hier ist die Verteilung der spontanen EPSC-Amplitude aus der Aufnahme. In den hier untersuchten hypothalamischen Neuronen sind die Amplitude und Häufigkeit der Ausgangs- und TTX-Bedingungen identisch, was darauf hindeutet, dass die spontanen Basis-EPSCs nur sehr wenige handlungspotentialabhängige EPSCs enthalten. Dementsprechend können nachfolgende Experimente die Differenz zwischen Baseline und 4-AP vergleichen, um die Multiplizität zu messen.Die Stärke der synaptischen Übertragung kann vorübergehend durch Ausbrüche der synaptischen Aktivität erhöht werden. Um die Multiplizität unter physiologischeren Bedingungen zu untersuchen, kann eine afferent Stimulation verwendet werden, um die potenzielle Abschuss- und Freisetzungswahrscheinlichkeit der Wirkung zu erhöhen. Hier sind die Zusammenfassungen der spontanen EPSC-Frequenz- und Amplitudenänderungen nach synaptischer Stimulation.Stabile Aufnahmen sind für eine genaue Interpretation der Daten unerlässlich. Beschreiben Sie die Daten, wenn sich der Zugriffswiderstand während der Aufzeichnung um mehr als 20 % ändert, da dies die Analyse verwirren könnte. Dieses Protokoll bietet eine einfache Möglichkeit, die synaptische Multiplizität zu schätzen, die ein wichtiger Determinant der synaptischen Wirksamkeit und ihrer Plastizität unter verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik namens Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie, die eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Mauthner-Neuronen und anderen retikulospinalen Zellen in Zebrafischembryonen ist.

Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie: Eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Neuronen

Dieses Video demonstriert die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik in einem Maushirnschnitt. Diese Technik stellt eine stabile Verbindung zwischen Mikropipette und Neuronenmembran her, die weiter gestört wird, um eine Ganzzellkonfiguration zu etablieren, um die Gesundheit und physiologischen Reaktionen des Neurons zu untersuchen.

Etablierung einer Ganzzellkonfiguration durch die Patch-Clamp-Methode

Das Video demonstriert eine Methode zur Untersuchung der Erregbarkeit von neuronalen Zellen, die fluoreszierendes Protein exprimieren, mit einer Ganzzell-Patch-Stromklemme. Im Strom-Clamp-Modus werden Aktionspotentiale erzeugt, die auf neuronale Erregbarkeit hinweisen.

Untersuchung der Erregbarkeit fluoreszierender Neuronen mit einer Ganzzell-Patch-Klemme

Dieses Video zeigt, wie eine feine Pipette in der Nähe von Hirnschnitten positioniert wird, um eine Versiegelung mit einer neuronalen Zelle zu bilden. Durch den Sog wird die Zellmembran aufgebrochen, wodurch eine Ganzzell-Patch-Klemme entsteht, die Strommessungen für elektrophysiologische Experimente ermöglicht.

Etablierung einer Ganzzell-Voltage-Clamp-Konfiguration für elektrophysiologische Aufzeichnungen in Hirnschnitten

Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Aufnahmen bilden eine komplexe Aufgabe. Hier zeigen wir, wie durch die Automatisierung vieler Versuchsschritten ist es möglich, den Prozess zur qualitativen Verbesserung der Leistung und der Anzahl der Aufnahmen zu beschleunigen.

Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

Kortikaler Netzwerke werden von einem kleinen, aber vielfältige Reihe von hemmenden Inter gesteuert. Funktionelle Untersuchung von Inter erfordert daher gezielte Aufnahme und strenge Identifizierung. Hier beschrieben wird, ist ein kombinierter Ansatz, der Ganzzellableitungen von einzelnen oder synaptisch gekoppelten Paare von Neuronen mit intrazelluläre Markierung, Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

Pair-Aufzeichnungen sind simultane Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von zwei synaptisch verbundenen Neuronen, die eine präzise elektrophysiologische und pharmakologische Charakterisierung der Synapsen zwischen einzelnen Neuronen ermöglichen. Hier beschreiben wir die detaillierte Methodik und die Anforderungen für die Etablierung dieser Technik in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen in jedem Labor, das für Elektrophysiologie ausgestattet ist.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Patch-Clamp-Aufzeichnungen und gleichzeitige intrazelluläre Biocytin-Füllung von synaptisch gekoppelten Neuronen in akuten Hirnschnitten ermöglichen eine korrelierte Analyse ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften. Ziel dieses Protokolls ist es, die wesentlichen technischen Schritte der elektrophysiologischen Aufzeichnung von neuronalen Mikroschaltkreisen und deren anschließende morphologische Analyse zu beschreiben.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

Dieses Protokoll beschreibt grundlegende Verfahrensschritte für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen durchführen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung des elektrischen Verhaltens von Neuronen, und wenn in Hirnschnitten durchgeführt wird, ermöglicht die Bewertung verschiedener neuronaler Funktionen von Neuronen, die in relativ gut erhalten Gehirn Schaltungen noch integriert sind.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Die Slice-Patch-Clamp-Technik ist eine wirksame Methode zur Analyse von lernen-induzierte Veränderungen der inhärenten Eigenschaften und Plastizität der erregenden oder hemmenden Synapsen.

Slice-Patch-Clamp-Technik für die Analyse von Learning-induzierte Plastizität

Lernen Sie die Whole-Cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie zur Bewertung synaptischer Multiplizität in Neuronen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung synaptischer Dynamik und Plastizität in verschiedenen Gehirnregionen.

Bewertung der synaptischen Multiplizität mit Whole-Cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie

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