VirWaTest, eine Point-of-Use-Methode zum Nachweis von Viren in Wasserproben

Enterische Viren finden sich meist in verschiedenen Wasserreservoirs, einschließlich Grundwasser, Stillwasser, Bächen, Flüssen und r Wasser. Sie sind mit Gesundheitsrisiken verbunden und sind für Infektionen beim Menschen verantwortlich. Enterische Viren verursachen häufig Gastroenteritis und werden meist über den fäkal-oralen Weg übertragen.

Andere durch Wasser übertragene Krankheiten verursachen akute Hepatitis durch Hepatitis-A-Viren und Hepatitis-E-Viren, mit signifikanter Sterblichkeit, insbesondere in Bezug auf Hepatitis E bei Schwangeren. Die für humanitäre Kontexte vorgeschlagenen aktuellen Protokolle zur Überwachung der Wasserqualität wurden entwickelt, um Bakterien wie E.Coli als Indikator für die Fäkalienkontamination zu erhalten. Aber es ist bereits bekannt, dass es keine Korrelation mit anderen Mikroorganismen wie Viren gibt, die resistenter gegen viele Aktivierungsprozesse sind.

Bisher wurde der Nachweis von Viren in humanitären Krisensituationen durchgeführt, indem bestehende Protokolle an die Bedingungen dieser Kontexte angepasst und Proben an Referenzlaboratorien zur molekularen Erkennung von Viren versandt wurden. Es bedarf methodenweisen, um virale Krankheitserreger und Virusindikatoren im Standpunkt der Ansichten aufzuspüren, um die Risiken für die öffentliche Gesundheit zu verringern, Ausbrüche zu verhindern und die Effizienz humanitärer Interventionen zu erhöhen. Wir schlagen eine Methode zum Nachweis von Viren in 10-Liter-Wasserproben vor, die in drei Schritte unterteilt ist: Virale Konzentration, Nukleinsäureextraktion und Virusdetektion.

Alle diese Schritte wurden von den derzeit in unserem Labor angewandten Methoden angepasst und können in der Sicht mit tragbaren Reagenzien und Geräten durchgeführt werden, die die abhängigen Stromversorgungen und Gefriertruhen herstellen. Außerdem wurde der Methode eine Konservierungslösung hinzugefügt, um die Stabilität von Nukleinsäuren für den Versand an Referenzlaboratorien zu gewährleisten, falls erforderlich. Die von uns vorgeschlagene Methode heißt VirWaTest und wurde in Zusammenarbeit mit GenIUL und Intermon Oxfam entwickelt.

Vor dem Beginn sollte die Anzahl der zu prüfenden Proben für die Herstellung von Reagenzien und Material berücksichtigt werden. Es wird empfohlen, zwei Wiederholungen jeder Wasserprobe zu sammeln, um repräsentative Ergebnisse zu erhalten. Mehrere Proben können gleichzeitig getestet werden, wenn die entsprechende Materialmenge zur Verfügung steht.

Reagenzien und Materialien sollten vorbereitet und verpackt werden, bevor sie an den Ort transportiert oder versendet werden, an dem die Methode benötigt wird. Die Liste der Materialien und Kleingeräte, die verpackt werden sollten, ist in Tabelle 1 beschrieben. Bereiten Sie einen Bakteriophage MS2-Bestand vor, der jeder Wasserprobe als Prozesskontrolle hinzugefügt werden soll, indem Sie die entsprechende ISO-Methode befolgen.

Dann verteilen Sie 10 Mikroliter einer Suspension mit 10 bis 10 Plattformeinheiten vorgefertigt in 10 ml Rohre und lassen Sie das Wasser trocknen. Pro Wasserprobe wird ein Rohr benötigt. Bereiten Sie zusätzlich ein Rohr mit 10 mLs sterilem destilliertem Wasser pro entnommener Probe zu.

Für die vorgefloppte Magermilchlösung ein Rohr mit der Magermilch, einen Plastikbeutel mit dem Meersalz und eine Plastikflasche mit dem destillierten Wasser zubereiten. Zur pH-Einstellung ein Rohr mit der Zitronensäure, ein Rohr mit Natriumhydroxid und zwei Kunststoffbehälter mit 25 und 50 mLs destilliertem Wasser zubereiten. Für jede zu prüfende Wasserprobe einen Konditionsbeutel vorzubereiten, indem Sie die Meersalze und die Zitronensäure zu einer Reißverschluss-Plastiktüte hinzufügen, und eine Konservierungslösung durch Zugabe des Lysepuffers und des Nukleinsäure-Konservierungsmittels zu einem 5 ml-Rohr.

Schließlich bereiten Sie vier neutralisierende Beutel vor, die vier Reißverschluss-Plastiktüten mit Power-Waschmittel versehen. Für jede zu extrahierende Wasserprobe ein fünf ml Rohr mit magnetischen Partikeln und Ethanol sowie drei 2 ml-Rohre mit 500, 600 und 200 MikroliterWaschpuffern eins, zwei und drei und ein Rohr mit Elutionspuffer vorbereiten. Zwei verschiedene Nukleinsäureextraktionen können gleichzeitig in jedem PCR-Test analysiert werden, wenn ein Newell-Thermocycler verwendet wird.

Für alle PCR-Assays, bereiten molekularbiologisches Wasser. Bereiten Sie Mischungen vor, die zwei Primer und einen für jedes Zielvirus spezifischen Nachweis gemäß den im Protokoll beschriebenen Mengen und Konzentrationen enthalten. Fügen Sie für jedes Virus die angegebenen Volumina in die Röhren ein bis acht eines Röhrentabletts ein.

Schneiden Sie den Streifen, teilen Sie ihn in zwei Streifen. Rohre eins bis fünf und Rohre sechs bis acht. Für jedes Virus, lufttrockene DNA-Suspensionen mit 10 bis 5, 10 bis 7 und 10 bis 9 und bekannten Kopien vorgefertigt in Tuben sechs, sieben und acht.

Dieses Konzentrationsprotokoll basiert auf dem Prinzip der organischen Flockung, mit dem der niedrige pH- und hohe Leitfähigkeitszustand die Magermilchproteine dazu treibt, sich in Flocken zu organisieren, die die Viren absorbieren. Sobald die Flocken abgerechnet sind, können sie leicht abgeholt werden. Sammeln Sie eine 10-Liter-Wasserprobe in einem flachen Eimer mit Deckel versehen.

Wenn Sie aus einem Rohr sammeln, lassen Sie das Wasser für ein paar Sekunden laufen, bevor Sie das Wasser sammeln. Es ist wichtig, klare Eimer zu verwenden, um Pellets zu visualisieren. Suchen Sie nach einem flachen Raum an einem frischen Ort weit weg von direkter Sonneneinstrahlung Legen Sie einen magnetischen Rührer mit einer Batterie unter der Eimerstütze verbunden und legen Sie den Eimer mit der Wasserprobe auf jeden Träger.

Die Zitronensäure und das Natriumhydroxid überdenken und schütteln, bis sie vollständig gelöst sind. Gießen Sie 500 mLs destilliertes Wasser in einen Stand-up-Beutel und legen Sie den Beutel auf einen Magnetrührer. Den Inhalt eines Meersalzbeutels und den Inhalt eines Magermilchrohrs hinzufügen und fünf Minuten bei mittlerer Geschwindigkeit rühren.

Stellen Sie den pH-Wert der geflopculierten Magermilch mit Zitronensäure und Natriumhydroxid auf einen pH-Wert zwischen 3,4 und 3,6 ein. Schalten Sie den Magnetrührer aus und stellen Sie sicher, dass die Flocken sichtbar sind. Eine Taschenlampe kann bei der Visualisierung der Flocs helfen.

Lassen Sie einen Rührmagneten ins Wasser. Stellen Sie den Magnetrührer mit maximaler Geschwindigkeit ein und schalten Sie ihn ein. 10 mLs destilliertes Wasser in ein prozessgesteuertes Rohr geben.

Umkehren Sie es ein paar Mal und gießen Sie die Lösung in das Wasser. Den Inhalt eines Proben-Pflegebeutels ins Wasser gießen und fünf Minuten rühren. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert der Wasserprobe, die zwischen 3,4 und 3,6 liegen sollte.

Passen Sie den pH-Wert bei Bedarf an. 100 mLs vorgepekulierte Magermilchlösung hinzufügen, den Eimer mit dem Deckel versiegeln und das Wasser acht Stunden lang bei minimaler Geschwindigkeit rühren lassen. Schalten Sie nach acht Stunden den Magnetrührer aus und lassen Sie die Flocken sich für mindestens fünf zusätzliche Stunden begnügen.

Mit einem System, das auf der Verwendung eines Pipettenreglers, eines Kunststoffrohres und ein paar Pipetten basiert, entsorgen Sie den Überstand und achten Sie darauf, die Flocken auf dem Eimerboden nicht zu stören. Wenn der Wasserstand im Begriff ist, den Rührmagneten zu erreichen, drücken Sie das Kunststoffrohr, um den Wasserfluss zu stoppen und die Pipette aus dem Eimer zu entfernen. Schütteln Sie den Eimer, um die Flocken wieder aufzuhängen und gießen Sie sie in eine Stand-up-Plastiktüte.

Lassen Sie die Flocs für eine zusätzliche Stunde zu begleichen. Saugen Sie vorsichtig den Wasserüberstand mit einer Pipette, um die Flocken zu stören. Die Flocken mit einer Pipette ansaugen und in ein konisches Rohr übertragen.

Notieren Sie sich das Endvolumen des Probenkonzentrats und übertragen Sie 1 ml in ein Rohr, das die Konservierungslösung enthält. Die Suspension kann entweder zur Nukleinsäureextraktion vor Ort verwendet oder zur weiteren Analyse an ein Referenzlabor versandt werden. Das beim Sammeln der Flocken entsorgte Wasser muss vor der Entsorgung behandelt werden.

Fügen Sie den Inhalt eines neutralisierenden Agentenbeutels in den Eimer ein, der das ausrangierte Wasser enthält. Mischen Sie das Wasser und lassen Sie es noch für dreißig Minuten. Dann entsorgen Sie das behandelte Wasser als allgemeinen Abfall.

Die magnetischen Partikel können mit einer magnetischen Pipette von einem Rohr zum anderen übertragen werden. Gewöhnen Sie sich an den Betrieb einer magnetischen Pipette, bevor Sie die Extraktion durchführen. Ordnen Sie die Rohre, die das reagenz für die Extraktion in einem Rack erforderlich sind.

Das heißt, von links nach rechts: Bindungspuffer, Waschpuffer und Elutionspuffer. 1 ml Probenkonzentrat mit einer Einweg-Kunststoffpipette in das Rohr mit dem Bindungspuffer geben. Invertieren Sie das Rohr zehnmal, um die Lösung zu optimieren.

Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für zehn Minuten, während Sie kontinuierlich entweder mit einem Solo-Orbital oder manuell mischen. Sammeln Sie die magnetischen Partikel mit einer magnetischen Pipette und einer sauberen Spitze, die für die drei Waschpuffer wiederverwendet werden kann, und geben Sie die magnetischen Partikel in das Rohr mit Waschpuffer eins ab. Waschen Sie sie, indem Sie die Lösung mit der Spitze für dreißig Sekunden sanft schütteln und sammeln.

Wiederholen Sie diesen Waschvorgang für die Waschpuffer zwei und drei. Sammeln Sie die magnetischen Partikel im Waschpuffer drei und geben Sie sie in das Rohr mit dem Elutionspuffer ab. Dann entsorgen Sie die Spitze.

Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für fünf Minuten, während Sie kontinuierlich mit dem Solo-Orbital mischen. Ersetzen Sie die Spitze auf der magnetischen Pipette durch eine und sammeln Sie alle magnetischen Partikel aus dem Elutionspuffer. Entsorgen Sie die Spitze mit den Partikeln, die angehängt sind.

Die Nukleinsäure verbleibt im Elutionspuffer, der zur weiteren Analyse oder Verbringung gelagert werden sollte. Verwenden Sie einen Fünf-Rohr- und einen Drei-Rohr-Streifen, der zum Nachweis menschlicher Adenoviren vorbereitet ist. Fügen Sie Wasser, PCR-Mix und Nukleinsäure-Extration zu Den Röhrchen eins bis fünf nach dem Protokoll hinzu.

Danach Wasser und PCR-Mix zu den Röhren sechs bis acht hinzufügen. Legen Sie beide Streifen in den Thermocycler und wählen Sie den entsprechenden Lauf aus. Sobald die Ausführung abgeschlossen ist, sammeln Sie die Ergebnisse und analysieren Sie die erhaltenen Daten.

Nur wenn Virustests zu negativen Ergebnissen geführt haben, sollte die MS2-Erkennung durchgeführt werden. Verwenden Sie Rohrleisten, die für die MS2-Erkennung vorbereitet sind, und wählen Sie das entsprechende Wärmeprofil für die PCR aus. Die VirWaTest magnetische Nukleinsäureextraktion wurde mit QIAgen viraler RNA verglichen und durch Dassprossen von Wasserproben mit menschlichen Adenoviren und MS2 nachgeahmt.

Reduktionstest p-Wert zeigt deutlich höhere virale Wiederherstellungen mit VirWaTest als QiAgen als Extraktionsmethode für beide getesteten Viren. Die entwickelte Methode zur Viruskonzentration wurde in Zusammenarbeit mit Oxfam-Waschteams in Bangui, Zentralafrikanische Republik und in Pedernales, Ecuador, getestet, die Wasserproben sammelten, sie durch Anwendung der entwickelten Konzentrationsmethode konzentrierten und sie zur Nukleinsäureextraktion und viralen Quantifizierung ins Labor nach Barcelona schickten. In Ecuador wurden in allen getesteten Proben humane Adenoviren nachgewiesen, während eine von fünf in Bangui entnommenen und konzentrierten Proben positiv auf humane Adenoviren getestet wurde.

Die entwickelte Methode hat sich als nützlich erwiesen, als sie von Waschteams von Oxfam Intermon in Bangui, Zentralafrikanische Republik, und von einem anderen Team in Pedernales, Ecuador, bewertet wurde. VirWaTest kann Teil eines Frühwarnsystems sein oder bei der Untersuchung von Ausbrüchen von Organisationen verwendet werden, die an der Abwasserentsorgung beteiligt sind. Diese Ausrüstung erleichtert die Analyse viraler Krankheitserreger im Wasser und die Verbesserung des Wassersicherheitsmanagements mit dem Ziel, Vorfälle von Viruserkrankungen in humanitären Krisenkontexten zu reduzieren.