Name: In Vivo Direkte Reprogrammierung von Resident Glial Cells in Interneurons durch Intracerebral Injection of Viral Vectors (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Erfahren Sie die direkte Reprogrammierung von Gliazellen zu Interneuronen im Gehirn mittels AAV-Virusvektoren. Diese Methode ermöglicht die Generierung parvalbuminpositiver Neuronen für Forschung zu psychiatrischen Erkrankungen.

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Marcella Birtele wurde durch das Horizont 2020-Programm der Europäischen Union (H2020-MSCA-ITN-2015) im Rahmen der Innovativen Ausbildungsnetze von Marie Skodowska-Curie und der Finanzhilfevereinbarung Nr. 676408 finanziert. Daniella Rylander Ottosson wurde vom Schwedischen Forschungsrat (2017-01234) finanziert.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die direkte In-vivo-Reprogrammierung kann mit AAV FLEX-Vektoren in Cre-expressing-Mausstämmen erreicht werden. Es ist wichtig zu beachten, dass Unterschiede zwischen Denspezien in Bezug auf die Reprogrammierung der Wirksamkeit beobachtet wurden. Bei der In-vivo-Reprogrammierung im Striatum hat sich die NG2-Cre-Mauslinie im Vergleich zu anderen Stämmen als die effizientere erwiesen. Bevor Sie mit der Verwendung eines neuen tierischen Stammes beginnen, ist es wichtig, die Richtlinien des Mausanbieters bezüglich der Cre-Expression im Laufe der Zeit zu überprüfen, da das Alter der Tiere oft die Spezifität dieser Proteinexpression beeinflusst. In unseren Studien wurden Tiere, die älter als 12 Wochen waren, nicht für die In-vivo-Reprogrammierung verwendet, da ein Risiko für die Cre-Expression in anderen Zellen als NG2-Glia bestand. Die ständige Anwesenheit und Überwachung von Kontrolltieren, die nur mit Synapsin-FLEX-GFP-Konstrukt injiziert werden, wird empfohlen. Dies ermöglicht die Überwachung der Tiere auf GFP-positive Zellen, die nicht vorhanden sein sollten, wenn keine Reprogrammierungsgene (ALN) verwendet werden.
Um die neu neu programmierten Neuronen zu identifizieren, ist eine neuronspezifische Identifizierungsmethode, wie sie in diesem Protokoll beschrieben wird, von größter Bedeutung. Dies ermöglicht eine korrekte Identifizierung und Unterscheidung der umprogrammierten Neuronen von den endogenen umgebenden Zellen, die bei der Umprogrammierung in einer homotopischen Region von besonderer Bedeutung ist.
Es ist auch wichtig, die richtige Struktur für die virale Injektion zu zielen. Daher ist die stereotaxic Chirurgie für die virale Injektion wichtig und muss mit Genauigkeit angegangen werden, vor allem, wenn kleinere Strukturen des Gehirns gezielt.
Wir haben11 zuvor gezeigt, dass es nicht zuverlässig ist, das Ergebnis einer In-vivo-Reprogrammierung auf der Grundlage von In-vitro-Reprogrammierungsexperimenten unter Verwendung der gleichen Reprogrammierungsfaktoren vorherzusagen. Alle Faktoren von Interesse müssen daher in vivo getestet werden. In unseren Händen geben viele verschiedene Faktorkombinationen den gleichen Subtyp von Neuronen (d.h. Interneurons11 in vivo) trotz der Tatsache, dass diese Gene in die Entwicklung anderer Neuronen involviert sind.
Ganzzellige Patchklemme für neu programmierte Neuronen ist eine delikate Technik und Gewebeverarbeitung ist wichtig für ein gutes Ergebnis. Perfusion mit eiskalter Krebslösung verbessert die Gewebequalität. Auch geflickte Neuronen müssen sorgfältig behandelt werden. Auch wenn die Reifung und die phänotypische Identität von neu programmierten Neuronen mit einer ganzzelligen Pflasterklemme etwas beurteilt werden können, sind diese Zellen nicht vollständig mit ihren endogenen Gegenstücken vergleichbar. Zusätzliche Arten der Analyse, wie z. B. genomische Sequenzierung (z. B. RNA-Sequenzierung), sollten verwendet werden, um die neu programmierte Zellidentität weiter zu bestätigen.
Die hier beschriebene Technik könnte für die Entwicklung zukünftiger Therapien in Betracht gezogen werden, bei denen neuronaler Ersatz im Gehirn benötigt wird. Obwohl sich die In-vivo-Reprogrammierung noch in den Anfängen befindet und die Übersetzung in den Menschen noch nicht absehbar ist, könnte diese Technik eine Methode zur Bewertung der exogenen Genfunktion im Gehirn und zur Untersuchung der Zellreifung in vivo bieten.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, hirnresidente Glia in vivo effizient in funktionelle und subtypspezifische Neuronen wie Parvalbumin-extierende Interneurons umzuwandeln. Dies ist ein Schritt nach vorn in Richtung der Entwicklung einer alternativen Zellersatztherapie für Hirnerkrankungen ohne die Notwendigkeit einer exogenen Zellquelle. Es schafft auch ein Werkzeug, um Zellschicksalsschalter vor Ort zu untersuchen.
Das Gehirn hat nur eine begrenzte Kapazität für die Erzeugung neuer Neuronen. Daher, bei neurologischen Erkrankungen, gibt es einen Bedarf an exogenen Zellquellen für die Reparatur des Gehirns. Dazu wurden im Laufe der Jahre verschiedene Zellquellen intensiv erforscht, darunter Zellen aus Primärgewebe, Stammzellen-abgeleitete Zellen und umprogrammierte Zellen1,2,3. Direkte Reprogrammierung von ansässigen Gehirnzellen in Neuronen ist ein neuer Ansatz, der eine attraktive Methode für die Reparatur des Gehirns bieten könnte, da es die eigenen Zellen des Patienten für die Erzeugung neuer Neuronen im Gehirn verwendet. Bis heute haben mehrere Berichte gezeigt, in vivo Reprogrammierung durch virale Vektor-Bereitstellung im Gehirn4,5,6,78,9 in verschiedenen Hirnregionen wie der Kortex, Rückenmark, Striatum und das Mittelhirn5,10,11, sowie in intakten und läsioned Gehirn5,8,11,12. Sowohl hemmende als auch exzitatorische Neuronen wurdenerhalten 4,8, aber der genaue Phänotyp oder die Funktionalität dieser Zellen wurde noch nicht im Detail analysiert.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine effizientere Reprogrammierung und zellspezifische Identifizierung von in vivo reprogrammierten Neuronen. Wir bieten ein Protokoll zur funktionellen Beurteilung der neuronalen Reifung und Phänotypcharakterisierung basierend auf Funktionalität und immunhistochemischen Merkmalen.
Wir verwendeten einen creinduzierbaren AAV-Vektor und einen GFP-Reporter, um die in vivo reprogrammierten Neuronen zu identifizieren. Diese Wahl der viralen Vektoren hat den Vorteil, sowohl teilende als auch nicht trennende Zellen des Gehirns zu infizieren, wodurch die Anzahl der Zielzellen erhöht wird, als Alternative zur Verwendung des Retrovirus7,8. Ein neuronspezifischer synapsingesteuerter FLEX-Reporter (GFP) ermöglichte es uns, die neu generierten Neuronen gezielt zu erkennen. Frühere Studien haben subtypspezifische Promotoren für die In-vivo-Reprogrammierung7,9verwendet, die auch die Expression von Reprogrammierungsgen und Reportern in bestimmten Zelltypen ermöglichen. Diese Methode erfordert jedoch eine weitere Identifizierung umprogrammierter Neuronen durch postmortale Analyse der Koexpression von Reportern und neuronalen Markern. Die Verwendung eines neuronspezifischen Reporters, wie er hier beschrieben wird, ermöglicht eine direkte Identifizierung. Dies ist ein direkter Beweis für eine erfolgreiche Umwandlung und ermöglicht eine Live-Zell-Identifikation, die für die Patch-Clamp-Elektrophysiologie erforderlich ist.

<table><tbody><tr><td><stark>REAGENZIEN FÜR DIE AAV5-KLONIERUNG UND DIE HERSTELLUNG VIRALER VEKTOREN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV-CA-FLEX</td><td>AddGene</td><td>38042</td><td></td></tr><tr><td>Ascl1</td><td>AddGene</td><td>67291</td><td>NM_008553.4</td></tr><tr><td>Lmx1a</td><td>AddGene</td><td>33013</td><td>NM_0033652.5</td></tr><tr><td>Nurr1</td><td>AddGene</td><td>35000</td><td>NM_013613.2</td></tr><tr><td>GFP-syn</td><td>AddGene</td><td>30456</td><td></td></tr><tr><td>LoxP (FLEX)-Sequenz 1</td><td></td><td></td><td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtgctatacgaaa gttatactagtcccgggaaggcgaaggcgga agaggctctaga</td></tr><tr><td>LoxP (FLEX)-Sequenzen 2</td><td></td><td></td><td>tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatctct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td></tr><tr><td>pDP5</td><td>Plasmid Factory</td><td>PF435</td><td></td></tr><tr><td>pDP6</td><td>Plasmid Factory</td><td>PF436</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FBS (fötales Rinderserum)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin, Streptomycin</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>14190094</tr><tr><td>HEK293 Küvetten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85120602-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Kolben</td><td>BD Falcon</td><td>10078780</td><td>175 cm2</td></tr><tr><td>Tris H-CL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td> Für TE-Puffer verwenden Sie 10 mM, pH 8,0; für Lysepuffer verwenden Sie 50 mM, pH 8,5; für IE-Puffer verwenden Sie 20 mM, pH 8,0; für Elutionspuffer verwenden Sie 20 mM, pH 8,0 </td></tr><tr><td>EDTA</td><td>EDTA: Invitrogen</td><td>EDTA: AM9260G</td><td> Für TE-Puffer verwenden Sie 1 mM EDTA </td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td></td><td></td>, <td> siehe Reinstwassersystem </td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C5080</td><td>2,5 M</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td> FÜR HBS-Anwendungen 140 mM; für Lysepuffer 150 mM; für IE-Puffer 15 mM; für Elutionspuffer 250 mM </td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td> Für die Lyse Puffer: 1 mM </td></tr><tr><td>Ultrazentrifugen-Dichtungsröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>Quick-Seal&reg; &nbsp; Polypropylen-Rohr</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&trade; &nbsp; Dichtegradient Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>10-mL Spritze-18G Nadel</td><td>BD</td><td>305064</td><td></td></tr><tr><td>Laborglasflaschen</td><td>VWR</td><td>?</td><td></td></tr><tr><td>Anionenaustauscherfilter</td><td>PALL Labor-MSTG25Q6</td><td></td><td> Acrodisc-Einheit mit Mustang Q-Membran </td></tr><tr><td>Zentrifugalfiltereinheit</td><td>Merck</td><td>Z740210-24EA</td><td> Amicon Ultra-4-Gerät </td></tr><tr><td>Endotoxinfreie Plasmid-DNA-Isolationskits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A33073</td><td></td></tr><tr><td>Na2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Falcon Röhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352196</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Röhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352070</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen</td><td>Novatech</td><td>30209-1232</td><td> CGGCCTCAGFGAGCGA </td></tr><tr><td>Forward Primer für Inverted Terminal Repeat (ITR) Sequenz</td><td></td><td></td><td> GGAACCCCTAGTGATGGAGTT </td></tr><tr><td>Reverse Primer für Inverted Terminal Repeat (ITR) Sequenz</td><td></td><td></td><td> CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG </td></tr><tr><td>5&akut; FAM / 3&akut; BHQ1 Sonde</td><td>Jena Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 mm Filter</td><td>Merck</td><td>SLGV004SL</td><td>Millex-GV Filter</td></tr><tr><td>EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezer -20 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gefrierschrank -80 &Grad; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kühlschrank +4 &Grad; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV Virusraum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reinstwassersystem</td><td>Merck</td><td>Milli-Q&reg; IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>VWR</td><td>444-0004</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Optima LE-80K Ultrazentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Tuttnauer</td><td>2540 EL</td><td></td></tr><tr><td>Polymerase-Kettenreaktion (PCR)</td><td>BioRad</td><td>C1000 Touch Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>Quantitative PCR (qPCR)</td><td>Roche</td><td>LightCycler&reg; 480 </td> Systemzentrifuge <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST16</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>ANIMAL MODEL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG2-Cre</td><td>Mäuse Jackson</td><td>NG2-CrexB6129, Lager #008533</td><td></td></tr><tr><td>REAGENZIEN ZUR INJEKTION VON REPROGRAMMIERUNGSFAKTOREN IN DAS GEHIRN</ Stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td>70%</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Solveco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolfuran</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td> Mit warmem Wasser auf 1%ige Lösung verdünnen. </td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Viroderm</td><td>7511&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Apoteket AB</td><td>P0500000</td><td> i.p. für das terminale Verfahren bei einer Dosis von 60 mg/ml. </td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Retrobeads</td><td>Lumafluor</td><td>R170</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT FOR INJECT OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN</td><td></td><td></td><td> Von RSG Solingen. </td></tr><tr><td>Schere</td><td>VWR</td><td>233-1552</td><td>von Biochem.</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>VWR</td><td>232-0007</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>VWR</td><td>232-0120</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellhalter</td><td>VWR</td><td>RSGA106.621</td><td>Nummer 20.</td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>VWR</td><td>RSGA106.200</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Rahmen</td><td>Stoelting Europe</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Ohrstangen</td><td>Stoelting Europe</td><td>51648</td><td>5 ul</td></tr><tr><td>Spritze mit abnehmbarer Nadel</td><td>Hamilton Company</td><td>65</td><td> 0,75 Innendurchmesser und 1,5 Außendurchmesser. </td></tr><tr><td>Glaskapilare</td><td>Stoelting</td><td>50811</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillarabzieher</td><td>Firma Sutter Firma</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Dentalbohrer</td><td>Agnthos AB</td><td>1464</td><td></td></tr><tr><td>Rasierer</td><td>Agnthos AB</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran Kammer und Pumpe</td><td>Agnthos AB</td><td>8323101</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Spritzen</td><td>Merck</td><td>Z118400-30EA</td><td>25G</td></tr><tr><td>Nadeln</td><td>Merck</td><td>Z192414&nbsp; Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Maus und Neugeborenen-Rattenadapter für stereotaktische Fram</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Braintree scientific, inc</td><td>53800M</td><td> von Covidien 2187. </td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-902</td><td></td></tr><tr><td>Gummischlauch</td><td>Elfa Distrelec</td><td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-366-473</td><td></td></tr><tr><td>REAGENZIEN FÜR GANZZELL-PATCH-CLAMP-AUFNAHMEN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2-6 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2-6 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td> siehe Reinstwassersystem </td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td></td><td></td><td>Vorbereiten 1 oder 2M.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>K-D-Gluconat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH-EGTA (Etilenglykol-bis-N-tetrazetinsäure)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KOH-Hepessäure (N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Mg2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Merck</td><td>P1675&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Merck</td><td>C239&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatglas Pipette</td><td>Sutter Company</td><td>B150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillarabzieher</td><td>Sutter Company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>WaterBath</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>Clampfit Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</td><td></td><td></td><td> In einer Konzentration von 4% verwenden. VORSICHT:&nbsp; PFA ist ein starkes Fixiermittel. Verschlucken und Kontakt mit der Haut vermeiden. </td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td> In einer Konzentration von 0,1% verwenden. </td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>10254640</td><td> Donkey.In einer Konzentration von 1 : 400 verwenden. </td></tr><tr><td>Serum</td><td>Merck Millipore</td><td>S30-100ML</td><td> Rekonstituieren Sie das Pulver in Milli-Q Wasser auf 1 mg/ml. Aliquotieren und bei -20° lagern; C,&nbsp; lichtempfindlich. In einer Konzentration von 1 : 500 verwenden. </td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2&prime;-phenylindoldihydrochlorid (DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td> 1: 600 in KPBS-T. </td></tr><tr><td>streptavidin- Cy3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>434315</td><td>1:5000, Kaninchen.</td></tr><tr><td>Anti-GAD65/67</td><td>Abcam</td><td></td><td>1:2000, Maus.</td></tr><tr><td>Anti-PV</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td>1:200, Ziege.</td></tr><tr><td>Anti-Chat</td><td>Merk</td><td>AB143</td><td>1:5000, Hase.</td></tr><tr><td>Anti-NPY</td><td>Immunostar</td><td>22940</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td>1:1000, Huhn.</td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Eindecklösung</td><td>Merck</td><td>10981</td><td> Eindeckmittel aus Polyvinylalkohol mit DABCO&reg;, Antifading </td></tr><tr><td>OCT</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frostschutzlösung</td><td>Tissue Pro Technologie</td><td>AFS05-1000N, 1000 ml/Stk.</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td>TCS SP8 konfokales Laserscanning-Mikroskop.</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>SM2010R</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo direkte reprogrammierung von resident glial cells in interneurons durch intracerebral injection of viral vectors

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Die Umwandlung von Resident Glia im Gehirn in funktionelle und subtypspezifische Neuronen in vivo ist ein Schritt in Richtung der Entwicklung alternativer Zellersatztherapien und schafft gleichzeitig Werkzeuge, um das Zellschicksal vor Ort zu untersuchen. Bis heute war es möglich, Neuronen durch In-vivo-Reprogrammierung zu erhalten, aber der genaue Phänotyp dieser Neuronen oder wie sie reifen, wurde nicht im Detail analysiert. In diesem Protokoll beschreiben wir eine effizientere Konvertierung und zellspezifische Identifizierung der in vivo reprogrammierten Neuronen mit Hilfe eines AAV-basierten viralen Vektorsystems. Wir bieten auch ein Protokoll zur funktionellen Bewertung der neuronalen Reifung der umprogrammierten Zellen. Durch Injektion von Flip-Excision(FLEX)-Vektoren, die die Reprogrammierung und synapsingesteuerte Reportergene in bestimmte Zelltypen im Gehirn enthalten, die als Ziel für die Zellreprogrammierung dienen. Diese Technik ermöglicht die einfache Identifizierung neu neu programmierter Neuronen. Die Ergebnisse zeigen, dass die erhaltenen neu programmierten Neuronen funktionell im Laufe der Zeit reifen, synaptische Kontakte erhalten und elektrophysiologische Eigenschaften verschiedener Arten von Interneuronen zeigen. Mit den Transkriptionsfaktoren Ascl1, Lmx1a und Nurr1 haben die meisten umprogrammierten Zellen Eigenschaften von schnell speichelnden, parvalbuminhaltigen Interneuronen.

Die Injektion von AAV-Vektoren wird verwendet, um ansässige NG2-Gliazellen erfolgreich in Neuronen im NG2-Cre-Maus-Striatum umzuprogrammieren (Abbildung 1A). Um NG2 glia gezielt anzusprechen, werden FLEX-Vektoren mit Reprogramming-/Reportergenen in antisense-Richtung eingefügt und von zwei Paaren antiparalleler, heterotypischer LoxP-Sites flankiert (Abbildung 1B). Jedes der drei Reprogrammierungsgene (Ascl1, Lmx1a und Nurr1) wird unter die Kontrolle des allgegenwärtigen cba-Promotors auf einzelnen Vektoren gestellt. Um sicherzustellen, dass die GFP-Expression auf neu programmierte Neuronen beschränkt ist, die aus einer Cre-exemittierten Zelle stammen, wird GFP unter die Kontrolle des neuronspezifischen Synapsin-Promotors (auch in einem FLEX-Vektor) gestellt.
Die Verwendung der Kombination von Reprogramming und Reporterkonstrukten ermöglicht die Erzeugung von GFP-positiven Neuronen im Mausstriatum (Abbildung 1C,C'). Die Verwendung des Reporterkonstrukts ohne das Vorhandensein von Reprogrammierungsgen ergibt keine GFP-positiven Neuronen (Abbildung 1D).
Die neu programmierten Neuronen, die mit Biocytin gefüllt sind, sind nach der post-mortem-Immunfärbung sichtbar (Abbildung 2A). Wenn die Konvertierung erfolgreich ist, sollte es eine umfassende neuronale Morphologie geben. Die elektrophysiologischen Aufnahmen von umprogrammierten Neuronen zeigen das Vorhandensein postsynaptischer funktioneller Verbindungen mit spontanen Aktivitätsmaßnahmen (Abbildung 2B, C). Dies kann entweder mit ionotropen GABAergic oder Glutamaterge Blocker blockiert werden (Picrotoxin oder CNQX), was sowohl erregende und hemmende synaptische Input in die neu programmierten Neuronen. Das Auftreten spontaner Aktivität nimmt mit der Zeit nach der Viralinjektion zu (Abbildung 2D), was auf eine allmähliche Reifung hindeutet.
Strominduzierte Wirkungspotentiale sind in funktionellen Neuronen vorhanden. Die Aktionspotentiale nehmen im Laufe der Zeit nach der Umstellung zu (Abbildung 2E). Dies deutet weiter auf eine Reifung in der neuronalen Funktion hin. In einem unreifen Neuron wird Strom entweder keine oder sehr wenige Aktionspotentiale induzieren (Abbildung 2F).
Die Brennmuster eines Neurons sind zelltypspezifisch, da sie von Faktoren wie der Morphologie der Zellen und der Kanalexpression15abhängen. Die aufgezeichneten Muster in den in vivo reprogrammierten Neuronen können in Gruppen unterschieden und mit denen endogener neuronaler Subtypen verglichen werden, z. B. schnell sprudelnde Interneuronen (Zelltyp B, Abbildung 3B) oder andere Zelltypen ( Abbildung 3A,C,D ). Die beobachteten elektrophysiologischen Unterschiede können durch das Vorhandensein spezifischer Subtype-Marker und die Ko-Expression mit GFP bestätigt werden (Abbildung 3E-H). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die im Striatum vorhandenen umprogrammierten Neuronen Eigenschaften verschiedener Arten von Interneuronen wie Parvalbumin-, ChAt- und NPY-exzessierende Interneuronen sowie striatale mittelspiny neuron identity (DARPP32+) ( Abbildung 3E -H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg"> Abbildung 1: In-vivo-Umprogrammierung der ansässigen NG2-Glia in Neuronen. (A) Schematische Darstellung der aAV-virusvermittelten In-vivo-Reprogrammierung der striatalen NG2-Glia. (B) Schematische Darstellung von AAV5 FLEX-Konstrukten, die für die In-vivo-Reprogrammierung verwendet werden, bei denen die Genexpression durch Cre-Expression in den Zielzellen reguliert wird. (C und C') In vivo reprogrammierte Neuronen, die durch Syn-GFP + ALN-Injektion in das Striatum entstehen. (D) Fehlen von umprogrammierten Neuronen, wenn dem viralen Cocktail keine Umprogrammierungsfaktoren hinzugefügt werden und nur das Reporterkonstrukt in vivo injiziert wird. Skalenstäbe = 100 mm (C), 25 mm (C'), 25 mm (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg"> Abbildung 2: In vivo umprogrammierte Neuronen sind funktional und zeigen eine Reife im Laufe der Zeit. (A) Biocytin-gefülltes neu programmiertes Neuron, zeigt eine reife neuronale Morphologie, einschließlich dendritischer Stacheln. Spuren zeigt (B) hemmende (GABAerge) Aktivität, die mit Picrotoxin blockiert ist, ein GABA-A-Rezeptor-Antagonist und (C) erregende Aktivität, die mit CNQX blockiert ist, ein AMPA-Rezeptor-Antagonist. (D) Die Anzahl der Neuronen mit postsynaptischer Aktivität nimmt im Laufe der Zeit zu. (E) Gepatchte Neuronen zeigen bereits nach 5 Wochen nach der Injektion (w.p.i.) repetitives Abfeuern und zeigen weiterhin, dass bei 8 und 12 w.p.i. (F) Das strominduzierte Wirkungspotenzial und die postsynaptische Aktivität eines unreifen Neurons, die nur wenige synaptische Ereignisse und wenige Aktionspotenziale im Vergleich zu B und D. Scale bar = 25 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg"> Abbildung 3: In vivo umprogrammierte Neuronen zeigen immunhistochemische und elektrophysiologische Eigenschaften von striatalen Interneuronen. (A-D) Die Brennmuster von in vivo reprogrammierten Neuronen können von unterschiedlichen Typen sein: (A) Typ A ähnelt dem endogenen mittleren Stachelneuron (DARPP32+); (B) ähnlich wie fast-spiking (PV+) interneurons; (C) ähnlich wie niedrigschwellige spiking Neuronen mit prominentem Sag (NPY+); (D) Neuronen, die mit großer Nachhyperpolarisation (Chat+) feuern. (E-H) Konfokale Bilder, die die Kolokalisierung von GFP und den interneuron Markern PV (E), ChAT (F), NPY (G) und Projektionsneuronenmarker DARPP32 (H) zeigen. Alle Skalenleisten = 50 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses Protokoll zielt darauf ab, direkt umprogrammierte Interneuronen in vivo zu erzeugen, indem ein AAV-basiertes Virussystem im Gehirn und ein FLEX synapsingesteuerter GFP-Reporter verwendet werden, der die Zellidentifikation und weitere Analyse in vivo ermöglicht.

In Vivo Direkte Reprogrammierung von Resident Glial Cells in Interneurons durch Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Dieses Protokoll zeigt, dass es möglich ist, neuartige Neuronen direkt im Gehirn aus der ansässigen Glia zu erzeugen und dass diese umprogrammierten Zellen zu subtypspezifischen Neuronen reifen. Der Hauptvorteil ist das kre-abhängige AAV-Virus, das eine gezielte Ausrichtung des NG2-Glia und des GFP-Reporters ermöglicht, der die neu programmierten Neuronen für die Analyse kennzeichnet. Die Erzeugung neuer Neuronen im Gehirn kann zu einer zukünftigen Entwicklung für Zellersatztherapien im Gehirn führen.In unserem Protokoll erzeugen wir die parvalbumin-positiven Interneurons, die Auswirkungen auf psychiatrische Störungen haben. In vivo Reprogrammierung kann auf andere Gehirnbereiche und Schaltkreise angewendet werden, je nachdem, welchen neuronalen Phänotyp und neurologischen Zustand Sie ansprechen möchten. Die Vorführung des Verfahrens wird Jenny Johansson sein: eine Technikerin, Maria Pereira: eine ehemalige Doktorandin und Marcella Birtele: eine Doktorandin in unserem Labor.Um AAV5 viralen Vektor zu produzieren, Säen HEK293T Zellen mit Standard-Kulturmedium in fünf T175-Kolben. Wenn die Zellen 50 bis 70% Konfluenz erreichen, bereiten Sie die folgende Mischung für die Transvtion vor. In einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr, fügen Sie gleiche molare Mengen an Vektorplasmid, und pDG-Serie Helfer-Plasmid.Fügen Sie Tris-EDTA Puffer zu einem Endvolumen von 144 Mikrolitern hinzu und fügen Sie dann reines Reinstwasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 1296 Mikrolitern zu erzielen und zu mischen. Als nächstes 144 Mikroliter 2,5 Molcalciumchlorid hinzufügen und mischen. Danach 1,92 Milliliter HBS sofort in die DNA-Lösung und Wirbel geben.Bei Raumtemperatur genau 60 Sekunden inkubieren. Anschließend die Lösung auf 28 Milliliter Frischzellenkulturmedium übertragen und mischen. Ersetzen Sie das Medium in den Kolben durch das Medium, das eine Transvection-Mischung enthält.Warten Sie drei Tage, und übertragen Sie die Medien in die Verschwendung. Fügen Sie jedem Kolben fünf Milliliter Erntepuffer hinzu, und fügen Sie dann weitere vier Milliliter DPBS zu jedem Kolben hinzu, um die verbleibenden Zellen zu spülen und mit der Zelllösung zu poolen. Zentrifugieren Sie die geernteten Zellen bei 1.000 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Nach der Zentrifugation den Überstand entfernen und das Pellet in 15 Milliliter Lysepuffer auflösen. 50 Milliliter Zentrifugenrohr 15 Minuten auf Trockeneis einfrieren und in einem Gefrierschrank von minus 20 Grad Celsius aufbewahren. Vor gebrauchen die geerntete Zelle in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auftauen.Führen Sie bei diesem Verfahren die AAV-Reinigung durch Iodixanolgradientenultrazentrifugierung durch und verwenden Sie ultrazentrifugierte Deckenrohre mit Zentrifugation bei 350, 000 x g für eine Stunde und 45 Minuten bei Raumtemperatur. Um die AAV-haltige Phase zu extrahieren, legen Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 18-Meter-Nadel etwa zwei Millimeter unter der 40 bis 60%igen Phasengrenze mit der Abschrägung nach oben und ziehen Sie sich zurück. Achten Sie darauf, vor Erreichen des Proteinbandes zu stoppen, nachdem fünf bis sechs Milliliter des viralen Vektors extrahiert wurden.Dann reinigen und konzentrieren Sie den verdünnten Iodixanol-Gradienten durch einen Anionenaustauschfilter, indem Sie ihn mit einer Rate nicht schneller als einen Tropfen pro Sekunde durchdrücken. Anschließend drei Milliliter IE-Puffer langsam durch den Filter schieben, um ihn zu waschen. Als nächstes wird die Mischung in eine Zentrifugalfiltereinheit mit einem bis zwei Milliliter Elutionspuffer eingebracht.Fügen Sie dem Gerät DPBS zu einem Endvolumen von vier Millilitern hinzu. Zentrifuge bei 2.000 x g bei Raumtemperatur, bis weniger als 0,5 Milliliter DPBS im Filter verbleiben. Danach entfernen Sie Flüssigkeit von der Unterseite des Rohres, nachfüllen mit vier Milliliter DPBS, und Zentrifuge wieder.Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Weitere Male, stellen Sie sicher, dass das Volumen des konzentrierten Vektors auf dem Filter etwa 200 Mikroliter nach der letzten Zentrifugation beträgt. Entfernen Sie den 200 Mikroliter konzentrierten Vektor mit einer Pipette und drücken Sie ihn durch einen 0,22 Mikrometer Filter, um ihn zu sterilisieren. Als nächstes aliquot 200 Mikroliter in eine Glasfläschigkeit mit verriegelten Einsatz.Um Reprogrammierungsfaktoren zu injizieren, legen Sie eine anästhesierte Maus in den stereotaxic-Rahmen. Verabreichen Sie eine entsprechende Analgesie zu Beginn der Operation, dann bringen Sie die Spitze der Glaskapillare der Injektionsnadel knapp über Bregma. Stellen Sie sicher, dass die Kapillarspitze sowohl in A-P- als auch in M-L-Ebenen perfekt gerade ist.Setzen Sie sowohl die M-L- als auch die A-P-Werte auf 0,0 auf dem digitalen Koordinatenzähler zurück. Um sicherzustellen, dass sich der Kopf des Tieres in einer vollkommen flachen Position befindet, verwenden Sie den digitalen Koordinatenzähler, um den D-V-Koordinatenwert zu messen, wenn der A-P-Arm bei plus 2,0 und minus 2,0 ist und wenn der M-L-Arm bei plus 2,0 und minus 2,0 liegt. Passen Sie die Höhe der Zahnstange und der Ohrstangen entsprechend an.Danach heben Sie die Spritze leicht an und bohren Sie ein Loch mit einem Zahnbohrer an den Injektionskoordinaten. Beginnen Sie, auf der Website zu bohren, arbeiten in einer kreisförmigen und sanften Art und Weise. Legen Sie dann ein Stück Watte über den offenen Einschnitt und spülen Sie die Spritze mit einer Salinelösung.Nach dem Spülen eine Luftblase und dann einen Mikroliter Lösung mit dem viralen Vektor aufstellen. Stellen Sie sicher, dass die virale Lösung leicht unter der Luftblase visualisiert werden kann. Senken Sie als Nächstes die Spritze, bewegen Sie sich langsam in die gewünschte Tiefe, und stellen Sie sicher, dass die Flugbahn frei von Knochenfragmenten ist.Anschließend einen Mikroliter der viralen Lösung mit einer Rate von 0,4 Mikroliter pro Minute injizieren. Wenn die Injektion durchgeführt ist, lassen Sie zwei Minuten für die Diffusion vor spritzenEntzug. Nach der Diffusion die Spritze langsam zurückziehen, bis die Spitze der Kapillare vollständig aus dem Gehirn zurückgezogen wird, dann den Schnitt vorsichtig vernähen und das Tier aus dem stereotaxic Rahmen entfernen.Überwachen Sie das Tier in einer postoperativen Station, bis das Bewusstsein wiedererlangt ist. Tiere werden bis zu 12 Wochen nach der Virusinjektion gehalten, damit die ansässige Glia in reife Neuronen umprogrammieren kann. Um Gehirnscheiben für die Elektrophysiologie mit einem Vibratom vorzubereiten, schneiden Sie das Gehirn vom rostralsten Teil bis zum striatalen Niveau mit hoher Geschwindigkeit.Dann das Striatum koronal bei 275 Mikrometern bei 0,1 Millimetern pro Sekunde abschnitt. Nach jedem Abschnitt entfernen Sie vorsichtig die nicht injizierte sttriatale Seite und übertragen Sie die injizierte Seite in eine Durchstechflasche mit einem unteren Netz und sauerstoffhaltigem CREB-Sinnrutsch im Wasserbad bei Raumtemperatur. Bewahren Sie die Durchstechflasche bei Raumtemperatur auf, bis alle Abschnitte geschnitten sind.Danach, langsam erhöhen Sie die Temperatur des Wasserbades auf 37 Grad Celsius und lassen Sie es für 30 Minuten, dann schalten Sie die Heizung und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen. Nach der Übertragung eines Gewebeabschnitts in eine Aufnahmekammer für die Elektrophysiologie die Glaspipette auf die Aufnahmeelektrode montieren und in die Lösung senken. Überprüfen Sie den Widerstand der Elektrode.Dann nähern Sie sich langsam der umprogrammierten Zelle mit der Pipette, halten einen leichten positiven Druck in der Elektrode, um das Schließen der Spitze zu vermeiden, und überprüfen Sie, ob die Zelle GFP-positiv ist, bevor Sie patchen. Wenn die Zelle gepatcht ist, halten Sie die Zelle in stromstromklemme von minus 60 bis minus 70 Millivolt, und injizieren Sie 500 Millisekundenströme von minus 20 bis plus 90 Picoamperen mit 10 Picoampere-Schritten, um Aktionspotenziale zu induzieren. Dies ist ein Hinweis auf eine neuronale Reifung und eine erfolgreiche Neuprogrammierung.Anschließend schalten Sie auf Spannungsklemme um und messen Das nach innen gerichtete Natrium und verzögerte Korrektur von Kaliumströmen bei Depolarisationsschritten von 10 Millivolt. Hier ist ein postaufgezeichnetes Biocytin gefüllt es neu programmiertes Neuron, das reife neuronale Morphologie und die dendritischen Stacheln zeigt. Hier zeigen elektrophysiologische Aufnahmen der umprogrammierten Neuronen das Vorhandensein postsynaptischer funktioneller Verbindungen mit spontanen Aktivitätsmaßnahmen.Spuren zeigen die hemmende Aktivität, die mit Picrotoxin blockiert ist, einem GABAA-Rezeptor-Antagonisten und der erregenden Aktivität, die mit CNQX, einem AMPA-Rezeptor-Antagonisten, blockiert ist. Die geflickten Neuronen zeigen bereits postsynaptische Aktivität bei fünf Wochen nach der Injektion, und setzen sich bei acht und 12 Wochen nach der Injektion fort. Die Anzahl der Neuronen mit aktuellen induzierten Wirkungspotentialen steigt auch im Laufe der Zeit.Eine detailliertere Analyse ergab mehrere unterschiedliche Brennmuster, bei denen die Mehrheit der Zellen eine schnelle Spiking-Aktivität ähnlich wie Parvalbumin interneurons zeigt. Die immunhistochemische Analyse nach 12 Wochen zeigte die Ko-Expression des Reporters GFP und des Parvalbumins. Nach diesem Verfahren können Sie die Genexpression mit Patch-Seek-Technik untersuchen oder die dreidimensionale synaptische Konnektivität mit monosynaptischer Tracing und iDISCO bewerten.Nun, da es möglich ist, Resident Glia in Parvalbumin auszudrücken interneurons umzuprogrammieren, haben wir begonnen zu untersuchen, ob diese authentisch sind und als therapeutisches Werkzeug verwendet werden können. Denken Sie daran, die festgelegten Protokolle und Richtlinien zu befolgen, wenn Sie mit Tieren und mit dem AAV-Virus umgehen.

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Hier präsentieren wir die intrakranielle Injektion von AAV-Vektoren für die Fluoreszenzmarkierung von Neuronen und Gliazellen in der Sehrinde.

Intrakranielle Injektion von Adeno-assoziierte virale Vektoren

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Elektrophysiologische Aufzeichnungen von reprogrammierten Neuronen in einer Maus-Gehirnscheibe

Quelle: Pereira, M. et. al., In vivo direkte Reprogrammierung von residenten Gliazellen in Interneuronen durch intrazerebrale Injektion viraler Vektoren. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die stereotaktische Injektion eines Adeno-assoziierten Virus in die Großhirnrinde einer transgenen Maus, um Cre-abhängige neuronale Reprogrammierung und fluoreszierende Reportergene in Gliazellen zu bringen.

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Basierend auf der in vitro lentiviralen Entwicklung neuronaler Vorläufer, ihrer Co-Transplantation in Wilde-Gehirne und der gepaarten morphometrischen Auswertung von "Test"- und "Kontrollderivaten" ermöglicht diese Methode eine genaue Modellierung der In-vivo-Genkontrolle neokortikaler Neuronenmorphologie auf einfache und erschwingliche Weise.

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