Name: Chemische Inaktivierung des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon durch Pomalidomid-basierte Homo-PROTACs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Erfahren Sie die chemische Inaktivierung der E3 Ubiquitin Ligase Cereblon durch pomalidomidbasierte Homo-PROTACs. Diese Methode ermöglicht die gezielte Degradierung von Proteinen für Forschung in Neurobiochemie und Pharmakologie.

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Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 und SFB-1074 to J.K.; FOR2372 zu M.G.)

1. Herstellung von PROTAC-Molekülen
VORSICHT: Bitte beachten Sie vor der Verwendung alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Mehrere der in diesen Synthesen verwendeten Chemikalien sind giftig und krebserregend. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitspraktiken und persönliche Schutzausrüstung.
<ol><li>Zubereitung von tert-butyl N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)carbam (Verbindung 1)
	<ol>
<li>1,1'-Carbonyldiimidazol (1,95 g, 12 mmol) und eine katalytische Menge von 4-(Dimethylamino)pyridin (5 mg) in eine Mischung aus Boc-Gln-OH (2,46 g, 10 mmol) in THF (50 ml) in 100 ml rund um den Bodenkolben mit Rührstab und mit einem Refluxkondensator ausgestattet. Bei Reflux 10 h unter Rühren erhitzen, bis sich eine klare Lösung bildet.</li>
		<li>Entfernen Sie das Lösungsmittel unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer, fügen Sie EtOAc (200 ml) hinzu und geben Sie es in einen Trenntrichter. Die organische Schicht mit H2O (50 ml) und Sole (50 ml) waschen und über Na2SO4trocknen.</li>
		<li>Filtern Sie die Lösung durch ein kurzes Pad Kieselgel (5 cm Durchmesser und 5 cm Höhe) und eluieren Sie mit einem weiteren Volumen (200 ml) von EtOAc.</li>
		<li>Verdampfen Sie das Lösungsmittel und trocknen Sie den erhaltenen farblosen Feststoff im Vakuum.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von tert-butyl N-(1-methyl-2,6-dioxo-3-piperidyl)carbamat (Verbindung 2) 
	<ol>
<li>Kombinieren Sie Verbindung 1 (2,28 g, 10 mmol) mit gemahlenem Kaliumcarbonat (2,76 g, 20 mmol) und DMF (25 ml) in einem 100 ml runden Bodenkolben. Iodomethan (1,42 g, 0,62 ml, 10 mmol) tropfenweise mit einer Spritze hinzufügen und den Kolben mit einem durchlöcherten Gummiseptum ausstatten. Legen Sie das Reaktionsgefäß für 2 h in ein Ultraschallbad.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch mit EtOAc (100 ml) verdünnen und in einen Trenntrichter geben. Die organische Schicht mit 1 N NaOH (2x 25 ml), H2O (25 ml) und Salzlake (25 ml) waschen und über Na2SO4trocknen.</li>
		<li>Filtern und verdampfen Sie das Lösungsmittel. Reinigen Sie das Produkt durch Säulenchromatographie über Kieselgel (6 cm Säulendurchmesser und 20 cm Höhe) mit Erdölether/EtOAc (2:1).</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-Fluorisoindoline-1,3-dion (Verbindung 3)
	<ol>
<li>Kombinieren Sie 3-Fluorophthalsäure-Anhydrid (1,25 g, 7,5 mmol), Glutarimid 1 (1,14 g, 5 mmol) und eine Lösung von Natriumacetat (0,50 g, 6,0 mmol) in Eisessigsäure (20 ml) in einem 50 ml runden Bodenkolben mit Rührstab und ausgestattet mit einem Refluxkondensator. Das Gemisch bei 120 °C 6 h erhitzen.</li>
		<li>Nach dem Abkühlen die violette Mischung auf H2O (100 ml) gießen und 10 min rühren. Den gebildeten Feststoff durch Filtration sammeln, mit H2O (3 x 5 ml) und Petrolether (3 x 5 ml) waschen und im Vakuum trocknen.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von 4-Fluor-2-(1-methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline-1,3-dion (Verbindung 4)
	<ol>
<li>Kombinieren Sie 3-Fluorophthalsäure-Anhydrid (1,25 g, 7,5 mmol), Glutarimid 2 (1,21 g, 5 mmol) und eine Lösung von Natriumacetat (0,50 g, 6,0 mmol) in Eisessigsäure (20 ml) in einem 100 ml runden Bodenkolben mit Rührstab und mit einem Refluxkondensator ausgestattet. Das Gemisch bei 120 °C 6 h erhitzen.</li>
		<li>Nach dem Abkühlen die violette Mischung auf H2O (100 ml) gießen und 10 min rühren. Den gebildeten Feststoff durch Filtration sammeln, mit H2O (3 x 5 ml) und Petrolether (3 x 5 ml) waschen und im Vakuum trocknen.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von tert-butyl N-[2-[2-[2-[[2-(2,6-dioxo-3-piperidyl)-1,3-dioxo-isoindolin-4-yl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]carbamat (Verbindung 7)
	<ol>
<li>50 ml runder Bodenkolben mit tert-butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbam (5, 0.41 g, 1.65 mmol), Compound 3 (0.41 g, 1.50 mmol), trocken DMF (10 mL) und DIPEA (0.39 g, 0.51 mL, 3.0 mmol) aufladen. Mit rührstange und refluxkondensator ausstatten. Unter Argonatmosphäre bei 90 °C für 10 h erhitzen.</li>
		<li>Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur die dunkelgrüne Mischung auf H2O (100 ml) gießen und mit EtOAc (3x 50 ml) in einem Trenntrichter ausziehen. Die kombinierten organischen Schichten mit H2O (50 ml) und Sole (50 ml) waschen, über Na2SO4trocknen, filtern und im Vakuum konzentrieren.</li>
		<li>Reinigen Sie das Rohprodukt durch Säulenchromatographie über Kieselgel (3 cm Säulendurchmesser und 60 cm Höhe) mit einem Gradienten von Erdölether/EtOAc (1:1 bis 1:2).</li>
	</ol></li>
	<li>Zubereitung von Homodimer (Verbindung 8)
	<ol>
<li>Kombinieren Sie den ,,-Diamine-Linker 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), DIPEA (1,05 ml, 6,00 mmol) und eine Lösung von 3 (0,83 g, 3,00 mmol) in trockenem DMSO (20 ml) in einem 50 ml runden Bodenkolben mit Rührstab und mit einem Refluxkondensator ausgestattet. Unter Argonatmosphäre bei 90 °C für 18 h erhitzen.</li>
		<li>Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur die dunkelgrüne Mischung auf H2O (100 ml) gießen und mit EtOAc (3x 50 ml) in einem Trenntrichter ausziehen. Die kombinierten organischen Schichten mit H2O (50 ml) und Sole (50 ml) trocknen, über Na2SO4trocknen und im Vakuum konzentrieren.
</li>
		<li>Reinigen Sie das Rohprodukt durch Säulenchromatographie über Kieselgel (3 cm Säulendurchmesser und 50 cm Höhe) mit einem Gradienten von Erdölether/EtOAc (1:2) zu EtOAc.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von Heterodimer (Compound 9)
	<ol>
<li>Auflösen 7 (0,83 g, 1,65 mmol) in trockenER CH2Cl2 (10 ml). Trifluoressigsäure (10 ml) zugeben und die gelbe Mischung bei 40 °C für 2 h in einem geschlossenen 50 ml runden Bodenkolben rühren.</li>
		<li>Entfernen Sie die flüchtigen Stoffe und koevaporate mit CH2Cl2 (4x 5 ml). Den Rückstand im Vakuum 10 h trocknen.</li>
		<li>Lösen Sie das Material in trockenem DMF (20 ml) auf. Fügen Sie Verbindung 4 (0,44 g, 1,50 mmol) und DIPEA (0,78 g, 1,05 ml, 6,00 mmol) hinzu und statten Sie den Kolben mit einem Refluxkondensator aus. Unter Argonatmosphäre bei 90 °C für 10 h erhitzen.</li>
		<li>Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur die dunkelgrüne Mischung auf H2O (100 ml) gießen und mit EtOAc (3x 50 ml) in einem Trenntrichter ausziehen. Waschen Sie die kombinierten organischen Schichten mit gesättigten NaHCO3 (50 ml), H2O (50 ml), 10% KHSO4 (50 ml), H2O (50 ml) und Sole (50 ml), trocknen über Na2SO4,filtern und konzentrieren im Vakuum.</li>
		<li>Reinigen Sie das Rohprodukt durch Säulenchromatographie über Kieselgel (3 cm Säulendurchmesser und 50 cm Höhe) mit einem Gradienten von Erdölether/EtOAc (1:2) zu EtOAc.</li>
		<li>Molekülstruktur aufklären und verifizieren (Abbildung 5A Verbindung 8, 5B Verbindung 9) durch 1H NMR und 13C NMR Spektren in DMSO-d6 auf einer Kernspinresonanz (NMR) Spektrometer. Prüfen Sie, ob die Reinheit beider Verbindungen mit Hilfe der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) höher als 97 % ist, indem Sie eine Dioden-Array-Erkennung (DAD) bei 220–500 nm anwenden.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Funktionelle Validierung von PROTAC-Molekülen
<ol><li>Western Blot Analyse der CRBN-Degradation durch PROTACs ANMERKUNG: Die Wirkungen von8und Verbindung9auf CRBN-Proteinspiegel wurden durch Western-Blot-Analyse getestet. Darüber hinaus konnten auch die Auswirkungen auf die IkZF1- und IKZF3-Werte bestätigt werden (Abbildung 6).<ol><li>
Probenvorbereitung
		<ol>
<li>Lösen Sie die Verbindungen 8 und 9, Lenalidomid (Len), Pomalidomid (Pom), MG132 und MLN-4924 in DMSO in einer Konzentration von 10 mM, aliquot und lagern Bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung.</li>
			<li>Samen 1 x 106 MM1S-Zellen in einer 6-Well-Platte mit 2,5 ml Medien und behandeln Zellen mit 100 nM oder 1 m Verbindung 8 oder 9 für 24 h.</li>
			<li>Erntezellen nach der Behandlung und Zentrifuge bei 700 x g,5 min, 4 °C. Waschen Sie Zellpellet mit kalten 1x PBS, um restliche Medien, Zentrifuge bei 700 x g, 5 min, 4 °C zu entfernen und Überstand zu entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.</li>
			<li>Lysezellen im Lysepuffer (25 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% Glycerin, 1x Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail) für 10 min auf Eis, Zentrifuge bei 320 x g für 10 min, 4 °C. Ernte überstand und bestimmen Die Proteinkonzentration durch einen Bicinchoninsäure-Protein-Assay (BCA-Assay) nach dem Herstellerprotokoll.</li>
			<li>Denatur-Proteine (15–30 g/Probe) mit 1x LDS-Ladepuffer (5% 2-Mercaptoethanol) und kochen 10 min, 75 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
SDS-PAGE
		<ol>
<li>Fix-Gel-Sandwich mit 10% Trenngel [4 ml 3x Gelpuffer (3 M Tris/HCl, 0,3% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS), pH 8,45), 4 ml Acrylamid 30%, 2,52 ml Glycerin 50%, 1,395 mL H2O, 75 x L 11% Ammoniumpersulfat (APS) und 9,75 l TEMED] und ein 4%-Stapelgel [1.992 mL 3x Gelpuffer, 0,792 ml 30% Acrylamid, 3.168 mL H2O, 36 'L 11% APS und 6 'L TEMED] in einer Elektroden-Montageeinheit. Entfernen Sie Kämme, spülen Sie Brunnen mit Kathodenpuffer (100 mM Tris/HCl, 100 mM Tricin, 0.1% (w/v) SDS) und laden Proben.</li>
			<li>Anodenpuffer (100 mM Tris/HCl, pH 8,9) in den Tank füllen. Eiweißprobe ab Schritt 2.1.1.4 laden und SDS-PAGE bei 70 V, 20 min laufen lassen, gefolgt von 115 V, 150 min bei konstanter Spannung.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Immunoblotting und Detektion von CRBN, IKZF1 und IKZF3
		<ol>
<li>Aktivieren Sie die PVDF-Membran (0,45 m) in 100% Methanol für 1 min. Equilibrate Membran und Trenngel im 1x Transferpuffer [10x Transferpuffer (192 mM Glycine, 25 mM Tris-Base/HCl, 900 mL H2O), 20% Methanol, 0,1% SDS, pH 8,3].</li>
			<li>Montieren Sie die Blotting-Kassette gemäß dem Herstellerprotokoll. Transfergel bei 180 mA für 90 min.</li>
			<li>Membran 3x in 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% Tween 20) für je 5–10 min bei Raumtemperatur waschen. Blockmembran in 5% fettgetrockneter Milch (NFDM), TBS-T für 1 h bei Raumtemperatur. Membran 3x in 1X TBS-T für je 5–10 min bei Raumtemperatur waschen.</li>
			<li>Inkubationsmembran mit Primärantikörper für CRBN (1:500 in 5% BSA, TBS-T) mit sanftem Schütteln bei 4 °C, über Nacht.</li>
			<li>Membran 3x in 1X TBS-T für je 5–10 min bei Raumtemperatur waschen. Inkubationsmembran mit Anti-Maus (1:10.000 in 5% NFDM, TBS-T) oder Anti-Kaninchen (1:5.000 in 5% NFDM, TBS-T) sekundärer Antikörper gekoppelt an Meerrettichperoxidase HRP (1 h bei Raumtemperatur.)</li>
			<li>Membran 2x in 1X TBS-T für je 5–10 min bei Raumtemperatur waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal mit 1x TBS.</li>
			<li>Inkubationsmembran für 2 min mit HRP-Substratlösung nach Herstellerprotokollen und Chemilumineszenz in einem Chemilumineszenzdetektionsgerät erkennen.</li>
			<li>Waschen Sie die Membran 1x in 1x TBS für je 5–10 min bei Raumtemperatur. Zur Freisetzung von Antikörpern Streifenmembran in handelsüblichen Abisolierpuffer für 15 min. Waschen Membran 3x in 1x TBS für je 5–10 min bei Raumtemperatur.</li>
			<li>Membran in 5% fettgetrockneter Milch, TBS-T für 1 h bei Raumtemperatur reblockieren. Membran 3x in 1x TBS-T für je 5–10 min bei Raumtemperatur waschen und mit IKZF1, IKZF3 oder Tubulin nach Schritt 2.1.3.4 erneut sondieren.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Wettbewerbsexperimente mit MG132, MLN4942 oder Pomalidomid ANMERKUNG: Um zu bestätigen, ob CRBN über den Ubiquitin-Proteasome-Weg abgebaut wird, führten wir Wettbewerbsexperimente mit dem Proteasomen-Inhibitor MG132 und einem neddylierungsaktivierenden Enzym (NAE)-Inhibitor MLN4942 (Abbildung7) durch.<ol>
<li>Samen 1 x 106 MM1S Zellen pro Brunnen in einer 6-Well-Platte. Pretreat-Zellen mit 10 M MG132, 10 M MLN4942 oder Lenalidomid (100x) und 1 hbei 37 °C, 5% CO2 inkubieren.</li>
		<li>100 nM Verbindung 8 für 3 h bei 37 °C, 5% CO2 hinzufügen.</li>
		<li>Erntezellen für Western Blot nach Schritt 2.1.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Zelllebensfähigkeits-Assays in mehreren Myelom-Zelllinien HINWEIS: Dieser Test wird verwendet, um die Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit zu testen und zusätzlich die Wirkung von IMiDs auf mehrere Myelomzellen durch Vorbehandlung der Zellen mit Verbindung 8 zu veranschlagen (Abbildung 8 , Abbildung 9A,B).<ol>
<li>Samen 5 x 104 MM1S-Zellen pro Brunnen in einer 96-Well-Platte in biologischen Triplicaten für den Lebensfähigkeitstest. Für die Western-Blot-Analyse, Samen 1 x 106 MM1S-Zellen pro Brunnen in einer 6-Well-Platte in biologischen Triplicaten.</li>
		<li>Behandeln Sie Zellen mit DMSO oder 100 nM, 1 M oder 10 M Verbindung 8, Verbindung 9 oder Pomalidomid und inkubieren für 24 h, 48 h oder 96 h bei 37 °C, 5% CO2 . Für Rettungsexperimente, behandeln Sie Zellen mit 100 nM Verbindung 8 für 3 h, vor oder nach Zugabe von 1 M Pomalidomid und inkubieren für 96 h.</li>
		<li>Messen Sie 96-Well-Plattenlumineszenz mit einem lumineszierenden Zelllebensfähigkeitstest, gemäß dem Herstellerprotokoll auf einem Plattenleser oder Erntezellen aus der 6-Well-Platte für die Western-Blot-Analyse.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Einen möglichen finanziellen Interessenkonflikt erklären die Autoren nicht.

Das Design solcher homo-PROTACs, wie hier für CRBN beschrieben, beruht auf der spezifischen Affinität von Pomalidomid zu CRBN, die in zahlreichen heterobifunktionellen PROTACs erfolgreich eingesetzt wurde und zur Entwicklung von PROTAC 8 als hochgradig selektiven CRBN-Degrader. Die Spezifität unseres Moleküls wurde bereits durch proteomische Analysen bestätigt24. Für genetisch vermittelten Knockout ist der Ausschluss und die Validierung von Nebenwirkungen eine Herausforderung und ...

Die immunmodulatorischen Medikamente (IMiDs) Thalidomid und seine Analoga, Lenalidomid und Pomalidomid, alle für die Behandlung von multiplem Myelom zugelassen, binden an die E3 Ubiquitin Ligase Cereblon (CRBN), ein Substratadapter für cullin4A-RING E3 Ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. Die Bindung von IMiDs erhöht die Affinität von CRL4CRBN zu den lymphoiden Transkriptionsfaktoren Ikaros (IKZF1) und Aiolos (IKZF3), was zu ihrer Ubiquitination und Degradation führt (Abbildung 1)4,5, 6 , 7 , 8. Da IKZF1 und IKZF3 für mehrere Myelomzellen unerlässlich sind, führt ihre Inaktivierung zu einer Wachstumshemmung. SALL4 wurde vor kurzem als zusätzliches IMiD-induziertes Neosubstrat von CRBN gefunden, das wahrscheinlich für die Teratogenität und die sogenannte Contergan-Katastrophe in den 1950er Jahren verantwortlich ist, die durch Thalidomid9,10verursacht wurde. Im Gegensatz dazu ist Caseinkinase 1 (CK1) ein Lenalidomid-spezifisches Substrat von CRBN, das in die therapeutische Wirkung beim myelodysplastischen Syndrom mit Chromosom 5q Deletionen11verwickelt ist.
Die Fähigkeit von Kleinmolekülen, ein bestimmtes Protein für den Abbau zu zielen, ist eine spannende Implikation für die moderne Arzneimittelentwicklung. Während der Mechanismus von Thalidomid und seinen Analoga nach ihrer ersten Anwendung beim Menschen entdeckt wurde, wurden so genannte Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) speziell für ein Protein von Interesse (POI) entwickelt (Abbildung 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTACs sind heterobifunktionelle Moleküle, die aus einem spezifischen Liganden für den POI bestehen, der über einen Linker mit einem Liganden einer E3-Ubiquitinligase wie CRBN oder von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20verbunden ist. 21,22. PROTACs induzieren die Bildung eines transienten ternären Komplexes, der das POI auf die E3-Ubiquitinligase lenkt, was zu seiner Ubiquitination und proteasomalen Degradierung führt. Der Hauptvorteil von PROTACs gegenüber herkömmlichen Inhibitoren besteht darin, dass die Bindung an ein POI ausreichend ist und nicht seine Hemmung, und daher können PROTACs potenziell auf ein weit breiteres Spektrum von Proteinen abzielen, einschließlich derer, die als undruggable wie Transkriptionsfaktoren15. Darüber hinaus wirken chimäre Moleküle katalytisch und haben daher eine hohe Potenz. Nach der Ubiquitin-Übertragung in die POI löst sich der ternäre Komplex und steht für die Bildung neuer Komplexe zur Verfügung. Somit reichen sehr niedrige PROTAC-Konzentrationen für den Abbau des Zielproteins23aus.
Hier beschreiben wir die Synthese eines Pomalidomid-Pomalidomid konjugierten homo-PROTAC (Verbindung 8), das CRBN für die Degradierung von sich selbst rekrutiert24. Die E3 ubiquitin ligase CRBN dient sowohl als Recruiter als auch als Ziel zugleich (Abbildung 3). Um unsere Daten zu validieren, synthetisierten wir auch eine negative Bindungskontrolle (Verbindung 9). Unsere Daten bestätigen, dass der neu synthetisierte Homo-PROTAC spezifisch für den CRBN-Abbau ist und nur minimale Auswirkungen auf andere Proteine hat.

<table><tbody><tr><td>1,1'-Carbonyldiimidazol</td><td>TCI-Chemikalien</td><td>C0119</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;-(Ethylendioxy)-bis(ethylamin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>385506</td><td>Verbindung 6</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3-Fluorophthalsäureanhydrid, 98 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12275</td><td></td></tr><tr><td>4-Dimethylaminopyridin, 99 %</td><td>Acros</td><td>148270250</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>Acrylamidstamml&ouml; sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Aiolos (D1C1E) mAB</td><td>Zellsignalisierung</td><td>15103S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CRBN-Antikörper, hergestellt in Kaninchen</td><td>Sigma</td><td>HPA045910</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen IgG HRP-gebundener Antikörper</td><td>Sigma</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Gln-OH</td><td>TCI-Chemikalien</td><td>B1649</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Lumineszierender Zellviabilitätsassay</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>DMF, wasserfrei, 99,8 %</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td>Extra trocken über Molekularsieb</td></tr><tr><td>DMSO, wasserfrei, 99,7 %</td><td>Acros</td><td>348445000</td><td>Extra Dry über Molekularsieb</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus (HRP-konjugiert)</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease & Phosphatase-Inhibitor Einweg-Cocktail (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Ikaros (D6N9Y) Mab-Zellsignalisierung</td><td></td><td>14859S</td><td></td></tr><tr><td>ImmobilonP-Transfermembran (0,45&micro; m)</td><td>Merck</td><td>IPVH000010</td><td></td></tr><tr><td>Iodomethan, 99 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8507</td><td>Hochgiftiges</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213-2,5L</td><td></td></tr><tr><td>Mg132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Trans-Blot-Elektrophorese-Transferzelle</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertikale Elektrophoresezelle</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MLN4942</td><td>Biomol (Cayman)</td><td>Cay15217-1</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler Anti-&alpha;-Tubulin-Antikörper, hergestellt in Maus (B512)</td><td>Sigma</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethyldiisopropylamin, 99 %</td><td>Alfa Aesar A11801</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fettfreies Trockenmilchpulver</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0830,0500</td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell Weiß Polystyrolplatte</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS-Probenpuffer (4X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pomalidomid</td><td>Selleckchem</td><td>S1567</td><td></td></tr><tr><td>RestoreTM Western Blot Stripping Puffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Dodecylsulfat</td><td>Carl Roth</td><td>183.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89761</td><td>Verbindung 5</td></tr><tr><td>Tricin</td><td>Carl Roth</td><td>6977.4</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright ECL Spray</td><td>Advansta</td><td>K-12049-D50</td><td></td></tr></tbody></table>

chemische inaktivierung des e3 ubiquitin ligase cereblon durch pomalidomid-basierte homo-protacs

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

Die immunmodulatorischen Medikamente (IMiDs) Thalidomid und seine Analoga, Lenalidomid und Pomalidomid, alle von der FDA zugelassenen Medikamente zur Behandlung von multiplem Myelom, induzieren Die Ubiquitination und den Abbau der lymphoiden Transkriptionsfaktoren Ikaros (IKZF1) und Aiolos (IKZF3) über den Cereblon (CRBN) E3 ubiquitin ligase für den proteasomalen Abbau. IMiDs wurden vor kurzem für die Erzeugung von bifunktionaler Proteolyse verwendet, die auf Chimären (PROTACs) abzielt, um andere Proteine zur Ubiquitination und proteasomalen Degradation durch die CRBN E3 Ligase zu zielen. Wir haben pomalidomidbasierte homobifunktionelle PROTACs entwickelt und synthetisiert und ihre Fähigkeit analysiert, eine selbstgesteuerte Ubiquitination und Abbau von CRBN zu induzieren. Hier dient CRBN als beides, die E3-Ubiquitinligase und das Ziel zugleich. Die homo-PROTAC Verbindung 8 degradiert CRBN mit einer hohen Potenz mit nur minimalen verbleibenden Effekten auf IKZF1 und IKZF3. Die CRBN-Inaktivierung durch Verbindung 8 hatte keinen Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit und proliferation verschiedener multipler Myelom-Zelllinien. Dieser Homo-PROTAC hebt die Wirkung von IMiDs in mehreren Myelomzellen auf. Daher können unsere homodimeren Pomalidomid-basierten Verbindungen helfen, die endogene Substrate und physiologischen Funktionen von CRBN zu identifizieren und den molekularen Mechanismus von IMiDs zu untersuchen.

Hier beschrieben wir das Design, die Synthese und die biologische Bewertung eines homodimer pomalidomidbasierten PROTAC zur Degradation von CRBN. Unser PROTAC interagiert gleichzeitig mit zwei CRBN-Molekülen und bildet ternäre Komplexe, die selbstallgegenwärtige und proteasomale Abbau von CRBN mit nur minimalen verbleibenden Effekten auf pomalidomid-induzierte Neosubstrate IKZF1 oder IKZF3 induzieren.
Aus einer Reihe von zuvor v...

Diese Arbeit beschreibt die Synthese und Charakterisierung eines pomalidomidbasierten, bifunktionellen Homo-PROTAC als einen neuartigen Ansatz zur Induzieren von Ubiquitination und Abbau des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon (CRBN), dem Ziel von Thalidomid-Analogen.

Chemische Inaktivierung des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon durch Pomalidomid-basierte Homo-PROTACs

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Unsere homodimerischen PROTACs sind die ersten chemischen Inhibitoren von Cereblon und können dazu beitragen, den molekularen Mechanismus von Thalidomid-Analogen weiter aufzuklären und die physiologische Funktion von Cereblon zu untersuchen. Diese neue PROTAC-Plattformtechnologie kann sehr hilfreich sein, um gezielt auf Proteine von Interesse zu zielen, die ansonsten als unnachtastbar angesehen werden. CRBN-Hemmung allein hat keine Anti-Tumor-Aktivität.CRBN-Degrader können jedoch klinische Auswirkungen auf Fettleibigkeit, Infektionskrankheiten und andere Erkrankungen haben. Die Synthese ist anspruchsvoll und es ist schwierig, optimale Linker und Anhaftung zu finden, um effektive Protein-Degrader zu erzeugen, wenn eine PROTAC-Verbindung entwirft. Zu Beginn 2,46 Gramm Boc-geschütztes L-Glutamin und 50 Milliliter Tetrahydrofuran in einen 100-Milliliter-Rundkolben geben und eine Minute lang bei 800 U/min rühren.Fügen Sie dann 1,95 Gramm 1,1'carbonyldiimidazol und eine katalytische Menge an 4-Pyridin hinzu. Weiter rühren für 10 Stunden bei Reflux, um eine klare farblose Lösung der Glutarimid-Verbindung zu erhalten. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer.Lösen Sie den Rückstand in 200 Milliliter Ethylacetat auf und gießen Sie ihn in einen Trenntrichter. Waschen Sie die organische Schicht mit je 50 Millilitern entionisiertem Wasser und Salzlake und trocknen Sie die organische Schicht über Natriumsulfat. Schwerkraft filteren die Lösung durch Kieselgel, um das Delikatessen zu entfernen, und spülen Dann das Kieselgel mit 200 Milliliter Ethylacetat ab.Entfernen Sie das Lösungsmittel aus dem Filtrat unter Vakuum, um Compound 1 als farblosen Festkörper zu erhalten. Trocknen Sie das Produkt über Nacht unter Vakuum, bevor Sie es verwenden. Als nächstes lösen Sie 0,50 Gramm Natriumacetat in 20 Milliliter Eisessigsäure in einem 100 Milliliter Rundkolben mit Rührstab.Fügen Sie 1,25 Gramm 3-Fluorophthalsäure-Anhydrid und 1,14 Gramm Glutarimid und rühren bei Reflux für sechs Stunden, um eine lila Lösung von Compound 3 zu erhalten. Lassen Sie die Mischung auf Raumtemperatur abkühlen, und gießen Sie sie dann in 100 Milliliter entionisiertes Wasser und rühren Sie für 10 Minuten, um Compound 3 auszustoßen. Sammeln Sie den Feststoff durch Filtration, waschen Sie ihn mit Wasser und Erdölether und trocknen Sie ihn zwei Tage lang unter Vakuum.Als nächstes 0,83 Gramm Compound Drei und 20 Milliliter trockenes Dimethylsulfoxid in einen 50-Milliliter-Schlenkkolben geben und zwei Minuten rühren. Fügen Sie 0,22 Gramm Alpha-Omega-Diamin-Linker Compound 6 und 1,05 Milliliter N, N-Diisopropylethylamin und rühren Sie die Mischung unter Argon bei 90 Grad Celsius für 18 Stunden, um Homodimer 8 in einer dunkelgrünen Mischung zu erhalten. Lassen Sie die Mischung auf Raumtemperatur abkühlen und in 100 Milliliter entionisiertes Wasser gießen.Extrahieren Sie das Produkt in drei 50-Milliliter-Portionen Ethylacetat, kombinieren Sie die organischen Schichten und waschen Sie sie mit 50 Millilitern Wasser und Sole. Trocknen Sie die gewaschene organische Schicht über Natriumsulfat, filtern Sie das Trockenmittel heraus und entfernen Sie das Lösungsmittel unter Vakuum. Lösen Sie den Rückstand in einer minimalen Menge chromatographischen Lösungsmittels auf und tragen Sie ihn zur Reinigung auf eine Kieselgelsäule auf.Sammeln Sie die fluoreszierenden Produktfraktionen, kombinieren Sie sie und entfernen Sie das Lösungsmittel, um Homodimer 8 als gelben Feststoff zu erhalten. Zu Beginn 2,28 Gramm Glutarimid 1 in 25 Milliliter Dimethylformamid in einem 100 Milliliter Rundkolben auflösen. 2,76 Gramm gemahlenes Kaliumcarbonat in dieser Lösung aussetzen.Ziehen Sie dann 0,62 Milliliter Jodomeme in eine Spritze, die mit einer 20-Spur-Nadel ausgestattet ist. Fügen Sie das Jodometropfen im Laufe von 10 Sekunden hinzu. Stoppen Sie den Kolben mit einem Gummiseptum, und fügen Sie eine Entlüftungsnadel hinzu.Beschallen Sie die Mischung für zwei Stunden bei Raumtemperatur, um Glutarimid-Compound 2 zu erhalten. Die Mischung mit 50 MilliliterEthylacetat verdünnen und in einen Trenntrichter gießen. Spülen Sie den Kolben mit weiteren 50 MilliliterEthylacetat in den Trichter.Arbeiten Sie das Produkt auf und reinigen Sie es mit Kieselgel-Säulenchromatographie, um Glutarimid 2 als farblosen Festkörper zu erhalten. Vergleichen Sie die Retentionszeiten der Glutarimidverbindungen 1 und 2, um zu bestätigen, dass die N-Methylierung erfolgreich war. Um mit der Validierung zu beginnen, behandeln Sie mehrere Myelomzellen mit den von Interesse.Isolieren Sie die relevanten Proteine und bereiten Sie Proben für eine Western Blot-Analyse des Proteinabbaus vor. Dann bereiten Sie ein Gel-Sandwich für SDS-PAGE vor und füllen Sie den Anodenpuffertank mit einer pH 8,9 Tris-HCl-Lösung. Die Proteinproben in das Gel laden und 20 Minuten lang bei 70 Volt laufen lassen, gefolgt von 115 Volt für 150 Minuten.Als nächstes bereiten Sie 1x Transferpuffer für immunoblotting vor und bewegen Sie das Gel vorsichtig von seiner Kassette in den Transferpuffer, um es auszugleichen. Sie müssen sehr vorsichtig sein, wenn Sie das Gel aus der Kassette für die Gleichgewichtszeit entfernen, weil es sehr schnell platzen und zerbröckeln kann. Tauchen Sie eine 0,45 Mikrometer Polyvinylidendifluoridmembran für mindestens 20 Sekunden in reines Methanol ein, um sie zu aktivieren, und tauchen Sie sie dann in einen 1x Transferpuffer ein.Lassen Sie das Gel und die Membran für 10 Minuten aussetzen. Dann montieren Sie die Western Blotting Kassette und wenden Sie 180 Milliampere für 90 Minuten an, um die Proteine auf die Membran zu übertragen. Anschließend visualisieren Sie die Proteine durch Immunfärbung.Um die Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit zu bewerten, zuerst, Samen 50 000 multiple Myelom-Zellen pro Brunnen einer 96-Well-Platte in biologischer Triplicate. Fügen Sie zu jedem Brunnen 100 Mikroliter Medien, die DMSO enthalten, oder ein 0,1, ein oder 10 Mikromolar von Compound 8, Compound 9, oder Pomalidomid. Um ein Zelllebensrettungsexperiment durchzuführen, behandeln Sie stattdessen die Zellen mit einer 100-nanomolaren Lösung von Compound 8 für drei Stunden, entweder vor oder nach dem Hinzufügen einer mikromolaren Lösung von Pomalidomid.Inkubieren Sie die Zellen für 24, 48 oder 96 Stunden bei 37 Grad Celsius in einer 5%kohlendioxid-Atmosphäre, und messen Sie die Zelllebensfähigkeit mit einem lumineszierenden Assay. Die Struktur des homodimerischen PROTAC 8 wurde mit Proton und Kohlenstoff NMR bestätigt. Heterodimeric PROTAC 9 wurde als Negativkontrolle synthetisiert, da die N-Methylierung innerhalb des Glutarimid-Anteils zu einem Verlust der Bindungsfähigkeit von Cereblon oder CRBN führt.Der Homo PROTAC 8 induzierte einen nahezu vollständigen proteosomalen CRBN-Abbau mit minimalen Auswirkungen auf die lymphoiden Transkriptionsfaktoren IKZF1 und IKZF3. Im Gegensatz dazu zeigte das Hetero PROTAC 9 ein ähnliches Verhalten wie Pomalidomide. Compound 8 induzierte CRBN Abbau könnte durch einen direkten Inhibitor des Proteasoms blockiert werden, oder indirekt durch NetylierungShemmung blockiert werden.Mit Compound 8 vorbehandelte Zellen hielten den Auswirkungen von Pomalidomid auf IKZF1 und IKZF3 signifikant stand. Der zusammengesetzte 8-induzierte CRBN-Abbau hatte nach 96 Stunden viel weniger Einfluss auf die Lebensfähigkeit mehrerer Myelom-Zellals als der IKZF1- und IKZF3-Abbau von Compound 9 und Pomalidomid. Mehrere Myelomzellen, die mit Compound 8 vorbehandelt wurden, hatten eine signifikant größere Lebensfähigkeit, wenn sie Pomalidomid ausgesetzt waren als unbehandelte Zellen, was darauf hindeutet, dass Compound 8 verwendet werden könnte, um immunmodulatorische IMiD-Medikamentenresistenz zu imitieren.Wir fanden heraus, dass Compound 8 den vollständigen proteasomalen Abbau von Cereblon induziert, keine Nebenwirkungen auf die Lebensfähigkeit und Proliferation von IKZF1- und IKZF3-Zellen hat. Die Ausweitung der Projekttechnologie auf andere Ziele hat das Potenzial zur Inaktivierung und Verfolgung von Proteinen im Zusammenhang mit Krebs und anderen Krankheiten. Bei der Anpassung dieser Technik für andere Medikamente und Proteine sollte man sorgfältig die molekularen Strukturen des Arzneimittels und das Proteinziel untersuchen, um die optimalen Linker und Anhänge zu wählen.Die IMiDs funktionieren bei Mäusen aufgrund einer Punktmutation in Cereblon nicht, aber es gibt ein transgenes Knock-in-Maus-Modell, das für weitere Tierstudien verwendet werden kann. Da Pomalidomid ein analoges Thalidomid ist, das hoch teratogen ist, empfehlen wir schwangeren Frauen, die mit diesen Medikamenten arbeiten, nicht.

chemical-inactivation-e3-ubiquitin-ligase-cereblon-pomalidomide-based

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Die zytotoxische Aktivität der Phenanthridin PJ-34 in Krebszellen Mitose wurde in Echtzeit Live-konfokale Bildgebung dokumentiert. PJ-34 ausgerottet menschlichen Brustkrebszellen MDA-MB-231-Zellen, die extra Centrosomen in Mitose. Im Gegensatz zu normalen bifokalen Mitose wurden die extra Zentrosome in den beiden Spindelpole in Gegenwart von PJ-34 gruppiert.

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Bewertung der Wirksamkeit des Umweltchemikalien und Drogen, enzymatisch, zu sein Bioactivated, Zwischenprodukte, die Generierung von kovalenten DNA Addukte, ist ein wichtiger Bereich bei der Entwicklung von Krebs und seine Behandlung. Für zusammengesetzte Aktivierung zu bilden werden Methoden beschrieben, die DNA-, die sowie Techniken für die Erkennung und Quantifizierung Addukten.

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Dieses Papier verwendet ein Flow-Zytometrie-based Assays auf Bildschirm Bibliotheken chemische Inhibitoren für die Identifizierung von Inhibitoren und ihre Ziele, die T-Zell-Rezeptor Signalisierung beeinflussen. Die hier beschriebenen Methoden können auch für Hochdurchsatz-Screenings erweitert werden.

Identifikation von Mediatoren der T-Zell-Rezeptor Signalgebung über das Screening von chemischen Inhibitors Bibliotheken

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Dieses Protokoll beschreibt den quantitativen lumineszierenden Nachweis der Proteinabbaukinetik in lebenden Zellen, die unter Verwendung von CRISPR/Cas9 entwickelt wurden, um Antikörper freies endogenes Protein-Detektions-Tag zu exprimieren, das mit einem Zielprotein fusioniert ist. Detaillierte Anweisungen zum Berechnen und Abrufen der quantitativen Abbauparameter, Rate, Dmax, DC 50 und Dmax50 sind enthalten.

Hochdurchsatz-Zellprofilierung gezielter Proteinabbauverbindungen mit HiBiT-CRISPR-Zelllinien

Hier beschreiben wir einen Bioassay unter Verwendung von 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT), um zuvor synthetisierte spirocyclische Oxime zu testen.

Funktionalisierte spirozyklische Heterocyclensynthese und Zytotoxizitätstest

Das vorliegende Protokoll zeigt eine modifizierte Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von DNA-Protein-Crosslinks (DPCs) und deren posttranslationalen Modifikationen (PTMs), einschließlich Ubiquitylierung, SUMOylierung und ADP-Ribosylierung, die durch Topoisomerase-Inhibitoren und Formaldehyd induziert werden, wodurch die Bildung und Reparatur von DPCs und ihren PTMs untersucht werden kann.

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Dieser Artikel berichtet über die Konstruktion von Zentromer-assoziierten Protein-E (CENP-E) Knockout-Zellen unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems und drei phänotypbasierter Screening-Strategien. Wir haben die CENP-E-Knockout-Zelllinie verwendet, um einen neuartigen Ansatz zur Validierung der Spezifität und Toxizität der CENP-E-Inhibitoren zu etablieren, der für die Arzneimittelentwicklung und die biologische Forschung nützlich ist.

Erzeugung von Zentromer-assoziierten Protein-E CENP-E-/- Knockout-Zelllinien mit dem CRISPR/Cas9-System

In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle zur biophysikalischen Charakterisierung der ternären Komplexbildung, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert wird, an denen die Ubiquitin-Ligasen Von-Hippel-Lindau E3-Ligase (VHL) und Cereblon (CRBN) beteiligt sind.  Zu den hier dargestellten biophysikalischen Methoden gehören die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), die Bioschichtinterferometrie (BLI) und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC).

Entwicklung und Anwendung biophysikalischer Assays zur Evaluierung der Bildung ternärer Komplexe, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert werden

Wir beschreiben experimentellen Details der Synthese von gemusterten und rekonfigurierbare Teilchen von zweidimensionalen (2D) Vorstufen. Diese Methodik kann verwendet werden, um Partikel in einer Vielzahl von Formen, einschließlich Polyeder und Greifvorrichtungen auf Längenskalen Bereich von Mikro-bis Zentimeterbereich erzeugen.

Origami Inspired Selbstorganisation von Patterned und Reconfigurable Particles

Erfahren Sie die chemische Inaktivierung der E3 Ubiquitin Ligase Cereblon durch pomalidomidbasierte Homo-PROTACs. Diese Methode ermöglicht die gezielte Degradierung von Proteinen für Forschung in Neurobiochemie und Pharmakologie.

Chemische Inaktivierung des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon durch Pomalidomid-basierte Homo-PROTACs

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