Elektroretinogramm Aufnahme im Larvenstadium Zebrafisch mit A Roman kegelförmigen Schwamm-Tip Elektrode
27. März 2019
Hier präsentieren wir eine Protokoll, die die Messung von Licht evozierten Elektroretinogramm Antworten von Larven Zebrafisch vereinfacht. Eine neuartige kegelförmige Schwamm-Tip Elektrode kann dazu beitragen, das Studium der visuellen Entwicklung im Larvenstadium Zebrafisch mit Elektroretinogramm ERG mit einfacher zuverlässige Ergebnisse und geringere Kosten.
Dieses Protokoll vereinfacht die Messung von Elektroretinogrammen oder ERGs bei Larvenzebrafischen, was eine wichtige funktionelle Auslesung von visuellen Entwicklungs- und genetischen Krankheitsmodellen bietet. Die weichen Schwammspitzen der Erfassung von Elektroden, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind einfach mit wirtschaftlichen und leicht verfügbaren Materialien herzustellen und vermeiden mögliche Schäden an den Larvenaugen. Die weichere Schwamm-Mikrode kann wiederholte ERG-Messungen desselben Auges ermöglichen.
Personen, die neu in diesem Verfahren finden kann es schwierig, unter der dim roten Beleuchtung zu arbeiten, die während des gesamten Verfahrens verwendet wird. Aber es ist wichtig, dass die dunkle Anpassung beibehalten wird. Zur Vorbereitung der kegelförmigen Schwammaufnahmeelektrode schneiden Sie das Ende aus einer Platinelektroden-Bleiverlängerung und entfernen Sie mit einem Skalpell 10 Millimeter der äußeren Polytetrafluorethylen-Isolierbeschichtung vom neuen Ende der Verlängerung.
Schneiden Sie einen 40 Millimeter großen Silberdraht mit einem Durchmesser von 0,3 Millimetern und verschließen Sie den Silberdraht mit dem freiliegenden Innendraht, um den Draht sicher an der Elektrodenleitung zu befestigen. Umhüllen Sie das Gelenk mit Isolierband und lassen Sie eine ca. 15 Millimeter lange Silberdrahtmenge freigelegt. Schließen Sie einen weiteren Draht an die negative Klemme der Batterie an und tauchen Sie das andere Ende des Drahtes in die Saline ein.
Tauchen Sie den freiliegenden Silberdraht in normale Saline ein und verbinden Sie das andere Ende mit der positiven Klemme einer Gleichstromquelle von neun Volt. Legen Sie den Draht nach 60 Sekunden zum Trocknen auf absorbierendes Gewebe. In der Zwischenzeit ein 20 mal 20 Millimeter großes Quadrat Polyvinylacetatschwamm in eine Kegelform schneiden und den Schwamm einmal ringers Puffer sättigen.
Unter einem Lichtmikroskop mit einer Skalenstange auf dem Okular, verwenden Sie eine Skalpellklinge, um die Spitze des Kegels auf einen Durchmesser von etwa 40 Mikrometern zu formen. Den kegelförmigen Schwamm auf saugfähigem Gewebepapier lufttrocknen, bis er fest ist. Vor dem Einsetzen des Silberdrahtes in den getrockneten massiven kegelförmigen Polyvinylacetatschwamm durch die Basis des Kegels, mit Maskenband, um überschüssiges exponiertes Metall zu isolieren, um Photovoltaik-Artefakte zu reduzieren.
Tauchen Sie am Tag des Experiments die schwammige Elektrode für 15 Minuten in Ringers Puffer ein, um den Schwamm vollständig zu sättigen. Mindestens acht Stunden vor den Aufnahmen nicht mehr als 20 Zebrafischlarven in einem einzigen 15-Milliliter-Rohr ohne Deckel und in Aluminiumfolie eingewickelt in einen dunklen Inkubator legen. Am Ende der Brutzeit gießen Sie den dunkel angepassten Zebrafisch unter dunkelroter Beleuchtung aus einer Leuchtdiode in eine Petrischale.
Um die Schwammplattform vorzubereiten, schneiden Sie ein Stück Polyvinylacetatschwamm etwa gleich dick wie die Tiefe einer 35 Millimeter Petrischale, so dass der Schwamm eng in die Schale passt. Machen Sie einen kleinen Schnitt vertikal durch ein Ende des Schwamms, um den Silberdraht der Referenzelektrode aufzunehmen und den Schwamm in Goldfisch Ringers Puffer einweichen, bis der Schwamm gesättigt ist. Legen Sie den Schwamm dann in eine saubere 35-Millimeter-Petrischale und verwenden Sie ein Papiertuch, um die zusätzliche Flüssigkeit zu absorbieren, bis keine Lösung aus dem Schwamm als Reaktion auf einen leichten Fingerdruck ausstrahlt.
Um das Tier für das Experiment zu positionieren, verwenden Sie eine drei Millimeter Pasteur Pipette, um eine anästhesierte Larve auf eine drei mal drei Zentimeter große Quadratfläche Papiertuch zu übertragen und das Quadrat mit Zangen auf den befeuchteten Schwamm zu legen. Passen Sie mit einer feinen Bürste, die in Ringers Puffer eingeweicht ist, die Position der Larve mit einem Auge nach oben und weg von jeder Flüssigkeit auf dem Handtuch unter der Larve ein. Glasieren Sie den Larvenkörper mit feuchtigkeitsspendendem Augengel, um das Tier während der gesamten Elektroretinogrammaufnahme hydratisiert zu halten.
Und legen Sie das Gericht auf eine kleine, wasserbeheizte Plattform vor der Ganzfeld-Schüssel Lichtreiz in einem Faraday Käfig. Setzen Sie die Referenzelektrode in den Schnitt des Plattformschwamms ein. Und verbinden Sie eine kommerziell hergestellte Bodenelektrode mit dem Faraday Käfig.
Befestigen Sie die Aufnahmeelektrode an einem Elektrodenhalter und befestigen Sie den Halter am stereotaxic Arm eines Mikromanipulators. Mit einer drei Millimeter Pasteur-Pipette die Schwammspitze der Elektrode mit einem Tropfen Ringer-Lösung wieder sättigen und das Mikroskop im Faraday-Käfig über die Elektroretinogramm-Plattform positionieren. Verwenden Sie die Spitze eines absorbierenden Gewebes, um überschüssige Flüssigkeit aus der Elektrodenschwammspitze zu entfernen und unter dem Mikroskop, positionieren Sie die aktive Elektrode, so dass die Schwammspitze sanft die zentrale Hornhautoberfläche des Larvenzebrafischauges berührt.
Dann bewegen Sie die Ganzfeld-Schüssel in Richtung der Schwammplattform, um darauf zu achten, dass die Larve von der Schüssel bedeckt wird, und schließen Sie den Käfig, um fremde elektromagnetische Geräusche zu reduzieren. Die Empfindlichkeit der Larvenzebrafisch Netzhaut zu Dimmer blinkt mit dem Alter zu. Da die A- und B-Wellen bei Intensitäten von weniger als minus 1,61 Log-Candela-Sekunde pro Meter nach der Befruchtung nicht erkennbar sind, sind bei diesen Intensitäten in den älteren Larven klare Signale nachweisbar.
Die B-Wellen-Amplitude nimmt deutlich zwischen vier und fünf nach der Befruchtung zu. Nach sieben Tagen ist das Signal bei 2,48 Log Candela Sekunde pro Quadratmeter größer als an den Tagen fünf und sechs nach der Befruchtung. A- und B-Wellen-implizite Zeiten werden nach fünf Tagen nach der Befruchtung deutlich schneller.
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse eine Reifung in der Netzhautfunktion von Zebrafischen zwischen vier und sieben Tagen nach der Befruchtung. Um dieses Protokoll erfolgreich durchführen zu können, ist es wichtig, dass Schwämme vollständig mit Flüssigkeit gesättigt sind, was dazu beiträgt, die Leitfähigkeit der Aufnahmeelektrode aufrechtzuerhalten und den Geräuschpegel senkt. Wenn die a-Welle von besonderem Interesse ist, können pharmakologische Behandlungen angewendet werden, um die B-Wellenkomponente zu blockieren und so die volle a-Welle freizulegen.
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Übersicht
Dieses Protokoll vereinfacht die Messung von Elektroretinogrammen (ERGs) bei larvalen Zebrafischen und liefert eine wichtige funktionelle Aussage über die visuelle Entwicklung und Modelle genetischer Erkrankungen. Die Verwendung einer neuartigen kegelförmigen Schwamm-Elektrode mit Spitze ermöglicht zuverlässige Ergebnisse und ist dabei kosteneffizient.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- Sehentwicklung
Hintergrund
- Elektroretinogramme (ERGs) sind entscheidend zur Beurteilung der Sehfunktion.
- Die Larven von Zebrafischen dienen als Modell zur Untersuchung der visuellen Entwicklung.
- Herkömmliche Methoden bergen möglicherweise das Risiko, die empfindlichen Augen der Larven zu beschädigen.
- Weiche, schwammartige Elektroden können dieses Risiko verringern.
Zweck der Studie
- Vereinfachung der Messung von ERGs bei Zebrafischlarven.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung der visuellen Entwicklung.
- Möglichmachung wiederholter Messungen, ohne die Versuchstiere zu schädigen.
Verwendete Methoden
- Herstellung kegelförmiger Schwamm-Ableitelektroden.
- Verwendung von schwachem rotem Licht, um die Dunkeladaption aufrechtzuerhalten.
- Herstellung von Elektroden aus kostengünstigen Materialien.
- Mehrfache Ableitung von ERGs am selben Auge.
Hauptergebnisse
- Die Schwamm-Spitzen-Elektroden sind einfach herzustellen und zu handhaben.
- Sie verhindern Schäden an den Augen von larvalen Zebrafischen.
- Wiederholte ERG-Messungen ermöglichen konsistente Ergebnisse.
- Die Aufrechterhaltung der Dunkeladaption ist entscheidend für genaue Messwerte.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige und kostengünstige Methode für ERG-Messungen.
- Es verbessert die Untersuchung der visuellen Entwicklung beim Zebrafisch.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können von diesem vereinfachten Ansatz profitieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll stellt eine kostengünstige, reproduzierbare Methode zur funktionellen Beurteilung der visuellen Entwicklung bei Zebrafischlarven bereit, einem wichtigen Modell für die Zielvalidierung in der neurowissenschaftlichen Arzneimittelforschung. Die neuartige Elektrode mit Schwammtip reduziert technische Hürden und Gewebeschäden und ermöglicht zuverlässige ERG-Messungen, die zur mechanistischen Risikominderung bei Netzhautwegen beitragen. Ihre Einfachheit erleichtert die Standardisierung des Assays zwischen verschiedenen Laboren und verbessert die Vorhersagesicherheit bei der Screening-Untersuchung der frühen Sehfunktion.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Signalwegen der Netzhautfunktion durch Messung der a- und b-Wellen und unterstützt die Hypothesenprüfung in der visuellen Neurowissenschaft.
- Operativer Wert: Verwendet kostengünstige und leicht verfügbare Materialien, um die Einführung von ERG-Assays in Workflows zur Zielvalidierung zu erleichtern.
- Prädiktiver Wert: Liefert quantitative, reproduzierbare elektrophysiologische Messgrößen, die helfen, mechanistische Annahmen über die Wirkung von Genen oder Verbindungen auf die Netzhautverarbeitung abzusichern.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt konsistente Amplituden und latente Zeiten der a- und b-Wellen als quantitative Biomarker für die retinale Reifung und Funktion.
- Operativer Wert: Die einfache Herstellung und Handhabung der Elektrode unterstützt die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit des Assays für Screenings mit mittlerer Durchsatzleistung.
- Einsatzbereitschaft des Assays: Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung von Substanzen, indem stabile, nicht-invasive Ableitungen bereitgestellt werden, die für Längsschnittstudien am gleichen larvalen Auge geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Unterstützt die Modellierung krankheitsrelevanter Prozesse, indem die funktionelle visuelle Reifung von 4 bis 7 Tagen nach der Befruchtung verfolgt wird, was mit kritischen Zeitfenstern in genetischen Krankheitsmodellen übereinstimmt.
- Mechanistische Entlastung: Ermöglicht die pharmakologische Isolierung von a-Wellen-Komponenten, um den Beitrag von Photorezeptoren im Vergleich zu Bipolarzellen zu analysieren und die Zielgenauigkeit zu verbessern.
- Präklinische Anwendbarkeit: Bietet eine empfindliche Detektion funktioneller Veränderungen über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg und unterstützt so die Bewertung von Dosis-Wirkungs- und Zeit-Wirkungs-Beziehungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur präklinischen Bewertung ein und bietet eine funktionelle Brücke zwischen genetischer Modulation und phänotypischem Ergebnis in der Forschung zum Sehsystem.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch die Messung elektrophysiologischer Netzhautantworten auf Lichtreize und verdeutlicht die Aktivität von Signalwegen in sich entwickelnden Zebrafischen.
- Screening: Liefert standardisierte, rauscharme ERG-Ergebnisse, die den Vergleich zwischen genetischen oder Behandlungsbedingungen ermöglichen.
- Analytik: Bietet messbare abhängige Variablen (Amplitude der a-Welle, Amplitude der b-Welle, Latenzzeiten) für den statistischen Vergleich der Netzhautfunktion.
- Translationale Forschung: Verbindet entwicklungsbedingte elektrophysiologische Veränderungen mit Krankheitsmodellen und unterstützt die Abstimmung von Biomarkern bei Sehstörungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare, kostengünstige Plattform für ERG-Tests, die in verschiedenen Projekten zur Untersuchung von Netzhautgenen, Toxinen oder therapeutischen Kandidaten gemeinsam genutzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung durch direkte, funktionelle Messung der Netzhaut-Neuronenaktivität.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und verringert die Variabilität durch standardisierte Elektrodenpräparation und auf Dunkeladaptierung basierende Aufnahmebedingungen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem frühzeitige funktionelle Daten zur Integrität des Sehsystems bereitgestellt werden, wodurch das Risiko von Ausscheidungen in späteren Phasen reduziert wird.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen oder genetischen Zielstrukturen basierend auf objektiven funktionellen Sehleistungen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Elektrophysiologie und Zebrafisch-Handhabung, um die Signalintegrität aufrechtzuerhalten.
- Benötigt grundlegende elektronische und mikroskopische Ausrüstung zur Herstellung der Elektroden und zur Signalerfassung.
- Setzt standardisierte Protokolle zur Dunkeladaptation und Salinperfusion über verschiedene Anwender hinweg voraus, um Vergleichbarkeit sicherzustellen.
- Zu berücksichtigende Anpassungen umfassen die Modifikation der Elektrodegröße und der Salinzusammensetzung für unterschiedliche Larvenalter oder Arten.
- Praktische Einschränkungen bestehen in der Empfindlichkeit gegenüber der Sättigung der Elektroden und gegenüber Umgebungslicht, die kontrolliert werden müssen, um Störungen zu minimieren.
