Name: Erfassung von niedermolekularer Kommunikation zwischen Gewebe und Zellen mit Hilfe von Imaging-Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Kartierung niedermolekularer Kommunikation zwischen Zellen und Geweben mittels Imaging-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die unbeschriftete Analyse kleiner Moleküle bei Eierstockkrebs.

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Von der Chicago biomedizinische Konsortium mit Unterstützung wurde der Searle-Fonds auf der Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S); finanziert University of Illinois at Chicago Startup finanziert (L.M.S); Grant 543296 von Eierstockkrebs Research Fund Alliance (M.D.); und UG3 ES029073 (Jeb) und des nationalen Zentrums für die Förderung translationale Wissenschaften, Nationales Institut für Gesundheit, durch Grant UL1TR002003 (JEB & LMS).

Alle tierische Verfahren wurden im Einklang mit den nationalen Instituten der Gesundheitsrichtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und von der Ausschuß für institutionelle Animal Use und Pflege (IACUC) an der University of Illinois at Chicago genehmigt.
1. Vorbereitung der Reagenzien
<ol><li>Pflegen Sie, murine oviductal Epithel (MOE) bei 37° C mit 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator in alpha Minimum wesentliches Medium (αMEM) Medien ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 10 mg/mL Insulin, Transferrin, Selen (ITS) Zellen , 1,8 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 100 U/mL Penicillin-Streptomycin, 1 mg/mL Gentamycin und 18,2 ng/mL Östradiol-17β. Pass die Zellen alle 3 – 4 Tage, sicherzustellen, dass genügend Zellen gibt es am selben Tag die Mäuse geopfert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie 2 % Agarose durch Mischen von 1 g niedrigschmelzende Agarose mit 50 mL destilliertem Wasser. Autoklaven der Agarose, abkühlen lassen und dann aliquoten (1 mL) in 2 mL Röhrchen (siehe Tabelle der Materialien), bevor Agarose erstarrt. Agarose kann bei-20 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.</li>
	<li>Mindestens 2 mL 1 X Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) Medien vorbereiten.</li>
	<li>Die Matrix für MALDI-TOF MS, Vorbereitung von 5 mg/mL 10 mL 1:1 Alpha-Cyano-4-Hyroxycinnamic Säure (CHCA): Dihydroxybenzoic Acid (DHB) (siehe Tabelle der Materialien) in 90: 10 ACN:H2O + 0,1 % Trifluoroacetic Säure (TFA). Beschallen Sie Lösung bis Matrix aufgelöst ist.</li>
</ol>(2) Maus Kolonie und Eierstock entfernen
<ol><li>Brutpaare von CD-1 Mäusen mit Standardgehäuse Verfahren zu erhalten. In der Nähe der Tag der Entbindung kontrollieren Sie die Mäuse täglich, so dass das Alter der Welpen bekannt ist.</li>
	<li>Welpen im Alter von 16-18 Tagen durch CO2 Inhalation pro NIH Leitlinien einschläfern. Liefern von CO2 (100 %) an einem Fluss Rate von 10 – 20 % Kammervolumen pro Minute und für zwei Minuten nach Atmung aufgehört hatte. Bestätigen Sie Euthanasie durch zervikale Dislokation.</li>
	<li>Desinfizieren Sie alle chirurgische Geräte durch Eintauchen in 70 % igem Ethanol. Leibovitzs L-15 Medien mit 1 X Penicillin-Streptomycin auf 37 ° c warm</li>
	<li>Befeuchten Sie die Abdominal-Oberfläche mit 70 % Ethanol zur Desinfektion der Umgebung und Kontamination mit Haaren zu minimieren. Verständnis über die Bauchdecke mit stumpfen Pinzette und Nutzung Chirurgische Scheren zu einem großen V-Form durch die Haut und Bauchdecke, schneiden Sie die Haut aussetzen der inneren Organe.</li>
	<li>Bewegen Sie die inneren Organe, auf die Seite mit Pinzette. Individuell jedem uterine Horn mit feinen Pinzette greifen und leicht anheben.</li>
	<li>Suchen Sie den Eierstock, die am Ende des uterinen Horns, unmittelbar unterhalb der Niere werden. Verwenden Sie chirurgische Scheren, um der Fruchtknoten frei von Bindegewebe zu zergliedern. Dann schneiden Sie die Eierstöcke Horn in zwei Hälften.</li>
	<li>Verschieben der Eierstöcke, Eileiter und etwa eine Hälfte jedes uterine Horn auf vorgewärmten Leibovitz L-15 Medien.</li>
	<li>Unter dem Mikroskop sezierenden bewegen vorsichtig jeder Eierstock aus den umliegenden Bursa, befreien ihn aus der Eileiter, Bursa und jede Fettgewebe. Verschieben Sie jeder Eierstock an ein neues Gericht Leibovitzs L-15 Medien.</li>
	<li>Geschnitten Sie jeder Eierstock axial in zwei Hälften. Halten Sie die Eierstöcke Stücke (jetzt genannt Explantate) bis Beschichtung von Agarose bei 37 ° C gehalten.</li>
</ol>3. einrichten und Inkubation der ITO-behandelten Folie für Kokulturen
<ol><li>
Ungeteilte Kokulturen
	<ol>
<li>Verflüssigen Sie die Agarose bei 70 ° C auf einer heißen Platte.</li>
		<li>Legen Sie die 8-Brunnen-Teiler auf Indium Zinndioxid (ITO)-behandelten Folie (Abbildung 1A). Kautschuk unten auf den Teiler hilft bei der Haftung auf der Folie, aber achten Sie darauf, kontinuierliche sanfte Druck während Agarose-Beschichtung, kein Auslaufen oder Vermischung zwischen Brunnen zu gewährleisten gelten.</li>
		<li>Sammeln Sie Zellen in einem 15 mL konische Rohr, Zentrifuge (5 min bei 800 u/min) und Aufschwemmen Sie bis 50k Zellen pro 150 µL in 1 X DMEM Medien. Wenn eine andere Zelle Dichte optimal ist, stellen Sie sicher, dass bei diesem Schritt die Zellsuspension 2 X die endgültige Dichte gewünscht wird (z. B. für eine Endkonzentration von 50.000 Zellen in 300 µL, Zelldichte bei diesem Schritt 50.000 Zellen in 150 µL ist).</li>
		<li>Fügen Sie vor Beschichtung Zellkultur, Eierstöcke Explant zum Zentrum des Brunnens (Abb. 1 b).</li>
		<li>Jede Zellkultur in einzelnen 2 mL Röhrchen kurz vor Beschichtung Agarose hinzufügen. Kombinieren Sie für jedes gut 200 µL Zellsuspension und 200 µL verflüssigte Agarose in einer 2 mL-Tube. Kombinieren Sie z. B. für vier Brunnen, 800 µL Zellsuspension und 800 µL 2 % Agarose. Werden einige Mischung übrig, aber etwas mehr als notwendig Luftblasen beim Pipettieren vermeidet.<ol>
<li>Einzelne Zellkulturen fügen Sie Agarose unmittelbar vor dem Plattieren, Zellkultur hinzu. Die Agarose wird in weniger als einer Minute abkühlen, also bereit sein, schnell Platte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fügen Sie 300 µL der Zelle/Agarose Mischung sofort in jede Vertiefung (Abbildung 1). Abbildung 1 zeigt drei Zelle Bedingungen und einem Medium Zustand, jeweils mit und ohne einem Eierstock überzogen.</li>
		<li>Inkubieren Sie Folie bei 37 ° C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Geteilte Kokulturen.
	<ol>
<li>Schneiden Sie Trennwände aus dünnen, glatten Kunststoff (Abbildung 2A). Hinweis: Dieses Experiment verwendet die Seiten eines sterilen Einweg-Medien-Becken, weil sie flach und dünn sind. Schneiden Sie sie gerade breit genug, um gemütlich in der Hypotenuse des Brunnens (~ 13 mm) passen.</li>
		<li>Verflüssigen Sie die Agarose bei 70 ° C auf einer heißen Platte.</li>
		<li>Legen Sie die 8-Brunnen-Teiler auf die ITO-behandelten Folie (Abb. 2 b). Kautschuk unten auf den Teiler hilft bei der Haftung auf der Folie, aber achten Sie darauf, kontinuierliche sanfte Druck während Agarose-Beschichtung, kein Auslaufen oder Vermischung zwischen Brunnen zu gewährleisten gelten.</li>
		<li>Sammeln Sie Zellen in einem 15 mL konische Rohr, Zentrifuge (5 min bei 800 u/min) und Aufschwemmen Sie bis 50k Zellen pro 150 µL in 1 X DMEM Medien. Wenn eine andere Zelle Dichte optimal ist, ist darauf zu achten, dass bei diesem Schritt die Zellsuspension 2 x die endgültige Dichte erwünscht ist (z.B. für eine Endkonzentration von 50.000 Zellen in 300 µL Zelldichte bei diesem Schritt ist 50.000 Zellen in 150 µL).</li>
		<li>Legen Sie Kunststoff Teiler diagonal in Brunnen (Abbildung 2).</li>
		<li>Jede Zellsuspension einer Agarose zu einem Zeitpunkt kurz vor Beschichtung hinzufügen. Kombinieren Sie für jedes gut 100 µL Zellsuspension und 100 µL der verflüssigte Agarose in einer 2 mL-Tube. Kombinieren Sie z. B. für vier Brunnen, 400 µL der Zellkultur und 400 µL 2 % Agarose. Etwas mehr als notwendig Luftblasen beim Pipettieren vermeidet aber werden einige Zellen/Agarose-Mischung übrig.<ol>
<li>Einzelne Zellkulturen fügen Sie Agarose unmittelbar vor dem Plattieren, Zellkultur hinzu. Die Agarose wird in weniger als einer Minute abkühlen, also bereit sein, schnell Platte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Auf der einen Seite des Teilers, Platte 150 µL Zelle/Agarose-Mischung. Agarose abkühlen und erstarren (ca. 1 min) und entfernen dann den Teiler (Abb. 2D) zu ermöglichen.</li>
		<li>Legen Sie Eierstock Explant in die Mitte der leeren Hälfte des Brunnens. Platz 150 µL Medien/Agarose-Mischung über Spitze des Eierstocks und nur in der richtigen Seite des Brunnens (Abb. 2E).</li>
		<li>Inkubieren Sie Folie bei 37 ° C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. trocknen die Folie und die Vorbereitung für MALDI-TOF MS
<ol><li>Nach vier Tagen (oder jedem gewünschten Zeitpunkt), entfernen Sie die Kammer-Teiler aus Agarose-Stecker und die Folie (Abbildung 1). Lösen Sie die Seiten der Agarose aus der Kammer mit einem flachen Spatel sanft zu und ziehen Sie vorsichtig die Kammer nach oben, wobei Sie darauf achten, nicht zu bewegen, Agarose-Stecker. Wenn sie sich bewegen, positionieren Sie sie sanft, so dass sie einander nicht berühren.</li>
	<li>Legen Sie die Folie in einem 37 ° C Backofen für ca. 4 h, Drehen 90° jeder h. Hinweis: Die Rotation der Folie ist wichtig, gleichmäßige Wärmeverteilung im gesamten Beispiel zu gewährleisten.</li>
	<li>Nach dem Trocknen, entfernen Sie die Folie aus dem Ofen (Abbildung 1E).</li>
	<li>Wenden Sie Matrixlösung mit der Sprayer (Abb. 1F), mit den folgenden Parametern: Temperatur = 30 ° C, Volumenstrom = 0,2 mL/min, Anzahl der Durchgänge = 8, Richtung = CC und Düsenabstand = 40 mm. Hinweis: Anstelle einer Matrix-Sprayer eine künstlerische Airbrush lässt sich flüssige Matrix gelten. Die gleiche Matrixlösung verwendet werden, zu sprühen, aber etwa doppelt soviel Lösung erforderlich ist. Mit dem Schlitten eingespannt, so dass es senkrecht hängt, sprühen Sie die Folie aus einem 90° Winkel von ungefähr einem Fuß entfernt (Adapted von Hoffmann15) bis die Matrix Schicht ist sichtbar.</li>
	<li>Fügen Sie 1 µL Kalibrator (Phosphor rot für Ziele < 500 Da, ein Peptid-Mischung (siehe Tabelle der Materialien) für Ziele < 5.000 Da) auf Folie klar auszumachen. Phosphor rot erfordert keine Vermischung mit Matrix, aber die Peptid-Mischung 1:1 Mischung mit Matrix zur Ionisation zu unterstützen. Kalibrator trocknen warten.</li>
	<li>Zeichnen Sie ein X mit einem permanent-Marker in jeder Ecke der Folie und nehmen ein optisches Bild mit einer Kamera oder einem Scanner mit 1.200 dpi.</li>
</ol>5. bildgebende Massenspektrometrie Datenerfassung
<ol><li>Öffnen Sie eine neue Sequenz auf der IMS-Daten-Analyse-Software (siehe Tabelle der Materialien). Legen Sie die Raster Breite auf gewünschte räumliche Auflösung, mindestens 50 µm.</li>
	<li>Laden Sie das optische Bild der Folie auf die Analyse-Software und Set drei Lehren Punkte mit den Schnittpunkten in der x in jeder Ecke gezeichnet.</li>
	<li>Benennen Sie Regionen von Interesse für die Bildgebung in der Datenerfassungs-Software zu und benennen Sie diese entsprechend.</li>
	<li>Kalibrieren Sie das Gerät mit der Datenerfassungs-Software (siehe Tabelle der Materialien) innerhalb von 5 ppm Fehler.</li>
	<li>Speichern Sie die Methode optimierte und beginnen Sie Lauf. Dieses Experiment optimiert die folgenden Parameter: Polarität = positiv, Detektor = Reflektron, Laser-Größe = 2, Laserleistung = 50 %, Reflektor-Modus Detektor Gewinn = 3 X.</li>
</ol>6. Verarbeitung IMS-Daten
<ol><li>.Mis Importdatei in Statistiksoftware (siehe Tabelle der Materialien) für die Analyse von Bedeutung.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Es gibt eine wachsende Zahl von beweisen, die Noradrenalin Rolle HGSOC12,17,18impliziert, und diese Technik hat mehr mechanistischen Informationen beigetragen. Mit mindestens acht biologischen Bedingungen auf derselben Folie vorhanden kann die Methode biologische Kontrollen entfallen, wie gen sowie Zelle Spezifität und Medienkontrolle in einem einzigen IMS laufen. Während die Methode optimiert wurde zur Bewertung ausgetauscht kl...

Bildgebende Massenspektrometrie (IMS) wurde optimiert, um die räumliche Verteilung der molekularen Eigenschaften in drei weit verbreitete Anwendungen charakterisieren: Gewebe Scheiben, Sphäroide und mikrobiellen Kolonien1,2,3. Gewebe-Scheiben können verwendet werden, um die Lokalisierung von Metaboliten im Zusammenhang mit der biologischen Bedingungen in einer Vielzahl, entweder gezielt oder ungezielte innerhalb eines bestimmten Bereichs der Masse zu bewerten. Unterschiede zwischen molekularen Funktionen sind jedoch erhebliche und offensichtlich, wenn ein gesundes Gewebe ist im Vergleich zu einer krankhaften Zustand, z. B. ein Tumor. Dieser IMS-Ansatz eignet sich besonders zum Nachweis von Biomarkern Krankheit, jedoch die Identifizierung von Signalen, die für die Einleitung des wichtig sein könnte schließt Erwerb von Gewebeproben in diskrete Phasen im Krankheitsverlauf (z. B. Tumor-Klasse) der Erkrankung. Der Austausch von Informationen durch den Raum ist eine allgegenwärtige Funktion vieler biologischer Systeme und Gewebe Scheiben dieses dynamischen chemischen Relais nicht erfasst werden. Eine Technik, die Visualisierung von chemischen Austausch und Verbreitung kann ist IMS der mikrobiellen Kolonien auf Agarplatten gewachsen; kleine Moleküle sind in der Lage, durch und über die Agar zu verbreiten und über Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung (MALDI-TOF) Massenspektrometrie4erfasst werden können. Dieses Wachstum-Setup kann verwendet werden, um Moleküle ausgetauscht zwischen diskreten biologische Entitäten (Kolonien) zu identifizieren und Direktionalität der Metabolit Produktion bestimmen kann. Die Plattform, die ursprünglich für mikrobielle Koloniewachstum wurde angepasst um den primären Stoffwechsel der Gewebe Explantaten mit Säugerzellen gewachsen zu erkunden, und IMS wurde verwendet, um den dynamischen chemischen Austausch in einem in vitro Säugetier-System zu bewerten.
In den letzten Jahren ist deutlich geworden, dass hochwertige serösen Ovarialkarzinom (HGSOC) oft ihren in den Eileiter Epithel (FTE Ursprung) und dann der Eierstöcke während der frühen Krankheit Entwicklung5,6, metastasiert 7 , 8. tumorigenic FTE Ausbreitung der Eierstöcke, Zellen, wo große Tumoren schließlich bilden und metastasieren weiter, ist derzeit unklar. Die bisherige Forschung konzentriert sich auf die Rolle der ovarielle Proteine in primären Metastasen in den Eierstock; jedoch wurde kürzlich nachgewiesen, dass der Übergang von einer gesunden zu einem tumorigenic Gewebe zu massiven Störungen des Zellstoffwechsels führt und Produktion von kleinen Molekülen9,10,11verändert. Daher vermutet wir, dass kleine Moleküle, die zwischen der FTE und der Eierstock ausgetauscht für primäre Metastasierung von HGSOC mitverantwortlich sein können.
Mit unserer neu entwickelten IMS-Verfahren haben wir festgestellt, dass Coculture tumorigenic FTE und gesunden Eierstockgewebe die Produktion von Noradrenalin aus dem Eierstock induziert. Jedoch andere Zelltypen oder normalen FTE Zellen dieser Effekt nicht entlocken. Ein außerordentlicher Vorteil dieser Methode ist, dass die molekulare Herstellung und Austausch von Signalen, die reale Molekülen darstellen können visualisiert werden, also auch in einem Coculture ist es möglich, die Quelle eines Signals zu bestimmen. Dies ist ein Vorteil gegenüber homogenisierte Proben, wo sind alle räumlichen Informationen verloren gehen. In unserem Modellsystem konnten wir die Produktion von Noradrenalin Eierstock eindeutig zuordnen. Noradrenalin hat Metastasen und Therapie von Eierstockkrebs in Verbindung gebracht worden, und unsere Erkennung dieses Moleküls hat bestätigt, dass die neuartige Methode der IMS biologisch relevanter Moleküle12,13, aufdecken kann 14. diese Validierung kann wir vorschlagen, dass diese neue Anwendung von IMS kann besonders hilfreich sein, Forschungsgruppen, die versuchen, kleine Moleküle in Coculture Umgebungen zu identifizieren und um frühe Ereignisse zu verstehen, die Transformation der Zelle beeinflussen und Metastasierung. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, die Identität und die räumliche Verteilung von kleinen Molekülen während Austausch zwischen Geweben und Organen, vertreten durch in-vitro- 3D Zellkulturen oder ex Vivo Gewebe aufzuklären.

<table><tbody><tr><td>15 mL Falcon Röhrchen</td><td>Denville</td><td>C1017-O</td><td>Zur Entnahme von Zellen</td></tr><tr><td>8-Well-Kammer (Millipore EZ-Objektträgerkammer)</td><td>Millipore</td><td>PEZGS0816</td><td>Wiederverwendung aus Millipore Millicell EZ-Objektträgerkammer Objektträger</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998-4L</td><td>Lösungsmittel für gesprühte Matrix</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium (&alpha; MEM)</td><td>Fisher</td><td>10-022-CV</td><td>Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Autoflex speed MALDI-TOF LRF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Für die IMS-Datenanalyse</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>Zum Sammeln von Zellen und Entfernen von Überständen</td></tr><tr><td>CHCA Matrix</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8201344</td><td>Matrix auf getrockneten Objektträger gesprüht</td></tr><tr><td>DHB Matrix</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8201346</td><td>Matrix gesprüht auf getrockneten Objektträger</td></tr><tr><td>Einweg-Skalpelle</td><td>Fisher</td><td>22-079-707</td><td>Zur Entfernung der Eierstöcke</td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>Fisher</td><td>13-804-6</td><td>Zur Entfernung der Eierstöcke</td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Medium gemischt mit Agarose</td></tr><tr><td>epidermalem Wachstumsfaktor</td><td>Peprotech Inc.</td><td>100-15</td><td>Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Eppendorf-Röhrchen</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-282</td><td>Für Agarose-Aliquote</td></tr><tr><td>Estradiol-17&beta;</td><td>Simga-Aldrich</td><td>E2758</td><td>Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Denville</td><td>fb5001</td><td>Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>FlexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>IMS Datenerfassungssoftware</td></tr><tr><td>FlexImaging 4.1</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>IMS Datenanalysesoftware</td></tr><tr><td>Pinzette (fein)</td><td>Fsiher</td><td>22-327379</td><td>Zur Entfernung der Eierstöcke</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Cellgro</td><td>30-005-CR</td><td>Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Insulin, Transferrin, Selen (ITS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11074547001</td><td>Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>ITO-beschichteter Objektträger</td><td>Bruker</td><td>8237001</td><td>Plattform für die Inkubation</td></tr><tr><td>von Co-Kulturen Das L-15 Medium</td><td>Gibco</td><td>11415064</td><td>Medium für die Verwendung im Gewebe Dissektion</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Niedrigschmelzende Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>Gemischt mit Medien zum Plattieren</td></tr><tr><td>Medienbecken</td><td>Corning</td><td>4870</td><td>Wird zum Schneiden von Kunststofftrennwänden für geteilte Kammern</td></tr><tr><td>verwendet Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Nahrungsergänzungsmittel</td></tr> <tr><td>für ZellkulturmedienPeptid-Kalibrierstandard</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8206195</td><td>Kalibrant für den mittleren Massenbereich</td></tr><tr><td>Phophorus rot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>343-242-5G</td><td>Kalibrant für den niedrigen Massenbereich</td></tr><tr><td>SCiLS Lab 2015</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>IMS Daten statistische Analyse</td></tr><tr><td>Chirurgische Pinzette (stumpf)</td><td>Fisher</td><td>08-875-8B</td><td>Zur Entfernung der Eierstöcke</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Technologies</td><td>A116-50</td><td>Hinzugefügt zur Matrixlösung</td></tr><tr><td>TM Sprayer</td><td>HTX Technologies</td><td></td><td>Zum Auftragen von Matrix</td></tr></tbody></table>

erfassung von niedermolekularer kommunikation zwischen gewebe und zellen mit hilfe von imaging-massenspektrometrie

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Bildgebende Massenspektrometrie (IMS) routinemäßig auf drei Arten von Proben angewendet wurde: Gewebeschnitte Sphäroide und mikrobiellen Kolonien. Diese Probentypen wurden analysiert mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS), um die Verteilung der Proteine, Lipide und Metaboliten in der biologischen Probe von Interesse zu visualisieren. Wir haben eine neue Probe Vorbereitung Methode entwickelt, die kombiniert die Stärken der drei vorhergehenden Anwendungen an ein unentdecktes Ansatz zur Identifizierung von chemischen Kommunikation bei Krebs, durch impfen Säugerzelle Kulturen in Agarose in coculture mit gesundem Gewebe, gefolgt von Austrocknung der Probe. Säugetier-Gewebe und Zellen sind in der Nähe, so dass chemische Kommunikation über Diffusion zwischen dem Gewebe und Zellen cocultured. Zu bestimmten Zeitpunkten wird die Agarose-basierte Probe auf die gleiche Weise wie mikrobiellen Kolonien vorbereitet für IMS-Analyse getrocknet. Unsere Methode wurde entwickelt, um die Kommunikation zwischen hochwertigem serösen Ovarialkarzinom Eileiter abgeleitet, wie es mit dem Eierstock während Metastasen interagiert zu modellieren. Optimierung der Probenvorbereitung führte bei der Identifizierung von Noradrenalin als chemische Schlüsselkomponente in der Eierstöcke Mikroumgebung. Diese neu entwickelte Methode kann auf anderen biologischen Systemen angewendet werden, die ein Verständnis der chemischen Kommunikation zwischen benachbarten Zellen oder Gewebe erfordern.

Eine optimal getrocknete ITO Folie führt in einer flachen trockenen Probe mit minimale bis keine Falten auf der Oberfläche der Agarose und Agarose-Stücke, die räumliche auf der Folie (Abbildung 3 Trennung). Abbildung 3A zeigt optimale Trocknung, während Abbildung 3 b zeigt die Falten, die vermieden werden sollten. Diese Optimierung erfordert sorgfältige Überwachung der Folie in den Ofen, da die genau...

Ein neuartiges Verfahren der Probenvorbereitung wurde entwickelt, um Platz für Zell- und Coculture um niedermolekulare Exchange über bildgebende Massenspektrometrie zu erkennen.

Erfassung von niedermolekularer Kommunikation zwischen Gewebe und Zellen mit Hilfe von Imaging-Massenspektrometrie

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Unser Protokoll kann die chemische Kommunikation kleiner Moleküle zwischen Zellen und Geweben abbilden, und wir haben dies speziell angewendet, um kleine Moleküle in der Metathese von Eierstockkrebs zu erforschen. Der Hauptvorteil unserer Technik ist die Fähigkeit, kleine Moleküle etikettenfrei zu messen und gleichzeitig die räumliche Integrität von Zellen und Geweben in 2D zu erhalten. Diese Technik hat es uns ermöglicht, den Beitrag kleiner Moleküle in Eierstockkrebsmetastasen in einer ungezielten Weise zu behördlich zu behördlich zu machen.Dies könnte neue therapeutische Ziele und Wege enthüllen, die bisher übersehen wurden. Diese Methode könnte leicht auf andere Krebsarten ausgedehnt werden, die in Agarose und jeder anderen Krankheit angebaut werden können, bei der eine räumliche Komponente für den resultierenden zellulären Phänotyp wichtig sein könnte. Sicherstellen, dass alle Zellen und Komponenten in der Hand sind und Geduld mit dem Trocknungsprozess ist wichtig für dieses Protokoll.Ein überstürzter Austrocknungsschritt kann oft zu qualitativ minderwertigen Massenspektrometriedaten führen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist hilfreich, um unsere Probenvorbereitungs- und Entweibungsschritte zu verstehen, da diese stark von typischen bildgebenden Massenspektrometrieexperimenten abweichen, die Gewebe oder Mikroben auf Agar verwenden. Zunächst die Agarose bei 70 Grad Celsius auf einer Kochplatte verflüssigen.Platzieren Sie den Acht-Well-Teiler auf der ITO-behandelten Rutsche. Durch Standard-Trypsin-Behandlung, sammeln MOE-Zellen in einem 15-Milliliter konischen Rohr, Zentrifuge, und fügen Sie ein mal DMEM-Medien, um eine Konzentration von 50 000 Zellen pro 150 Mikroliter zu erhalten, das ist zwei Mal die gewünschte Enddichte. Für ungeteilte Kokulturen, verwenden Sie Zangen, um Ovarialexplantation in die Mitte der vier Brunnen hinzuzufügen.Kurz vor der Beschichtung 200 Mikroliter Zellsuspension und 200 Mikroliter Liquarierteagarose in einzelnen Zwei-Milliliter-Röhren kombinieren. Vermeiden Sie Luftblasen beim Pipetieren. Sofort 300 Mikroliter der Zell-Agarose-Mischung in jeden Brunnen geben und kontinuierlich sanften Abwärtsdruck auf den Teiler ausüben, um kein Auslaufen oder Mischen zwischen Brunnen zu gewährleisten.Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen gibt und der Eierstock in der Mitte des Brunnens bleibt. Wenn die pipetierte Agarose den Eierstock gestört hat, verwenden Sie vorsichtig die Pipettenspitze, um sie zu zentrieren, bevor die Agarose abkühlt. Dann inkubieren Sie die Rutsche bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator.Für geteilte Kokulturen, geschnittene Trennwände aus dünnem, glattem Kunststoff. Die Seiten eines sterilen Einweg-Medienbeckens werden verwendet. Schneiden Sie sie gerade breit genug, um eng in die Hypotenuse des Brunnens zu passen.Legen Sie den Acht-Well-Teiler auf die ITO-behandelte Rutsche und legen Sie Kunststoffteiler diagonal in Brunnen ein. Bereiten Sie Zellkulturen wie bisher vor und kombinieren Sie 100 Mikroliter Zellsuspension und 100 Mikroliter Liquified Agarose in einem Zwei-Milliliter-Rohr. Sofort, Platte 150 Mikroliter Zell-Agarose-Mischung auf einer Seite des Teilers unter Beibehaltung des Abwärtsdrucks auf den Teiler.Lassen Sie Agarose für etwa eine Minute abkühlen und erstarren, und entfernen Sie dann den Teiler. Verwenden Sie Zangen, um Eierstock-Explantation in der Mitte der leeren Hälfte des Brunnens zu platzieren. 150 Mikroliter Zell-Agarose-Mischung über die Oberseite des Eierstocks geben.Inkubieren Sie die Rutsche bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator. Nach vier Tagen den Kammerteiler aus den Agarose-Steckern entfernen. Mit einem flachen Spachtel die Seiten der Agarose aus der Kammer lösen und die Kammer sanft nach oben ziehen.Wenn Agarose-Stecker bewegt werden, positionieren Sie sie vorsichtig neu, damit sie sich nicht berühren. Legen Sie die Rutsche für etwa vier Stunden in einen 37-Grad-Celsius-Ofen und drehen Sie jede Stunde 90 Grad, um eine gleichmäßige Wärmeverteilung in der gesamten Probe zu gewährleisten. Die Rutsche muss vollständig getrocknet sein.Andernfalls kann es zu einer Explosion der Probe im Hochvakuumdes des MALDI-TOF-Massenspektrometers kommen. Das Trocknen des Schlittens und die Überwachung des Fortschritts ist der wichtigste Schritt, um eine hohe räumliche Auflösung und hochwertige Massenspektren zu erreichen. Wenn Abplatzungen oder übermäßige Falten auftreten, empfehlen wir nicht, die Massenspektrometriedaten zu sammeln.Wenn die Parameter auf dem Matrixsprüher eingestellt sind, wenden Sie die Matrixlösung auf das Dia an. Um Phosphorrot als Kalibrant zu verwenden, fügen Sie einen Mikroliter Phosphorrot an eine klare Stelle auf der Folie hinzu. Um die Peptidmischung als Kalibrant zu verwenden, mischen Sie sie mit Matrix auf Parafilm im Eins-zu-Eins-Verhältnis, um die Ionisierung zu unterstützen, und erkennen Sie 0,5 bis einen Mikroliter auf dem Dia.Warten Sie, bis der Kalibrant trocken ist, bevor Sie die Datenerfassung der Massenspektrometrie abbilden. Zeichnen Sie ein X mit einem permanenten Marker in jeder Ecke des Dias, und nehmen Sie ein optisches Bild mit einer Kamera oder einem Scanner bei 1200 dpi auf. In diesem Experiment ist eine sorgfältige Überwachung des Schlittens im Ofen unerlässlich, um einen optimalen getrockneten ITO-Schlitten zu gewährleisten, der zu einer flachen ausgetrockneten Probe mit minimalen bis keinen Falten über der Oberfläche der Agarose führt.Diese Abbildung zeigt die Falten, die vermieden werden sollten. Falten können die Höhe und damit die Massengenauigkeit der bildgebenden Massenspektrometriesignale leicht beeinflussen. Leichte Falten wirken sich nicht auf die Qualität der Daten aus.Ein optimal gelegenes Gewebe sollte so nah wie möglich am Zentrum sein. Das verwendete Gewebe sollte sich in der Mitte des Brunnens befinden, wenn es ungeteilt ist, oder in der Mitte des halben Dreiecks, wenn es geteilt wird, so dass die Erfassung von IMS-Daten nicht mit Kanteneffekten kontaminiert ist. Schlecht positioniertes Gewebe kann, wenn es abgebildet wird, zu falschen Massensignalen der Kanteneffekte führen.Das getrocknete Diabild wird verwendet, um dem MALDI-TOF-Massenspektrometer beizubringen, welche Bereiche abbilden. Kleine Regionen um das Eierstockgewebe wurden für IMS mit 50 Mikrometern ausgewählt. Ein repräsentatives Bild eines m-over-z Signals wird für ungeteilte Kokulturen sowie für geteilte Kammeraufbauten dargestellt.Das Wichtigste ist, dass die resultierenden Daten nur so gut sind wie die Probenvorbereitung. Achten Sie besonders auf den Trocknungsprozess. Der spannendste Aspekt ist die Validierung der kleinen Moleküle, die auf diese Weise mit anderen Experimenten wie Invasions-Assays oder Kolonisationstests entdeckt wurden, um über die effektive Konzentration zu informieren und in die menschliche Biologie zu übersetzen.Wir erwarten, dass dies die Tür öffnen wird, um neue Wege potenzieller therapeutischer Ziele für Eierstockkrebs zu entdecken, indem wir die Prozesse in der primären Metathese von Eierstockkrebs besser verstehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Desorption Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (DESI-MS) ist eine Methode, mit der Umgebungsluft Proben, einschließlich biologischen Geweben, mit minimaler Probenvorbereitung abgebildet werden kann. Durch Rastern der Probe unterhalb der Ionisationselektrode, bietet dieses Spray-basierte Technik ausreichender räumlicher Auflösung auf molekularen Eigenschaften von Interesse in Gewebeschnitten zu erkennen.

Imaging von biologischem Gewebe durch Desorption Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Hier präsentieren wir Protokolle zur Durchführung sowohl der Umgebungsmassenspektrometrie-Bildgebung (MSI) von Geweben als auch der In-situ-Live-Einzelzell-MS (SCMS)-Analyse mit der Einzelsonde, einem miniaturisierten multifunktionalen Gerät für die MS-Analyse.

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Für den Einsatz in Verbindung mit einem Einzelsonden-Massenspektrometrie-Setup wird eine integrierte Zellmanipulationsplattform für die Online-Analyse einzelner Suspensionszellen unter Umgebungsbedingungen entwickelt.

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Das Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur Probenvorbereitung bei der Planung von Experimenten mit MALDI MSI zur Maximierung des metabolischen und molekularen Nachweises in biologischen Proben bereitzustellen.

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Im Zeitalter der Krebsimmuntherapie hat das Interesse an der Aufklärung der Dynamik der Tumormikroumgebung markant zugenommen. Dieses Protokoll beschreibt eine massenspektrometrische Bildgebungstechnik in Bezug auf ihre Färbe- und Bildgebungsschritte, die eine stark gemultiplexte räumliche Analyse ermöglichen.

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Eine neuartige Probenvorbereitungsmethode wird für die Analyse von agarbasierten, bakteriellen Makrokolonien mittels matrixunterstützter Laserdesorptions-/Ionisationsbildgebungs-Massenspektrometrie demonstriert.

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Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von microMS für die fluoreszenzgesteuerte Einzelzell-MALDI-2-Massenspektrometrie, die ein verbessertes molekulares Profiling von primären neuronalen Zellen der Ratte ermöglicht.

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Dieses Protokoll zielt darauf ab, Zellmetaboliten für die Einzelzell-Massenspektrometrie (SCMS) zu konservieren, indem es das Waschen flüchtiger Salzlösungen, das schnelle Abschrecken von flüssigem Stickstoff, die Gefriertrocknung und die Lagerung bei -8 °C kombiniert. Es zeigt, dass die Abschreckung von flüssigem Stickstoff für die Aufrechterhaltung von Metabolitenprofilen unerlässlich ist, während eine längere Kühllagerung minimiert werden sollte, um metabolische Veränderungen zu vermeiden.

Probenvorbereitung für Einzelzell-Massenspektrometrie-Metabolomik-Studien: Kombiniertes Waschen, Abschrecken, Trocknen und Lagern von Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Einzelzell-Massenspektrometrie-Bildgebung von OVCAR-8-Zellen unter Verwendung von Desorptionselektrospray-Ionisation, gekoppelt mit Orbitrap-Massenspektrometern für hochauflösende metabolomische Analysen.

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Erfahren Sie die Kartierung niedermolekularer Kommunikation zwischen Zellen und Geweben mittels Imaging-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die unbeschriftete Analyse kleiner Moleküle bei Eierstockkrebs.

Erfassung von niedermolekularer Kommunikation zwischen Gewebe und Zellen mit Hilfe von Imaging-Massenspektrometrie

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