Name: Isolierung und quantitative Auswertung von Bürstenzellen von Maustracheas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Isolierung von Bürstenzellen aus der Maustrachea mit Papain und Dispase. Diese Technik ermöglicht die quantitative Auswertung lebensfähiger Zellen für RNA-Sequenzierung und funktionale Analysen.

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Wir danken Adam Chicoine vom Brigham and Women es Human Immunology Center Flow Core für seine Hilfe bei der zytometrischen Sortierung durch Fluss. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B) und K08 AI132723 (L.G.B) und von der American Academy of Allergy, Asthma, and Immunology (AAAAI)/ American Lung Allergic Respiratory Disease Award (N.A.B.), durch den AAAAI Foundation Faculty Development Award (L.G.B.), den Steven and Judy Kaye Young Innovators Award (N.A.B.), den Joycelyn C. Austen Fund for Career Development of Women Physician Scientists (L.G.B.) und großzügige Spende der Familie Vinik (L.G.B.).

Stellen Sie vor der Durchführung der folgenden Experimente sicher, dass alle Tierpflege- und -protokolle vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung (IACUC) genehmigt und in Übereinstimmung mit dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortiere" (8. Auflage, 2011) und die ARRIVE-Richtlinien. Alle nachstehend beschriebenen Verfahren wurden vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung im Brigham and Women es Hospital überprüft und genehmigt.
1. Herstellung von Reagenzien
<ol><li>Bereiten Sie die Dispase-Verdauungslösung vor, bei der es sich um eine PBS-Lösung handelt, die 16 U/ml-Dispase und 20 g/ml DNase I enthält. Stellen Sie sicher, dass das Dispasepulver vollständig gelöst ist, bevor Sie die Lösung in einem Wasserbad bei 37 °C aufwärmen.</li>
	<li>Fügen Sie 5% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) zu Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) hinzu, um eine Stopplösung zu finden.</li>
	<li>Vorbereiten Tyrode I Puffer: Fügen Sie 26 U/ml Papain (20 l/ml 48 U/mg Papain-Lösung) und 10 l/ml L-Cystein in den Puffer von HEPES-Tyrode ohne Kalzium.</li>
	<li>Vorbereiten Des Tyrode II-Puffers: 2 L/ml Leupeptin (5 mg/ml) mit Kalzium in den Puffer von HEPES-Tyrode geben.</li>
	<li>FACS-Puffer vorbereiten: Verwenden Sie Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Calcium, Magnesium & Phenolrot, ergänzt mit 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und fügen Sie 2% FBS hinzu.</li>
</ol>2. Zerlegung der Maus-Trachea
HINWEIS: Mäuse, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind ChAT(BAC)-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23- 268L19-EGFP)2Mik/J), 3-6 Monate alt von beiden Geschlechtern. Minimieren Sie die Exposition des Gewebes, Licht zu lenken, um photobleaching von eGFP zu reduzieren.
<ol><li>Euthanisieren Sie die Maus mit 100 mg/kg Pentobarbital Euthanasie-Lösung intraperitoneal oder mit Standardprotokollen von der IACUC genehmigt injiziert.</li>
	<li>Fixieren Sie die Maus auf einem chirurgischen Brett in der Supine-Position mit 21 G Nadeln mit verlängerten oberen und unteren Extremitäten. Sprühen Sie das Fell mit 70% EtOH, um den Bereich zu desinzipieren.</li>
	<li>Mit geraden Zangen, heben Sie die Haut und das Fell des Bauches und machen einen Schnitt in der Mitte mit sezierender Schere (gerade Schere, 3 cm). Mit der Schere, trennen Sie die Haut vom subkutanen Gewebe vom Bauch zur Mandibula. Während Sie das unterkutane Gewebe mit der Zange hochhalten, machen Sie einen kleinen Schnitt mit der Schere in der Mitte der Bauchwand.</li>
	<li>Öffnen Sie das Peritoneum mit einem V-förmigen Schnitt. Mit der Zange bewegen Sie den Dünndarm vorsichtig zur Seite, lokalisieren Sie die Bauchaorta und Vena cava und machen Sie einen Schnitt mit der sezierenden Schere, um eine schnelle Exsanguination zu ermöglichen.</li>
	<li>Suchen Sie die Membran. Mit einer 18 G Nadel, machen Sie eine Öffnung im Zwerchfell direkt unter dem Brustbein, um die Lunge zu entschärfen. Trennen Sie das Zwerchfell vorsichtig vom Rippenkäfig mit einer scharfspitzen geraden Sezierenderschere, um entlang der Unterbasis der Rippen zu schneiden.</li>
	<li>Heben Sie mit der Zange das exponierte Ende des Brustbeins an und schneiden Sie das Brustbein längs von der Basis des Rippenkäfigs bis zum Hals. Machen Sie einen zentralen Zervixschnitt mit kurzer gerader Schere (2 cm) und trennen Sie die beiden Lappen der submandibulären Drüse.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig das umgebende Bindegewebe und den Thymus, der die Carina mit einem Paar feinfeiner, hochpräziser Zange überlagert.</li>
	<li>Sezieren Sie die Luftröhre zuerst frei, indem Sie das proximale Ende auf der Ebene der Epiglottis trennen und dann das distale Ende auf der Ebene der Bifurkation der Luftröhre sezieren.</li>
	<li>Suchen Sie die Epiglottis und schneiden Sie die Luftröhre längs von den Epiglottis zur Carina.</li>
</ol>3. Tracheal epitheliale Verdauung
<ol><li>Legen Sie die Luftröhre in ein 1,5 ml-Rohr mit 750 l vorgewärmter (auf 37 °C) Dispase-Verdauungslösung. Auf einem Shaker bei 200 Rpm für 40 min bei Raumtemperatur bebrüten. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie, um die Belichtung von direktem Licht zu reduzieren.</li>
	<li>Fügen Sie 750 l kaltes DMEM mit 5% FBS hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Auf Eis legen.</li>
	<li>Die Luftröhre auf eine Petrischale (100 mm x 15 mm) geben und unter ein Seziermikroskop stellen. Richten Sie die Luftröhre mit der epitheliale Seite nach oben. Die längs sezierte Luftröhre hat eine halbzylindrische Form, die von den Knorpelringen gepflegt wird. Das Epithel befindet sich auf der konkaven Oberfläche.</li>
	<li>Tether der Epiglottis Bereich der Luftröhre mit geraden Zangen auf die Petrischale und mit einem Einwegsskalpell der Größe 22, kratzen Sie das Epithel von der Luftröhre. Die Epithelschicht trennt sich als transluzentes Blatt.</li>
	<li>Das Epithel mit dem Skalpell zerkleinern. Übertragen Sie die Epithelschicht in ein 2 ml-Rohr.</li>
	<li>Spülen Sie die Petrischale mit 750 L Tyrode I Puffer und übertragen Sie in das 2 ml Rohr, das die Epithelschicht enthält.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Trachealepithelschicht in Tyrode I 30 min bei 37 °C auf einem Shaker bei 200 Rpm puffern. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie, um die Belichtung von direktem Licht zu reduzieren.</li>
	<li>Fügen Sie 750 l kalten Tyrode II Puffer hinzu. Das verdaute Gewebe für 20-30 s kräftig vortexen. Das Homogenat mit einer Spritze, die an einer 18 G Nadel befestigt ist, 10 Mal trituieren.  Wechseln Sie zu einer 21 G-Messnadel und trituieren Sie 10-20 Mal.</li>
	<li>Filtern Sie die Zellen durch ein 100-m-Sieb in ein 50 ml konisches Rohr. Fügen Sie 30:1 Vol/Vol des kalten FACS-Puffers hinzu.</li>
	<li>Drehen Sie bei 350 x g für 10 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet im kalten FACS-Puffer aussetzen und die Suspension auf ein 12 mm x 75 mm (5 ml) Polystyrolrohr übertragen. Drehen Sie bei 350 x g 10 min bei 4 °C wieder und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Setzen Sie das Pellet in 100 L FACS-Puffer wieder aus.</li>
	<li>Fügen Sie 1 L Anti-Maus-CD16/32-Blockierungsantikörper hinzu, um unspezifische Bindungen zu blockieren und 15 min auf Eis zu brüten. Nicht waschen.</li>
	<li>Fügen Sie die folgenden Antikörper und die entsprechenden Isotyp-Steuerelemente hinzu: pazifischeblaue Anti-Maus-CD45 oder Ratte IgG2a, k (0,25 g/106 Zellen in 100 L Volumen) und Allophycocyanin (APC) Anti-Maus-EpCAM oder Ratte IgG2b, k (0,5 g/106 Zellen in 100 l Volumen) monoklonale Antikörper. 45 min auf Eis vor direktem Licht geschützt. 4,5 ml kalter FACS-Puffer hinzufügen, bei 350 x g mischen und drehen, 10 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den FACS-Puffer, und setzen Sie das Pellet in 300 L kalten FACS-Puffer wieder auf.</li>
	<li>Fügen Sie Propidiumiodid (PI) (5 g/ml) unmittelbar vor der zytometrischen Durchflusssortierung hinzu. HINWEIS: Pinselzellen haben eine unregelmäßige Form mit mehreren Prozessen, die ihre Einhaltung von Filtern erhöhen könnten (Abbildung 3C). Wir verglichen 30 mm mit 70 mm und 100 mm Filter und stellten fest, dass größere Porenfilter für bessere Erträge sorgten. Darüber hinaus verbessert eine gründliche Triturierung der Zellsuspension nach der Papainverdauung die Ausbeute der Bürstenzelle signifikant. Wir empfehlen die Verwendung einer 18G-Nadel für die anfängliche Trituration, gefolgt von einer kleineren Bohrung (21 oder 23 G Nadel) zur feineren Trennung von Zellen.</li>
</ol>4. Flow Cytometry Gating Strategie
<ol><li>Identifizieren Sie Zellen aus Schutt durch vorwärts und seitlichen Streuwinkel. Schließen Sie die Doublets mit Vorwärtsstreuhöhe und -breite und seitenstreuungshöhe und -breite aus. Die Doublets wären die Zellen mit hohen Breitenwerten.</li>
	<li>Identifizieren Sie innerhalb der einzelnen Zellen die lebenden Zellen als die Population, die PI-negativ ist.</li>
	<li>Identifizieren Sie innerhalb der einzelnen Einzelzellen die CD45-Zellen mit niedrigen bis negativen Zellen basierend auf der Isotypkontrolle.</li>
	<li>Identifizieren Sie innerhalb der CD45-Low/Negativ-Zellen die EpCAM-positiven Zellen, die ebenfalls eGFP-positiv sind (im FITC-Kanal). Dies ist die Grundgesamtheit der Pinselzellen (Abbildung 2A).</li>
</ol>

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<li>Deckmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bitter+triggers+acetylcholine+release+from+polymodal+urethral+chemosensory+cells+and+bladder+reflexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Wir fanden heraus, dass eine Kombination von hochdosierter Dispase-Behandlung für 40 min gefolgt von einer kurzen Papain-Behandlung (30 min) ein optimales Protokoll für die Trachealverdauung und die Isolierung von Bürstenzellen bietet. Diese Kombination vermeidet eine umfangreiche Verdauung und erzeugt die höchste Ausbeute an Bürstenzellen im Vergleich zu alternativen Protokollen.
Während die Lungenverdauung zur Extraktion hämatopoetischer Zellen sich klassischerweise auf milde Verdauungsenzym...

Pinselzellen gehören zu einer Klasse von chemosensorischen Epithelzellen, die sich durch die Expression von bitteren Geschmacksrezeptoren und der Geschmacksrezeptor-Transduktionsmaschinerie in Geschmacksknospenzellen auszeichnen. Im Gegensatz zu Geschmacksknospenzellen sind chemosensorische Epithelzellen in epithelialen Oberflächen verstreut und werden als einsame chemosensorische Zellen (SCCs) und mikrovillous Zellen im Nasenepithel1,2, Bürstenzellen in der Luftröhre bezeichnet 3,4und Büschelzellen im Darm5,6. Epithelzellen, die bittere Geschmacksrezeptoren und die bitteren Geschmackstransduktionsmaschinen exdrücken, finden sich auch in der Harnröhre7,8 und der Gehörröhre9. Atemwegsbürstenzellen haben einzigartige Funktionen in neurogenen und immunen Atemwegsreaktionen. Sie sind Acetylcholin-produzierende Chemosensorienzellen, die bei Aktivierung mit Bitterverbindungen und bakteriellen Metaboliten wie quorum-sensing Substanzen10schützende Atemreflexe evozieren. Atemwegsbürstenzellen sind auch die dominante Atemwegsepithelquelle von IL-25, die aeroallergen-entlöste Typ-2-Entzündungen in den Atemwegen reguliert3.
Die Charakterisierung des vollständigen Transkriptoms der unteren Atemwegsbürstenzellen und ihre Reaktion auf Umweltreize wurde durch ihre geringe Anzahl im Trachealepithel und sehr begrenzte Zahlen über die großen Bronchien hinaus begrenzt10. Techniken zur Isolierung von chemosensorischen Zellen aus dem Darmepithel haben keine proportional hohen Zahlen aus der Luftröhre ergeben, möglicherweise aufgrund der intimen Kontakte von Trachealbürstenzellen mit Nervenenden10 oder anderen gewebespezifische Faktoren in der Atemschleimhaut wie die Zusammensetzung von Aufenthalten und engen Knotenproteinen. Jüngste Berichte über eine erfolgreiche Isolierung von Trachealbürstenzellen in höheren Zahlen für die einzellige RNA-Sequenzierungsanalyse verwendeten entweder eine 2 h Inkubation mit Papain oder eine 18 h Inkubation mit Pronase11,12. Da längere Inkubationen mit Verdauungsenzymen die Zelllebensfähigkeit verringern und das Transkriptionsprofil von Zellen aus verdauten Geweben verändern können13, könnte dies eine vergleichende Analyse mit anderen chemosensorischen Epithelpopulationen vortragen.
Hier berichten wir über eine Methode zur Isolierung von Trachealbürstenzellen zur RNA-Sequenzierung3. Die Behandlung der Luftröhre mit hochdosierter Dispase trennt das Epithel von der Submucosa. Die anschließende Verdauung des Epithelblatts mit Papain ermöglicht eine hervorragende Rückgewinnung dieser Strukturzelle.

<table><tbody><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP (Polyklonale Ziege Ig)</td><td>Abcam</td><td>cat# ab5450</td><td></td></tr><tr><td>APC Anti-Maus CD326 (EpCAM)&nbsp; (G8.8)</td><td>Biolegend</td><td>Katze#118214</td><td></td></tr><tr><td>APC Ratte IgG2a, k Isotypkontrolle</td><td>Biolegend</td><td>Katze#400511</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biolegend</td><td>Katze#422801</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Ziege IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies/Molekulare Sonden</td><td>Kat#A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegen-IgG</td><td>R& D Systems</td><td>cat#AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue Anti-Maus CD45 (30F-11)</td><td>Biolegend</td><td>cat#103126</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue Rat IgG2b, k Isotypkontrolle</td><td>Biolegend</td><td>cat#400627</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX (Anti-Maus CD16/32) Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>cat#101320</td><td></td></tr><tr><td>Chemikalien, Peptide und rekombinante Proteine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>Kat# 17105041&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Kat# 10104159001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Tyrode' s Puffer ohne Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0,4 mM NaH2PO4, 0,25% BSA, 5,5 mM Glukose. Zubereitet in 18,2 Megaohm Wasser und gefiltert durch 0,22 & Mikro; m Filter</td><td>Boston BioProducts</td><td>Kat# PY-912</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s Lösung (HEPES-gepuffert) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 und 10 mM Glukose. Zubereitet in 18,2 Megaohm Wasser und gefiltert durch 0,22 & Mikro; m Filter. )</td><td>Boston BioProducts</td><td>Kat# BSS-355</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma</td><td>Kat# C7352</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin Trifluoracetatsalz</td><td>Sigma</td><td>Katze# L2023</td><td></td></tr><tr><td>Papain aus Papayalatex</td><td>Sigma</td><td>Katze# P3125</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>cat# P4170</td><td></td></tr><tr><td>Experimentelle Modelle: Organismen/Stämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChATBAC-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7902</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td>LSM 800 mit konfokalem Airyscan-System<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; auf a&nbsp; Zeiss Axio Observer Z1 Inverses Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td>647465</td><td></td></tr><tr><td>Einweggeräte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL sterile Röhrchen</td><td>Thomas Scientific</td><td>1157C86</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Poysteren-Röhrchen mit rundem Boden, 12 mm x 75 mm Ausführung</td><td>Falcon</td><td>14-959-1A</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Röhrchen aus Polypropylen, 30 mm x 115 mm</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Feather Einweg-Skalpell Nr. 12</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9999403</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale, 100 mm x 15 mm Style</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Zellsieb, 100 & mu; m</td><td>Fisherbrand</td><td>Kat#22363549</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und quantitative auswertung von bürstenzellen von maustracheas

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Trachealbürstenzellen sind cholinerge chemosensorische Epithelzellen, die bereit sind, Signale aus dem Atemwegslumen an das Immunsystem und das Nervensystem zu übertragen. Sie sind Teil einer Familie von chemosensorischen Epithelzellen, die Tuffsteinzellen in der Darmschleimhaut, Bürstenzellen in der Luftröhre und einsame chemosensorische und mikrovillous Zellen in der Nasenschleimhaut enthalten. Chemosensorische Zellen in verschiedenen Epithelkompartimenten teilen sich wichtige intrazelluläre Marker und eine transkriptionelle Kernsignatur, weisen aber auch eine signifikante transkriptionelle Heterogenität auf, die wahrscheinlich die lokale Gewebeumgebung widerspiegelt. Die Isolierung von Trachealbürstenzellen aus einzelzelligen Suspensionen ist erforderlich, um die Funktion dieser seltenen Epithelzellen im Detail zu definieren, aber ihre Isolierung ist eine Herausforderung, möglicherweise aufgrund der engen Wechselwirkung zwischen Trachealbürstenzellen und Nervenenden oder aufgrund der luftwegspezifischen Zusammensetzung von engen und haftenden Kreuzungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung von Bürstenzellen aus Maustrachealepithel. Das Verfahren basiert auf einer anfänglichen Trennung des Trachealepithels von der Submucosa, was eine spätere kürzere Inkubation des Epithelblatts mit Papain ermöglicht. Dieses Verfahren bietet eine schnelle und bequeme Lösung für die zytometrische Durchflusssortierung und funktionelle Analyse lebensfähiger Trachealbürstenzellen.

Dieses Verfahren wurde erfolgreich implementiert, um Trachealbürstenzellen für die RNA-Sequenzierung3zu isolieren. Nach Isolierung der Luftröhre und Verdauung des Gewebes mit einem 2-stufigen Protokoll (Abbildung 1) wurden Zellen gesammelt und mit fluoreszierend gekennzeichneten CD45 und EpCAM nach Ausschluss abgestorbener Zellen mit PI gefärbt. Nachdem wir Doublets basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuungsmerkmalen herausgezäunt hatten, definierten wir Bürstenzelle...

Pinselzellen sind seltene cholinerge chemosensorische Epithelzellen, die in der naiven Maustrache gefunden werden. Aufgrund ihrer begrenzten Anzahl ist die Ex-vivo-Bewertung ihrer funktionellen Rolle bei der Atemwegsimmunität und dem Umbau eine Herausforderung. Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung von Trachealbürstenzellen durch Durchflusszytometrie.

Isolierung und quantitative Auswertung von Bürstenzellen von Maustracheas

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Wir entwickelten ein Verfahren zur Isolierung von Trachealbürstenzellen, seltenen spezialisierten chemosensorischen Epithelzellen aus Cholin-Acetyltransferase-Fluoreszenz-Reportermäusen. Diese Methode basiert auf einer anfänglichen Trennung des Trachealepithels von der Submucosa, was eine spätere kürzere Inkubation des Epithelblatts mit Papain ermöglicht. Dies ermöglicht eine robuste Wiederherstellung von Trachealbürstenzellen und wurde erfolgreich für die Isolation und Transkriptionsanalyse von Bürstenzellen durch RNA-Sequenzierung eingesetzt.Eine lange Inkubation mit Verdauungsenzymen kann die Zelllebensfähigkeit verringern und das Transkriptionsprofil von Zellen verändern, die aus Geweben isoliert sind. Hier trennen wir das Trachealepithel mit Dispase und inkubieren es anschließend für kurze Zeit mit Papain und produzieren hohe Erträge lebensfähiger Bürstenzellen. Unsere Methode kann zu Studien des epithelischen Oberatemepithels beitragen.Das gleiche Protokoll kann angewendet werden, um Bürstenzellen von anderen Schleimhautstellen wie Nasengewebe zu isolieren. Die Demonstration unserer hochreproduzierbaren Technik wird es Peer-Wissenschaftlern ermöglichen, Trachealbürstenzellen zu isolieren und weiter zu untersuchen. Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie Dispase und DNase I zu PBS bei den letzten Konzentrationen hinzu, die hier gezeigt werden, um die Dispase-Verdauungslösung vorzubereiten.Stellen Sie sicher, dass das Dispasepulver vollständig gelöst ist, bevor Sie die Lösung in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius aufwärmen. Fügen Sie als Nächstes 5% hitzeaktiviertes FBS zu DMEM hinzu, um eine Stopplösung vorzubereiten. Um den Tyrode I Puffer vorzubereiten, fügen Sie Papain und L-Cystein in den Puffer von HEPES Tyrode ohne Kalzium hinzu.Um den Tyrode II Puffer vorzubereiten, fügen Sie Leupeptin in den Puffer von HEPES Tyrode ohne Kalzium in einer Konzentration von zwei Mikrolitern pro Milliliter hinzu. Zur Vorbereitung des FACS-Puffers verwenden Sie Hanks Balanced Salt Solution ohne Kalzium, Magnesium und Phenolrot, ergänzt mit zwei Millimolaren EDTA und 2%FBS. Nach der Einschläferung der Maus, verwenden Sie 21 Messgerät Nadeln, um es auf einem chirurgischen Brett in der Supine-Position mit verlängerten oberen und unteren Extremitäten zu fixieren.Das Fell mit 70% Ethanol besprühen, um den Bereich zu desinzipieren. Mit geraden Zangen, heben Sie die Haut und das Fell des Bauches und verwenden Sezieren Schere, um einen Schnitt in der Mitte zu machen. Mit der Schere, trennen Sie die Haut vom subkutanen Gewebe vom Bauch zur Mandibula.Während Sie das unterkutane Gewebe mit der Zange hochhalten, machen Sie einen kleinen Schnitt mit der Schere in der Mitte der Bauchwand. Öffnen Sie dann das Peritoneum mit einem V-förmigen Schnitt. Mit der Zange, bewegen Sie den Dünndarm vorsichtig zur Seite.Suchen Sie die Bauchaorta und Vena cava und machen Sie einen Schnitt mit der sezierenden Schere, um eine schnelle Exsanguination zu ermöglichen. Suchen Sie die Membran. Mit einer 18-Meter-Nadel, machen Sie eine Öffnung im Zwerchfell direkt unter dem Brustbein, um die Lunge zu entschärfen.Mit scharfspitzer gerader Sezierenderschere entlang der Unterbasis der Rippen schneiden, um das Zwerchfell vorsichtig vom Brustkorb zu trennen. Verwenden Sie die Zange, um das exponierte Ende des Brustbeins zu heben und schneiden Sie das Brustbein längs von der Basis des Brustkorbs bis zum Hals. Verwenden Sie kurze gerade Schere, um einen zentralen Zervixschnitt zu machen und trennen Sie die beiden Lappen der submandibulären Drüse.Danach verwenden Sie ein Paar feinpunkthohe Präzisionszange, um das umgebende Bindegewebe und den Thymus, der die Carina überlagert, vorsichtig zu entfernen. Sezieren Sie die Luftröhre frei, indem Sie zuerst das proximale Ende auf der Ebene der Epiglottis trennen und dann das distale Ende auf der Ebene der Bifurkation der Luftröhre sezieren. Suchen Sie die Epiglottis und schneiden Sie die Luftröhre längs von den Epiglottis zur Carina.Um zu beginnen, legen Sie die Luftröhre in eine 1,5 Milliliter Tube mit 750 Mikroliter Dispase-Verdauungslösung vorgewärmt auf 37 Grad Celsius. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie, um die Exposition gegenüber direktem Licht zu reduzieren und auf einem Shaker bei 200 U/min und bei Raumtemperatur für 40 Minuten zu brüten. Dann 750 Mikroliter DMEM mit 5%FBS hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen und die Röhre auf Eis zu legen.Die Luftröhre in eine Petrischale geben. Richten Sie die Luftröhre mit der epitheliale Seite nach oben. Die längs sezierte Luftröhre hat eine halbzylindrische Form, die von den Knorpelringen gepflegt wird.Das Epithel befindet sich auf der konkaven Oberfläche. Mit geraden Zangen, tether die Epiglottis Bereich der Luftröhre an die Petrischale und verwenden Sie eine Größe 22 Entsorgung Skalpell, um das Epithel von der Luftröhre zu kratzen. Die Epithelschicht trennt sich als transluzentes Blatt.Verwenden Sie das Skalpell, um das Epithel zu zerkleinern und die Epithelschicht in ein Zwei-Milliliter-Rohr zu übertragen. Spülen Sie die Petrischale mit 750 MikroliterTyrode I Puffer und übertragen Sie diese in das Rohr, das die Epithelschicht enthält. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie, um die Exposition gegenüber direktem Licht zu reduzieren und bei 37 Grad Celsius auf einem Shaker bei 200 U/min für 30 Minuten zu brüten.Dann 750 Mikroliter kalten Tyrode II Puffer hinzufügen. Wirbeln Sie das verdautgewebe 20 bis 30 Sekunden lang kräftig aus. Mit einer Spritze, die an einer 18-Spur-Nadel befestigt ist, trituieren Sie das Homogenat 10 Mal.Danach wechseln Sie zu einer 21-Spur-Nadel und trituieren Sie 10 bis 20 Mal mehr. Filtern Sie die Zellen durch ein 100-Mikrometer-Sieb in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Fügen Sie kalten FACS-Puffer bei einem volumetrischen Verhältnis von 30 zu eins hinzu.Zentrifuge bei 350 mal g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet im kalten FACS-Puffer wieder auf. Übertragen Sie diese Suspension auf ein 12 mal 75 Millimeter Polystyrolrohr.Zentrifuge wieder bei 350 mal g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter FACS-Puffer wieder auf. Als Nächstes fügen Sie einen Mikroliter Anti-Maus-CD1632 blockierenden Antikörper hinzu, um unspezifische Bindungen zu blockieren und 15 Minuten lang auf Eis zu brüten.Fügen Sie dann Antikörper in die jeweiligen Isotype-Steuerelemente ein, wie im Textprotokoll beschrieben. 45 Minuten auf Eis bebrüten, während sie vor direktem Licht geschützt sind. Danach 4,5 Milliliter kalten FACS-Puffer hinzufügen und mischen.Zentrifuge bei 350 mal g und bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 300 Mikroliter kalten FACS-Puffer wieder auf. Fügen Sie Propidiumiodid unmittelbar vor der zytometrischen Durchflusssortierung hinzu.In dieser Studie werden Trachealbürstenzellen von ChAT eGFP Acetylcholin-Fluoreszenz-Reportermäusen erfolgreich für die RNA-Sequenzierung isoliert. Zellen werden aus Dentrümmern durch vorwärts und seitlichen Streuwinkel identifiziert. Doublets werden mit Vorwärtsstreuhöhe und -breite und Seitenstreuhöhe und -breite ausgeschlossen.Die Doublets sind die Zellen mit hohen Breitenwerten. Innerhalb der einzelnen Zellen werden die lebenden Zellen als die Population identifiziert, die Propidiumiodid negativ ist. Innerhalb der lebenden Einzelzellen werden die CD45-Niedrigen bis negativen Zellen anhand der Isotypkontrolle identifiziert.Innerhalb der CD45-Schwachzellen sind die EpCAM-positiven Zellen, die auch eGFP-positiv im FITC-Kanal sind, die Population von Pinselzellen. Pinselzellzahlen werden durch die Exposition gegenüber mikrobiellen Metaboliten und Protozoen verändert und spiegeln daher die Variabilität der institutionellen Mikrobiota wider. Daher schlagen wir vor, die Anzahl der Pinselzellen durch Fluoreszenzmikroskopie abzuschätzen, um die erwartete Anzahl isolierter Pinselzellen durch zytometrische Durchflusssortierung zu messen.Achten Sie darauf, die Epithelschicht der Luftröhre richtig zu trennen, da sie die Erträge isolierter Bürstenzellen bestimmt. Die isolierten Trachealbürstenzellen können in einer breiten Palette von Assays wie RNA-Sequenzierung, Zellkultur und funktionelle Analyse eingesetzt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Pulmonale Epithelzellen aus den Atemwegen von Mäusen isoliert und kultiviert bei Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche als ein Modell der differenzierten respiratorischen Epithels. Ein Protokoll ist für die Isolierung, Kultivierung und Freilegen dieser Zellen zu Mainstream Zigarettenrauch beschrieben, um molekulare Antworten zu diesem Umweltgift zu studieren.

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In vitro Modell zur Untersuchung der Differenzierung und Veränderung von Multi-Omics an murinen Atemwegsepithelzellen, die mit Zigarettenrauchextrakt stimuliert wurden

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Messung der Stickstoffmonoxidproduktion in Maus-Tracheal-Epithelzellkulturen, die an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche differenziert wurden

Erfahren Sie eine Methode zur Isolierung von Bürstenzellen aus der Maustrachea mit Papain und Dispase. Diese Technik ermöglicht die quantitative Auswertung lebensfähiger Zellen für RNA-Sequenzierung und funktionale Analysen.

Isolierung und quantitative Auswertung von Bürstenzellen von Maustracheas

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