Name: Toxizitätsstudie von Zinkoxid-Nanopartikeln in der Zellkultur und bei Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung der Nanotoxizität von Zinkoxid-Nanopartikeln in menschlichen Lungenfibroblasten und Drosophila. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zelltodtypen und der Reaktiven Sauerstoffspezies-Produktion.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Studie wurde durch die Stipendiennummer R706-000-043-490 unterstützt. Die Studie stellt nicht die Ansicht des Stipendiaten dar.

1. Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) Analyse von lived/Fixed Cells
<ol><li>Sonicate ZnO NPs in Suspension für 15 min.</li>
	<li>Bereiten Sie ZnO NPs in verschiedenen Konzentrationen (z.B. 0, 10, 25, 50,100 und 200 g/ml) mit 1 mg/ml ZnO NP-Stammlösung zur Behandlung kultivierter Zellen vor.</li>
	<li>Seed MRC5 menschliche Lungen-Fibroblasten (1 x 105 Zellen/gut) auf eine 6-Well-Kulturplatte pro Tag im Voraus, und dann behandeln Sie die Zellen mit 2 ml ZnO NPs (in Triplicates) für 8 h, 16 h und 24 h.</li>
	<li>Zu jedem Zeitpunkt die Zellen durch Zentrifugieren bei 300 x g für 5 min sammeln.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellpellets zweimal mit Phosphatgepufferter Saline (PBS).</li>
	<li>Setzen Sie die Zellen mit 1x Bindungspuffer, der aus 0,1 M HEPES/Natriumhydroxid (NaOH), 1,4 M Natriumchlorid (NaCl) und 25 mM Calciumchlorid (CaCl2) besteht, bei einer Konzentration von 1 x 105 Zellen pro 100 l wieder auf.</li>
	<li>Fügen Sie 5 L Fluorescein isothiocyanat (FITC) Annexin V Fleck und 5 l Propidiumiodid (PI) DNA-Färbung, und inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei Raumtemperatur (RT; 25 °C) im Dunkeln.</li>
	<li>Aufladen Sie die Proben mit einem zusätzlichen 400-L-Bindungspuffer, bevor Sie die Zellen nach Durchflusszytometrie sortieren. Für jede Probe werden mindestens 10.000 Zellen analysiert.</li>
	<li>Tabuulieren Sie das Balkendiagramm mit der erhaltenen Medianintensität.</li>
</ol>2. Exposition von ZnO NPs gegenüber Drosophila
<ol><li>Fügen Sie 1 ml Nanopartikel in verschiedenen Konzentrationen in Fläschchen, gefolgt von 9 ml Fliegenfutter, um eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml oder 0,5 mg/ml ZnO NPs zu erreichen.</li>
	<li>Mischen Sie die Nanopartikel mit Lebensmitteln gründlich in den Fläschchen mit der Pipette.</li>
	<li>Fliegenfutter mit ZnO NPs vor Gebrauch mindestens 2-3 h abkühlen lassen.</li>
	<li>Führen Sie erwachsene männliche und weibliche Fliegen in die Fläschchen für 5 Tage, und lassen Sie sie zu paaren und legen Eier (die als weiße Flecken erscheinen) auf der Oberfläche der Nahrung.</li>
	<li>Entfernen Sie die Elternfliegen, und lassen Sie die Eier weiterentwickeln, die aus 4 verschiedenen Entwicklungsstadien besteht (embryonale, Larven- und Erwachsenenstadium).</li>
</ol>3. Zerlegung der Fliege
<ol><li>Sammeln Sie späte 3rd instar Larven von der Wand der Fläschchen für Analysen. Frisch gelegte Eier entwickeln sich in der Regel zu späten3. Instar Larven nach 72-120 h bei RT.</li>
	<li>Reinigen Sie die Sezierschale und füllen Sie den Brunnen mit Dissektionsmedium/PBS.</li>
	<li>Sezieren Sie die Larven (später 3rd instar) unter dem Stereomikroskop, mit einem Paar Zangen.</li>
	<li>Verwenden Sie die Spitze der Zange, um ein winziges Loch zu machen und brechen Sie die Nagelhautschicht der Larven. Ziehen Sie den Darm vorsichtig heraus und legen Sie ihn in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit Schneiders Drosophila-Medium, bevor der Befestigungsschritt mit 1 ml 4% Paraformaldehyd (PF) verwendet wird.</li>
	<li>3.5Befestieren Sie den Darm in PF für 10 min bei RT, für nachfolgende Experimente, wie z. B. Immunfärbung.</li>
</ol>4. ROS-Erkennung mit Dihydroethidium (DHE) Färbung
<ol><li>Behandeln Sie Larven mit verschiedenen Konzentrationen von ZnO NPs, wie in Schritt 2.1 beschrieben.</li>
	<li>Nach der Zerlegung des Darms von3. Instar-Larven, wie unter Abschnitt 3 beschrieben, inkubieren Sie den Darm in Schneiders Drosophila-Medium bei RT, bevor Gewebefärbung durchgeführt wird. Lösen Sie 1 l DHE-Farbstoff (aus der Lagerkonzentration von 30 mM) in 1 ml Schneiders Medium auf, was eine endige Arbeitskonzentration von 10-30 m DHE-Farbstoff macht.</li>
	<li>Inkubieren Sie den Darm für 5 min bei RT im Dunkeln, und waschen Sie dann dreimal mit Schneiders Medium für alle 5 min.</li>
	<li>Fixieren Sie den Darm mit 4% PF (optionaler Schritt) und montieren Sie den Darm auf Glasschlitten, mit Anti-Fade-Montagemedium mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI). Erfassen Sie Bilder unter einem konfokalen Mikroskop.</li>
</ol>5. Messung der Fluoreszenz mit ImageJ-Software
<ol><li>Importieren Sie die erfassten Fluoreszenzbilder, die mit Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler Laserscanmikroskopie aufgenommen wurden, in die ImageJ-Software.</li>
	<li>Klicken Sie auf das Menü Analysieren und wählen Sie Messungen einstellen.</li>
	<li>Wählen Sie die Ausgabemessung aus, z. B. flächenintegrierte Intensität und mittlerer Grauwert.</li>
	<li>Klicken Sie auf Messen.</li>
	<li>Wählen Sie einen Bereich ohne Fluoreszenz aus, um den Hintergrund festzulegen.</li>
	<li>Exportieren Sie die Daten in die Excel-Tabelle, und ermitteln Sie die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz (CTCF) mithilfe der berechnungsgemäß enden. CTCF = Integrierte Dichte - (Fläche der ausgewählten Zelle X Mittlere Fluoreszenz von Hintergrundwerten)</li>
	<li>Erstellen Sie ein Balkendiagramm, und führen Sie statistische Analysen durch.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+100+nm+zinc+oxide+nanoparticles%3A+a+report+of+90-day+repeated+oral+administration+in+Sprague+Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats.</a> International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).</li>
<li>Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+activity+and+mechanism+of+action+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).</li>
<li>Colvin, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+environmental+impact+of+engineered+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The potential environmental impact of engineered nanomaterials.</a> Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).</li>
<li>De Angelis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+ZnO+and+TiO%282%29+nanoparticles%3A+physicochemical+characterisation+and+toxicological+effects+on+human+colon+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells.</a> Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).</li>
<li>Johnson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+ZnO+nanoparticles+induces+autophagic+immune+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death.</a> Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).</li>
<li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoGenotoxicology%3A+the+DNA+damaging+potential+of+engineered+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials.</a> Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+dissolved+zinc+ion+and+reactive+oxygen+species+in+cytotoxicity+of+ZnO+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles.</a> Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).</li>
<li>Wahab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZnO+nanoparticles+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+in+HepG2+and+MCF-7+cancer+cells+and+their+antibacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).</li>
<li>Namvar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+effects+of+biosynthesized+zinc+oxide+nanoparticles+on+murine+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).</li>
<li>Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicities+of+nano+zinc+oxide+to+five+marine+organisms%3A+influences+of+aggregate+size+and+ion+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).</li>
<li>Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-specific+toxic+effects+of+differently+shaped+zinc+oxide+nanoparticles+to+zebrafish+embryos+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
<li>Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+the+harmful+effects+of+ZnO+nanoparticles+using+Drosophila+melanogaster+as+an+in+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hazardous+Materials%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model.</a> Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).</li>
<li>Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophotoxicology%3A+the+growing+potential+for+Drosophila+in+neurotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology+and+Teratology%22%5BJournal%5D)">Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology.</a> Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).</li>
<li>Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+to+study+nanotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity.</a> Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).</li>
<li>Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+innate+immunity%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective.</a> Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).</li>
<li>Hughes, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+genetic+model+for+studying+pathogenic+human+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses.</a> Virology. 423, 1-5 (2012).</li>
<li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+-+a+versatile+model+in+biology+%26+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila - a versatile model in biology & medicine.</a> Materials Today. 14, 190-195 (2011).</li>
<li>Adams, M. D., Sekelsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sequence+to+phenotype%3A+reverse+genetics+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).</li>
<li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 2185-2195 (2000).</li>
<li>Ong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanoparticles+disrupt+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+potential+harmful+effects+of+CdSe+quantum+dots+by+using+Drosophila+melanogaster+as+in+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model.</a> Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).</li>
<li>Barik, B. K., Mishra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+as+a+potential+teratogen%3A+a+lesson+learnt+from+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly.</a> Nanotoxicology. , 1-27 (2018).</li>
<li>Jovanovic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+a+human+food+additive%2C+titanium+dioxide+nanoparticles+E171%2C+on+Drosophila+melanogaster+-+a+20+generation+dietary+exposure+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li>
<li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toxicity+of+Nanoparticles+to+Human+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).</li>
<li>Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+ROS+scavenging+and+antioxidant+signalling+by+redox+metallic+and+fullerene+nanomaterials%3A+Potential+implications+in+ROS+associated+degenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).</li>
<li>Akter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+on+silver+nanoparticles-induced+cytotoxicity%3A+Physicochemical+properties+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Advanced+Research%22%5BJournal%5D)">A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives.</a> Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).</li>
<li>Vecchio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fruit+fly+in+the+nanoworld%3A+once+again+Drosophila+contributes+to+environment+and+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health.</a> Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).</li>
<li>Marino, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+apoptotic+phosphatidylserine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure.</a> Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).</li>
<li>Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStoddart%2C+MJ+%22Mammalian+Cell+Viability%3A+Methods+and+Protocols%22">Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols</a>. , Chapter 1 (2011).</li>
<li>Yazdani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerns+in+the+application+of+fluorescent+probes+DCDHF-DA%2C+DHR+123+and+DHE+to+measure+reactive+oxygen+species+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).</li>
<li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+kinetics+of+dihydroethidium+fluorescence+with+superoxide+using+xanthine+oxidase+and+hypoxanthine+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay.</a> Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).</li>
<li>Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHartig%2C+SM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Um zu beurteilen, ob ZnO NP Apoptose in MRC5-Fibroblasten induzieren kann, verwenden wir Die durchflusszytometrie, um die Zellen vom nekrotischen oder apoptotischen Zelltod zu unterscheiden. In normalen lebenden Zellen wird Phosphatidylserin (PS) an der Zellmembran lokalisiert. Wenn Apoptose auftritt, wird PS in die extrazelluläre Packungsbeilage der Plasmamembran transziert, so dass die Bindung von Annexin V mit Fluorescein (FITC Annexin V)29gekennzeichnet ist. Andererseits ist das rotfluoreszier...

Nanotechnologie bezieht sich auf die Anwendung nanogroßer Materialien, die in allen wissenschaftlichen Bereichen verwendet werden, einschließlich Medizin, Materialwissenschaft und Biochemie. ZnO NPs, die für ihre ultraviolette Streuung, chemische Sensorik und antimikrobielle Eigenschaften sowie hohe elektrische Leitfähigkeit bekannt sind, werden beispielsweise bei der Herstellung verschiedener Konsumgüter wie Lebensmittelverpackungen, Kosmetika, Textilien, Kautschuke, Batterien, Katalysatoren für die Rückgasbehandlung von Kraftfahrzeugen und biomedizinische Anwendungen1,2,3.
Die aufkeimenden Anwendungen von ZnO NP-basierten Produkten, die zu einer erhöhten Exposition des Menschen gegenüber ZnO-NPs führen, haben jedoch Bedenken hinsichtlich ihrer möglichen nachteiligen Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit aufkommen lassen. Eine Reihe von in vitro zellulären Studien haben gezeigt, dass ZnO NPs oxidativen Stress, autophagiebedingte Zytotoxizität, Entzündung und Genotoxizität4,5,6,7,8 induzieren können . Insbesondere wird angenommen, dass die Toxizität von ZnO NPs durch die Auflösung von Zn zu freien Zn2+-Ionen sowie die Oberflächenreaktivität von ZnO verursacht wird, was zu den zellulären ionischen und metabolischen Ungleichgewichten führt, die mit einer beeinträchtigten ionischen Homöostase und Hemmung des Ionentransports4,7,9,10. Wichtig ist, dass Studien gezeigt haben, dass die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) einer der primären Mechanismen ist, die ZnO NPs-assoziierte Toxizität zugrunde liegen. Unzureichende antioxidative Aktivität nach ROS Beleidigung hat sich als verantwortlich für die Auslösung der Zytotoxizität und DNA-Schäden9. Die toxischen Wirkungen von ZnO NPs wurden auch in Tiermodellen berichtet, einschließlich Nagetier1, Zebrafisch11,12, sowie die wirbellose Drosophila13.
Drosophila dient als etabliertes alternatives Tiermodell für das Toxizitätsscreening chemischer Einheiten und Nanomaterialien (NMs)14,15. Wichtig ist, dass es ein hohes Maß an genetischer und physiologischer Ähnlichkeit zwischen dem Menschen und Drosophila gibt, was die Verwendung von Drosophila als In-vivo-Modell für die Bewertung biologischer Reaktionen auf Umweltschadstoffe wie NMs rechtfertigt. 16. Darüber hinaus gibt es viele Vorteile der Verwendung von Drosophila aufgrund seiner geringen Größe, kurze Lebensdauer, genetische Amenabilität, und einfache und kostengünstige Wartung. Darüber hinaus ist Drosophila weithin für die Erforschung der Genetik, Molekular- und Entwicklungsbiologie angenommen worden, seit sein vollständiges Genom vor Jahren im Jahr 2000 vollständig sequenziert wurde, wodurch es für eine Vielzahl von Hochdurchsatz-Screenings geeignet ist. und zur Behandlung ungelöster biologischer Fragen17,18,19,20,21. In den letzten Jahren, eine Reihe von Studien im Zusammenhang mit Immuntoxizität mit verschiedenen Arten von NPs in Drosophila wurden berichtet15,22,23,24. Dieses grundlegende neue Wissen aus den Studien mit Drosophila hat dazu beigetragen, mehr Einblicke in unser Verständnis der Nanotoxikologie zu geben.
ROS ist ein bekannter Schuldiger für Zytotoxizität und Genotoxizität, verursacht durch NPs, insbesondere metallbasierte NPs25. ROS sind sauerstoffhaltige chemische Spezies mit höheren reaktiven Eigenschaften als molekularer Sauerstoff. Freie Radikale wie Superoxid-Radikal (O2-) und sogar nicht-radikale Moleküle wie Wasserstoffperoxid (H2O2) können als ROS fungieren. Unter normalen physiologischen Bedingungen sind sie verpflichtet, zelluläre Homöostase26zu erhalten, jedoch kann übermäßige ROS aufgrund von Überproduktion oder Dysregulation des antioxidativen Abwehrsystems oxidativen Stress verursachen, was zu Schäden an Proteinen führen, Lipide und Desoxyribonukleinsäure (DNA)27. Zum Beispiel, wenn ROS-Spiegel erhöhen und Glutathion (GSH) Niveau sinkt gleichzeitig, Störung der Adenosintriphosphat (ATP) Synthese findet statt und Lactat-Dehydrogenase (LDH) Niveau steigt im Medium, gipfelnd in Zelltod27.
Hier bieten wir Protokolle für die Durchführung zellulärer und genetischer Analysen mit kultivierten Säugetierzellen und Drosophila, um die potenziellen Nebenwirkungen von ZnO NPs zu bestimmen. Abbildung 1zeigt eine Übersicht über die Methode zur Toxizitätsstudie von ZnO NPs .

<table><tbody><tr><td>15% Methyl-4-Hydroxybenzoat</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD biosciences<</td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>cncCK6/TM3, Sb</td><td></td><td></td><td>ein Geschenk von Dr. Kerppola</td></tr><tr><td>T Maismehl, Glukose, Hefe Brauer</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyAn ADP mit Summit Software</td><td>DAKO</td><td></td><td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td></tr><tr><td>Dihydroethidium (Hydroethidin)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td><td>BD biosciences</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucolin</td><td>Supermarkt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC5 humaner Lungenfibroblast</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO</td><td>NIG-FLY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zinkoxid-Nanopartikel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>721077</td><td>Siehe Blatt 2</td></tr></tbody></table>

toxizitätsstudie von zinkoxid-nanopartikeln in der zellkultur und bei drosophila melanogaster

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Zinkoxid-Nanopartikel (ZnO NPs) haben eine breite Palette von Anwendungen, aber die Anzahl der Berichte über ZnO NP-assoziierte Toxizität hat in den letzten Jahren rapide zugenommen. Jedoch, Studien, die die zugrunde liegenden Mechanismen für ZnO NP-induzierte Toxizität aufklären, sind spärlich. Wir ermittelten die Toxizitätsprofile von ZnO NPs anhand von In-vitro- und In-vivo-Experimentalmodellen. Bei ZnO NP-exponierten MRC5-Lungenfibroblasten wurde eine signifikante Abnahme der Zelllebensfähigkeit beobachtet, was zeigt, dass ZnO NPs zytotoxische Wirkungen ausüben. In ähnlicher Weise, interessanterweise, Darm ausgesetzt ZnO NPs zeigte einen dramatischen Anstieg der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Fruchtfliege Drosophila. Es sind eingehendere Studien erforderlich, um eine Risikobewertung für die verstärkte Nutzung von ZnO-NPs durch Verbraucher zu erstellen.

NP-exponierte Zellen wurden mit dem Zellfärbereagenz-Kit verarbeitet, gefolgt von der Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie. ZnO NP-behandelte Zellen (unten, rechter Bereich) weisen einen höheren Prozentsatz früher (R3)/später apoptotischer Zellen (R6) auf als Kontrollzellen (R5, unten, links). Der nekrotische Zelltod wird durch R4 (oben, rechts) bezeichnet (Abbildung 2). Die Ergebnisse des FITC/Annexin V Assays auf ZnO NP-behandelten MRC-5-Fibroblasten...

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Bewertung der toxikologischen Profile von Zinkoxid-Nanopartikeln (ZnO NPs), insbesondere der Art des Zelltodes in menschlichen MRC5-Lungenfibroblasten und der ROS-Bildung in der Fruchtfliege Drosophila.

Toxizitätsstudie von Zinkoxid-Nanopartikeln in der Zellkultur und bei Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Unsere Methoden skizzieren eine einfache und wiederholte Methode zur Untersuchung der Nanotoxizität, wie z. B. die Untersuchung der Arten des Zelltodes und die Untersuchung der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies. Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung ist ein strenges Format, das es uns ermöglicht, die Subpopulation von Zellen und die wachsenden verschiedenen Arten von Zelltod zu studieren. Die DHE-Sondenstudie ermöglicht es uns, reaktive Sauerstoffspezies zu erkennen und zu quantifizieren, gefolgt von Durchflusszytometrie, mikroskopischer Hochauflösender Bildgebung und koppelbasierter Fluoreszenzanalyse.Zunächst sollte eine Eppendorf-Röhre mit Zinkoxid-Nanopartikeln in Zinkoxid-Nanopartikel-Stammlösung 15 Minuten lang in einen Beschallungsmittelor gegeben werden. Bereiten Sie Zinkoxid-Nanopartikel in verschiedenen Konzentrationen mit einem Milligramm pro Milliliter Zinkoxid-Nanopartikelbestand vor. Dann, in einem Biosicherheitsschrank, Samen MRC5 menschliche Lunge Fibroblasten auf drei Sechs-Well-Kulturplatten in der Konzentration von einem mal 10 bis die fünften Zellen pro Brunnen.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Nach einem Tag die Zellen acht Stunden, 16 Stunden oder 24 Stunden lang mit zwei Millilitern Zinkoxid-Nanopartikeln behandeln. Zu jedem Zeitpunkt die Zellen in einem 15-Milliliter-Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 300 mal g für fünf Minuten sammeln.Waschen Sie die Zellpellets zweimal mit phosphatgepufferter Saline, und setzen Sie die Zellen dann mit 1X Bindungspuffer wieder auf. Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter FITC Annexin V Fleck in fünf Mikroliter Propidium Iodid DNA-Färbung. Bebrüte die gebeizten Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.Vor der Sortierung der Zellen durch Durchflusszytometrie, laden Sie die Proben mit einem zusätzlichen 400 Mikroliter 1X Bindungspuffer auf. Tabuulieren Sie das Balkendiagramm mit der erhaltenen Medianintensität. Verwenden Sie nun eine Pipette, um einen Milliliter Nanopartikel in verschiedenen Konzentrationen in Fläschchen hinzuzufügen, gefolgt von neun Millilitern Fliegenfutter, um eine Endkonzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter, 0,25 Milligramm pro Milliliter oder 0,5 Milligramm pro Milliliter Zinkoxid-Nanopartikel zu erreichen.Pipette nach oben und unten, um gründlich zu mischen. Fliegennahrung, die Zinkoxid-Nanopartikel enthält, vor Gebrauch mindestens zwei bis drei Stunden abkühlen lassen. Dann anästhesieren erwachsene männliche und weibliche Fliegen in einer Durchstechflasche mit Kohlendioxid, und führen Fünf männliche Fliegen und fünf weibliche Fliegen in jede Durchstechflasche für fünf Tage.Lassen Sie sie sich paaren und legen Sie Eier auf der Oberfläche des Lebensmittels. Nach der Anästhesisierung die Elternfliegen entfernen und die Eier bei Raumtemperatur weiterentwickeln lassen, die aus vier verschiedenen Entwicklungsstadien besteht. Embryonal, Larven, Pupal und Erwachsenenstadium.Nach 72 bis 120 Stunden entwickeln sich frisch gelegte Eier zu späten dritten Insternlarven. Mit Zangen, sammeln Sie die Larven von der Wand der Fläschchen für Analysen. In einem Brunnen einer Sezierschale mit Dissektionsmedium oder PBS die Larven in die Lösung geben.Verwenden Sie unter dem Stereomikroskop die Spitze der Zange, um ein winziges Loch zu bilden, und brechen Sie die Nagelhautschicht der Larven auf. Ziehen Sie vorsichtig den Darm heraus. Legen Sie den Darm in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit Schneiders Drosophila Medium.Fügen Sie einen Mikroliter der DHE-Sonde hinzu und in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren. Waschen Sie den Darm dreimal mit Schneiders Medium alle fünf Minuten. Montieren Sie den Darm auf Glasschlitten und liefern Sie mit 10 Mikroliter Antifade-Montagemedium, das DAPI enthält.Erfassen Sie Bilder unter einem konfokalen Mikroskop. Um die Fluoreszenz zu messen, importieren Sie die erfassten Fluoreszenzbilder, die mit Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler Laserscanmikroskopie aufgenommen wurden, in die ImageJ-Software. Klicken Sie auf das Analysemenü, und wählen Sie die festgelegten Messungen aus.Wählen Sie die Ausgabekennzahl aus, z. B. die integrierte Flächenintensität und den mittleren Grauwert. Wählen Sie einen Bereich ohne Fluoreszenz aus, um den Hintergrund festzulegen. Klicken Sie auf Maß.Exportieren Sie die Daten in die Kalkulationstabelle, und bestimmen Sie die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz. Erstellen Sie ein Balkendiagramm, und führen Sie statistische Analysen durch. In dieser Studie weisen Zinkoxid-Nanopartikel-behandelte Zellen einen höheren Anteil an frühen R3- oder späten apoptotischen R6-Zellen auf als Kontrollzellen R5. Nekrotische Zelltod wurde mit R4 bezeichnet. Der aus der Drosophila-Larve gewonnene Darm wurde in drei diskrete Domänen unterschiedlicher Entwicklungsherkunft unterteilt.Nämlich das Vorgut, das Midgut und das Hintergut. DHE-Aktie neigt dazu, ziemlich schnell zu verfallen, so seien Sie vorsichtig mit der Aktienlösung, die Sie verwenden. Alternativ können Sie auch andere Sonden ausprobieren, z. B. die Zelle Roche, die entwickelt wurde, um den intrazellulären ROS in grünen Signalen zu erkennen, und das ist fotoierbarer als die DHE.Unser Protokoll bietet einen allgemeinen Überblick über die Untersuchung der intrazellulären ROS-Produktion und die Quantifizierung des ROS-Levels für Nanotoxizitätsstudien. DMSO ist dafür bekannt, ein besseres Lösungsmittel für DHE als das PBS zu sein. DMSO ist jedoch giftig.Daher möchte ich dem Benutzer raten, den gesamten Prozess für das Studium auf maximal 30 Minuten zu beschränken. Dies liegt daran, dass Sie ein falsch positives Ergebnis beobachten können, da DMSO den Zelltod verursachen kann.

toxicity-study-zinc-oxide-nanoparticles-cell-culture-drosophila

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Artikel werden Zebrafischembryonen für das Screening chemischer Toxizität verwendet. Die chemische Toxizität korreliert mit den Phänotyp-Messwerten. Das Probenprotokoll zeigt einen methodischen Ansatz zur Durchführung des chemischen Toxizitätsscreenings.

Embryobasiertes chemisches Toxizitätsscreen: Bewertung der Auswirkungen auf die Entwicklung von Zebrafischembryonen

Es wird ein Protokoll entwickelt, um die Auswirkungen eines epigenetischen Medikaments DZNep auf die Entwicklung, Fruchtbarkeit und Überlebensfähigkeit von Mücken zu untersuchen.  In diesem Artikel beschreiben wir Verfahren für die wässrige Exposition von DZNep gegenüber unreifen Mücken und eine blutbasierte Exposition von DZNep gegenüber adulten Mücken zusätzlich zur Messung der SAH-Hydrolase-Hemmung.

Toxikologische Tests zur Prüfung Auswirkungen eines Epigenetische Drug für Entwicklung, Fruchtbarkeit und Hinterbliebenen von Malariamücken

In diesem Papier bieten wir ein detailliertes Protokoll für das Verfügbarmachen von Arten der Gattung Drosophila Schadstoffe mit dem Ziel der Untersuchung der Auswirkungen der Exposition zu einer Reihe von phänotypischen Ausgänge in unterschiedlichen Entwicklungsstadien und für mehr als eine Generation.

Experimentelles Protokoll für die Verwendung von Drosophila als ein Wirbellosen Modellsystem für Toxizitätstests im Labor

Eine quantitative Methode wurde entwickelt, um zu identifizieren und die akute Toxizität von Chemikalien durch die automatisch analysieren die phänotypische Profilierung von Caenorhabditis ElegansVorhersagen. Dieses Protokoll beschreibt die Würmer mit Chemikalien zu behandeln, in einem 384-Well-Platte, Videos aufzunehmen und toxikologischen Verwandte Phänotypen zu quantifizieren.

Ein High-Throughput-Assay für die Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisierte phänotypischen Profilierung von Caenorhabditis elegans

Endokrine Disruptorchemikalien (EDCs) stellen ein ernstes Problem für Organismen und natürliche Umgebungen dar. Drosophila melanogaster stellt ein ideales Modell dar, um EDC-Effekte in vivo zu untersuchen. Hier stellen wir Methoden zur Untersuchung der endokrineStörung in Drosophila vor, die EDC-Effekte auf Fruchtbarkeit, Fruchtbarkeit, Entwicklungszeitpunkt und Lebensdauer der Fliege adressieren.

Methoden zur Prüfung der endokkrinen Disruption bei Drosophila melanogaster

Dieses Protokoll enthält häufig verwendete Zytotoxizitätstests (Alamar Blue [AB], CFDA-AM-, Neutral Red- und MTT-Assays), die für die Bewertung der Zytotoxizität in Zebrafischembryo- (ZEM2S) und Leberzelllinien (ZFL) in 96-Well-Platten geeignet sind.

Zytotoxizitäts-Assays mit Zebrafisch-Zelllinien

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und kostengünstige Methode, bei der flüssige Medien verwendet werden, um die Auswirkungen chemischer Giftstoffe auf die Lebensfähigkeit von adulten Drosophila melanogaster zu bewerten.

Bewertung der chemischen Toxizität bei adulten Drosophila melanogaster

Die folgende Studie evaluiert das toxikologische Profil eines ausgewählten metallorganischen Gerüsts unter Verwendung der elektrischen Zellsubstrat-Impedanzmessung (ECIS), einer Echtzeit-Hochdurchsatz-Screening-Technik.

Elektrische Zell-Substrat-Sensorik zur Echtzeit-Bewertung von toxikologischen Profilen metallorganischer Gerüstverbindungen

Das Protokoll stellt eine kostengünstige Methode mit hohem Durchsatz zur Beurteilung der Neurotoxizität in der Fruchtfliege durch die Quantifizierung der Bewegungsstörung als Alternative zu herkömmlichen Säugetiermodellen dar. Ziel ist es, die neurotoxischen Wirkungen von pharmazeutischen Wirkstoffen, Umwelteinflüssen oder genetischen Veränderungen anhand eines sensitiven, reproduzierbaren und ethisch günstigen Modells zu bewerten.

Verhaltensanalyse der lokomotorischen Dysfunktion bei Drosophila melanogaster als Aussage für Neurotoxizität

Wir präsentieren ein Protokoll zur Antigen-spezifischen Maus-T-Zellen produzieren unter Verwendung von retroviralen...

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

Erfahren Sie die Bewertung der Nanotoxizität von Zinkoxid-Nanopartikeln in menschlichen Lungenfibroblasten und Drosophila. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zelltodtypen und der Reaktiven Sauerstoffspezies-Produktion.

Toxizitätsstudie von Zinkoxid-Nanopartikeln in der Zellkultur und bei Drosophila melanogaster

Weitere Videos entdecken