Methoden zur Prüfung der endokkrinen Disruption bei Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiges Modell zur Bewertung der potenziellen toxischen und endokrinen Wirkungen von Chemikalien wie endokrinen Disruptoren, die ein ernstes Problem für die menschliche Gesundheit und die natürliche Umwelt darstellen. Angesprochen auf die Wirkung von EDCs auf die hormonellen Lebensmerkmale der Fliege, wie Fruchtbarkeit, Fruchtbarkeit, Entwicklungszeit, und die Lebensdauer. Es ist eine einfache, billige und schnelle Möglichkeit, endokrine Störungen in vivo zu untersuchen.

Die Fruchtbarkeit, Entwicklung, und Lebensdauer in Drosophila kann durch mehrere Faktor beeinflusst werden, die sorgfältig kontrolliert werden müssen, um den erfolgreichen Ausgang dieses Protokolls zu gewährleisten. Daher ist maximale Aufmerksamkeit bei der Aufzucht und Handhabung von Fliegen erforderlich. Um den Geschmack des ausgewählten EDC zu beschwichtigen, übertragen Sie nach der Anästhesisierung 15 junge Fliegen vom Fliegenbett auf vier parallele Fläschchen mit Maismehlmedium, gemischt mit einer Lebensmittelfärbung.

Die Steuerdurchstechflasche enthält das Lösungsmittel allein, und die drei anderen Durchstechflaschen werden durch verschiedene Dosen der ausgewählten EDCs ergänzt. Bewahren Sie die Fläschchen in einem befeuchteten Inkubator für einen Tag mit einem natürlichen 12-Stunden-Licht auf. Nach der erneuten Anästhesisierung der Fliegen die immobilisierten Fliegen auf ein weißes Papier übertragen und unter ein Stereomikroskop stellen, um sie zu beobachten.

Vergleichen Sie die Bauchfärbung jeder Behandlungsgruppe in Bezug auf die Kontrollgruppe. Um die Fortpflanzungsleistung der Fliegen zu assay, bereiten Sie drei Fläschchen fliegen für jedes EDC als Elternfläschchen, mit acht Weibchen und vier Männchen in 10 Milliliter Maismehl Medium mit EE2 ergänzt. Für die Kontrolle, bereiten Sie sechs Fläschchen von Fliegen, jeweils mit acht Weibchen und vier Männchen in 10 Milliliter Maismehl mittlere Nahrung mit EE2 Lösungsmittel ergänzt.

Hinterfliegen in einem Inkubator bei 25 Grad Celsius. Vermeiden Sie während ihrer Entwicklung eine Überbelegung der Larven. Nach vier Tagen, invertieren Sie jede Durchstechflasche über einem Äther, um die Eltern zu entfernen und die Fläschchen für fünf weitere Tage an den Inkubator zurückzugeben.

Am späten Nachmittag des neunten Tages, invertieren Sie jede Durchstechflasche über einem Äther, um alle neu aufgetauchten Fliegen von den Fläschchen zu entfernen und die Fläschchen in einem anderen Inkubator bei 18 Grad Celsius über Nacht zu legen. Am Morgen des 10. Tages, auf einem Drosophila Kohlendioxid-Arbeitsplatz, vorsichtig invertieren die Kultur-Fläschchen, um zu verhindern, dass anästhesierte Fliegen auf Medium fallen und legen Sie ein Gummirohr mit einer Nadel in die Durchstechflasche zwischen dem Baumwollstopfen und der Durchstechflasche. Öffnen Sie das Ventil, um Kohlendioxid zu liefern.

Innerhalb von Sekunden die Fliegen auf ein Fliegenbett unter dem Mikroskop zu übertragen. Sammeln Sie jungfräuliche Weibchen und junge Männchen getrennt in zwei Gruppen auf dem Fliegenbett. Unterteilen Sie jede Gruppe von Fliegen zufällig in kleine Untergruppen, wobei 10 Weibchen oder 20 Männchen pro Durchstechflasche mit frischem entsprechendem Maismehlmedium gefüllt sind.

Setzen Sie die Inkubation fort und sammeln Sie 30 jungfräuliche Weibchen und 30 Männchen für jedes EDC, und 90 jungfräuliche Weibchen und 90 Männchen für die Kontrolle. Beherbergen Sie diese Gruppen von Fliegen bei 25 Grad Celsius, bis sie vier Tage nach der Eklat sind. Dann übertragen Sie sie alle zwei Tage in neue Fläschchen mit frischem entsprechendem Medium.

Überprüfen Sie, ob sich keine Larven in den Fläschchen von Weibchen befinden. Dann beschriften Sie Fläschchen mit einer anderen Reihe von fortlaufenden Nummern für die folgende Behandlung. Nach der Anästhesisation ein mit EE2 lösungsmittelbehandeltes Weibchen in eine kleine Durchstechflasche mit frischem Maismehl-Tomatenmedium ohne EE2 übertragen und ein eE2-lösungsmittelbehandeltes Männchen zur Kontrolle quer geben.

Paarieren Sie ein EE2-behandeltes Männchen mit EE2-lösungsmittelbehandeltem Weibchen oder EE2-behandeltem Weibchen mit EE2-Lösungsmittel-behandeltem Männchen für jede Behandlung. Haus 20 einzelne Kreuze bei 25 Grad Celsius. Übertragen Sie jedes Paar auf frische Maismehl Tomaten mittel Fläschchen ohne EDC jeden Tag für die folgenden 10 Tage.

Überprüfen Sie jede Durchstechflasche jeden Tag visuell auf die Eier und melden Sie ihre Nummer auf der Fruchtbarkeitstabelle. Überprüfen Sie in jeder Durchstechflasche genau nach neu aufgetauchten Fliegen und erfassen Sie die tägliche Anzahl erwachsener Progenies über den 10-Tage-Zeitraum. Nach 10 Tagen nach der ersten Paarung, entfernen Sie die Eltern aus der letzten Serie von Fläschchen.

In Eclosion Assay-Protokollen, zuerst, für jede Behandlungsgruppe, 10 Fläschchen von jungen, gesunden Fliegen weniger als zwei Tage alt, mit jeweils sechs Weibchen und drei Männchen in 10 Milliliter Maismehl Nahrung ohne EDC. Die Fliegen 24 Stunden auf dem Essen aufziehen und sich paaren lassen. Dann bereiten Sie weitere 10 parallele Fläschchen pro Behandlungsgruppe mit je 10 Millilitern frischer Maismehlnahrung zu, die mit unterschiedlichen EDC-Konzentrationen oder dem EE2-Lösungsmittel allein zur Kontrolle ergänzt wird.

Übertragen Sie die gepaarten Fliegen auf diese neuen Fläschchen. Erstellen Sie eine Entwicklungstabelle, um die verschiedenen Serien aufzuzeichnen. Lassen Sie die Fliegen 16 Stunden lang Eier legen.

Entfernen Sie dann die Eltern von den Fläschchen. Bebrüte die Fläschchen bei 25 Grad Celsius für drei bis vier Tage, oder bis wandernde Larven sichtbar sind. Zählen Sie jeden Tag die Anzahl der neuen Welpen in jeder Durchstechflasche, indem Sie eine Zahl nacheinander von jedem Pupa auf die Außenseite der Durchstechflasche schreiben, um zu vermeiden, dass die gleiche Pupa zweimal gezählt wird.

Melden Sie die Anzahl der neu entstandenen Pupae für drei bis vier Tage, oder bis keine Pupae mehr Form. Ab dem neunten Tag zählen Sie täglich die Anzahl der aufstrebenden Erwachsenen, bis keine Erwachsenen mehr auftauchen. Melden Sie es über die Entwicklungstabelle und führen Sie den Rest des Eclosion-Assays gemäß dem Manuskript durch.

Im Life-Life-Life-Protokoll wurden zunächst 20 Fläschchen mit acht Weibchen und vier Männchen aufgestellt, die jeweils mit 10 Millilitern Maismehl-Nahrung gefüllt sind und sie bei 25 Grad Celsius unterbringen. Nach vier Tagen die Fliegen entsorgen und die Fläschchen wieder in den Brutkasten legen. Am späten Nachmittag des neunten Tages entfernen Sie alle neu aufgetauchten Fliegen von den Fläschchen und bringen Sie die Fläschchen zum Brutkasten zurück.

Nach 16 bis 24 Stunden 250 eintägige erwachsene Fliegen beiderlei Geschlechts unter leichter Kohlendioxidanästhesisierung in vier Gruppen aufteilen und in 250-Milliliter-Flaschen mit mittelschweren Lebensmitteln für Erwachsene übertragen, drei mit unterschiedlichen EDC-Konzentrationen und eine allein mit dem EE2-Lösungsmittel. Halten Sie die Fliegen bei 25 Grad Celsius für zwei bis drei Tage, damit sie sich paaren können. Sortieren Sie dann jede Kohorte von Fliegen nach Geschlecht in zwei Gruppen.

Innerhalb jeder Behandlungsbedingung unterteilen Sie jede Gruppe für beide Geschlechter nach dem Zufallsprinzip in fünf parallele Fläschchen mit einer Dichte von 20 Individuen pro Durchstechflasche. Bereiten Sie eine Lebensspanne Tabelle, in der die Anzahl der toten Fliegen wird von der Anzahl der überlebenden Fliegen aus dem vorherigen Transfer subtrahiert, so dass die Anzahl der Überlebenden bei jedem Transfer automatisch erhalten wird. Nach drei Tagen die Fliegen ohne Anästhesie auf neue Fläschchen mit dem entsprechenden Futter zur gleichen Zeit übertragen und auf den Tod überprüfen.

Erfassen Sie das Alter der Fliegen und die Anzahl der toten Fliegen. Wiederholen Sie den Transfer alle drei Tage, bis alle Fliegen sterben. In diesem Experiment wurden Lebensdauerkurven als kumulatives Überleben im Vergleich zu den verstrichenen Tagen für jede EDC-Konzentration und die Kontrolle dargestellt.

Für die Kontrolle ging sie nach einer langen Anfangsphase, in der die Überlebenskurve relativ hoch blieb, nach etwa 60 Tagen exponentiell zurück. Nach der EDC-Exposition wurde die Überlebenskurve der behandelten Fliegen erheblich beeinflusst und zeigte nach 36 Tagen einen dramatischen Rückgang. Es wird empfohlen, dass die parallelen Fläschchen, die analysiert werden, sehr ähnlich sein sollten, sonst wird es schwierig zu verstehen sein, welche zu entsorgen sind.

Daher empfehlen wir, große Sorgfalt zu walten, eine gute experimentelle Praxis zu übernehmen, indem wir eine große Stichprobengröße verwenden. Im Anschluss an diese Protokolle ist es auch möglich, die transgenerationellen Auswirkungen eines ausgewählten endokrinen Disruptors zu bewerten und die potenziellen additiven Wirkungen einer Kombination verschiedener endokriner Disruptoren zu testen.