Name: Rettung des rekombinanten Zika-Virus aus einem bakteriellen künstlichen Chromosom cDNA-Klon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Lernen Sie die Rettung von rekombinantem Zika-Virus aus einem bakteriellen künstlichen Chromosom cDNA-Klon. Diese Methode nutzt Vero-Zellen und ermöglicht die Entwicklung von Impfstoffstrategien.

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Die Autoren danken Carla Gémez für ihre technische Unterstützung bei der KLongeneration BAC cDNA und Snezhana Dimitrova für ihre Unterstützung bei der Videovorbereitung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse des spanischen Ministeriums für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit (MINECO, Fördernummer BFU2016-79127-R) an F.A.T. und die National Institutes of Health (NIH, Grant-Nummer 1R21AI120500) an L.M.S. und F.A.T. unterstützt.

1. Bau eines ZIKV Infektiösen cDNA-Klons in einem BAC
HINWEIS: Die Strategie für die Montage von ZIKV in BACs wird für den RGN-Stamm13 (Beitrittsnummer KU527068) beschrieben (Abbildung 2).
<ol><li>Wählen Sie eindeutige Restriktionsstellen aus, die im viralen Genom entsprechend verteilt sind und im Plasmid pBeloBAC11 (Abbildung 2A)fehlen. HINWEIS: Für ZIKV-RGN wurden die Restriktionsstandorte Pml I, Afe I und BstB I (genomische Positionen 3.347, 5.969 bzw. 9.127) ausgewählt. Für den Fall, dass keine geeigneten Restriktionsstellen im viralen Genom verfügbar sind, erzeugen Sie neue Restriktionsstellen, indem sie während des cDNA-Fragmentdesigns stille Nukleotidmutationen in das virale Genom einführen.</li>
	<li>Erzeugt durch chemische Synthese vier cDNA-Fragmente, die das Genom in voller Länge (Z1 bis Z4) umfassen, flankiert vom CMV-Promotor am 5'-Ende und dem HDV RZ, dem BGH-Abschluss und Polyadenylierungssequenzen am 3'-Ende ( Abbildung 2B). Jedes Fragment muss von den ausgewählten Einschränkungsstellen flankiert werden (Schritt 1.1). HINWEIS: Fragment Z1 wird als Backbone verwendet, um den Rest der Fragmente im pBeloBac11 zu klonen. Zu diesem Zweck muss er den menschlichen CMV-Promotor enthalten und am 5'-Ende von ApaL I (um dieses Fragment in pBeloBAC11) und Asc I (abwesend im viralen Genom) und am 3'-Ende von den für die Montage des infektiösen Klons ausgewählten Restriktionsstellen (Pml I) flankiert werden. , Afe I und BstB I) gefolgt von Mlu I (abwesend im viralen Genom) und BamH I (um dieses Fragment in pBeloBAC11 zu klonen). Fragment Z4 muss die genomische Region von der letzten ausgewählten Restriktionsstelle (BstB I) bis zum Ende des viralen Genoms enthalten, gefolgt von der HDV RZ, der BGH-Beendigung und Polyadenylierungssequenzen und der Mlu-I-Restriktionsstelle (Abbildung 2B). Alternativ könnten die cDNA-Fragmente (Z1-Z4) durch eine Kombination aus Standard-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionen (RT-PCRs) und überlappenden PCRs unter Verwendung spezifischer Oligonukleotide erzeugt werden.</li>
	<li>Montieren Sie den infektiösen cDNA-Klon durch sequenzielles Klonen der Fragmente Z1 bis Z4 in pBeloBAC11 (Abbildung 2B).
	<ol><li>Verdauen Sie das pBeloBAC11-Plasmid und das Z1-Fragment mit ApaL I und BamH I. Mischen Sie dazu 2 g pBeloBAC11-Plasmid oder 1 g Z1-Fragment mit 10 l 10x Reaktionspuffer, 20 Einheiten jedes Enzyms und Wasser, um ein Endvolumen von 100 l zu erreichen. Inkubieren bei 37°C für 2 h.</li>
		<li>Dephosphorylieren Sie den BAC-Vektor mit Garnelen alkalische Phosphatase (SAP). Dazu 2,5 l (2,5 Einheiten) SAP in den verdauten BAC geben und bei 37°C für 1 h inkubieren. Inaktivieren Sie den SAP durch Inkubation bei 75 °C für 15 min.</li>
		<li>Reinigen Sie den dephosphorylierten BAC-Vektor und -Fragment Z1 durch Agarose-Gel-Elektrophorese mit einem kommerziellen Gel-Reinigungskit, das für die Reinigung von DNA-Fragmenten größer als 10 kb optimiert ist (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Führen Sie die Ligationsreaktion durch, um das Plasmid (p)BAC-Z1 zu erzeugen. Zu diesem Zweck mischen Sie 150 ng gereinigten BAC-Vektor mit dem gereinigten Einsatz mit einem Molverhältnis von Vektor-zu-Einsatz von 1:3, 1,5 l von 10x T4 DNA-Ligasepuffer mit 10 mM ATP, einer Einheit T4-DNA-Ligase und Wasser zu einem Endvolumen von 15 l.</li>
		<li>Die Ligationsmischung für 20 h bei 16 °C inkubieren. Führen Sie als Steuerung der Ligationsreaktion parallel eine Ligationsreaktion ohne Einsetzen aus. Die Ligase durch Inkubation bei 65 °C für 15 min wärmen. HINWEIS: Bei stumpfen DNAs die Ligationsreaktion für 20 h bei 14 °C inkubieren. Aufgrund der großen Größe des BAC-Vektors (Abbildung 2A) ist es wichtig, größere Mengen an Vektoren und Insert-Mengen als Ligationen mit herkömmlichen Plasmiden zu verwenden, um die Ligationseffizienz zu erhöhen.</li>
		<li>Transformieren Sie 50 l E. coli DH10B elektrokompetente Zellen mit 2 l der Ligationsreaktion (Schritt 1.3.5) durch Elektroporation (25 °F-Kapazität, 2,5 kV und 100 -Widerstand), wobei Elektroporationsküvetten mit Elektroden im Abstand von 0,2 cm, nach Standardprotokollen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellen in ein Polypropylen-Rohr mit 1 ml SOC-Medium (2% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,05% NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM Glucose [pH 7,0]) und inkubieren sie bei 37°C für 1 h mit schüttelnder Minund (200-250 U/min). Die Zellen auf Luria-Brühe (LB) Agarplatten mit 12,5 g/ml Chloramphenicol verkleben und bei 37°C für 16 h inkubieren.</li>
		<li>Wählen Sie 8 bis 12 Bakterienkolonien, machen Sie eine Replik auf einer frischen LB-Agarplatte, die 12,5 g/ml Chloramphenicol enthält, und testen Sie, ob sie den richtigen Einsatz durch direkte PCR-Analyse mit spezifischen Oligonukleotiden enthalten.</li>
		<li>Wählen Sie eine positive Kolonie aus der Replikplatte, züchten Sie sie in 100 ml LB, die 12,5 g/ml Chloramphenicol enthält, und isolieren Sie die BAC cDNA nach der alkalischen Lysemethode mit einem kommerziellen Plasmid Midi-Kit, nach der Empfehlung für die Reinigung von Plasmide mit geringer Kopie (siehe Materialtabelle). HINWEIS: BAC cDNA, die mit dieser Methode hergestellt wird, kann mit bis zu 30% der bakteriellen genomischen DNA kontaminiert sein, aber es eignet sich in der Qualität, um Restriktionsanalysen, Sequenzierung und Klonen durchzuführen. Je nach BAC-Größe können Erträge von 4-6 g des BAC-Plasmids erzielt werden.</li>
		<li>Überprüfen Sie die genetische Integrität der geklonten cDNA durch Restriktionsanalyse. 500 ng des pBAC-Z1-Plasmids mit Asc I und Pml I bei 37 °C für 1 h verdauen und das Vorhandensein des Z1-Fragments durch Gelelektrophorese bestätigen. Um weiter zu bestätigen, dass unerwünschte Mutationen nicht eingeführt wurden, sequenzieren Sie den Einsatz mit spezifischen Oligonukleotiden.</li>
		<li>Ausgehend vom Plasmid pBAC-Z1 mit den ausgewählten Restriktionsstellen (Pml I, Afe I, BstB I und Mlu I) klonen Sie sequenziell die Fragmente Z2 bis Z4, um den infektiösen cDNA-Klon pBAC-ZIKV (Abbildung 2B) zu erzeugen, Ansätze wie oben beschrieben für Fragment Z1 (Schritte 1.3.1-1.3.10).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vorbereitung von hochreinem pBAC-ZIKV zur Rettung von Infektiöser rZIKV
HINWEIS: Die großflächige Herstellung eines infegeren ultrareinen pBAC-ZIKV-Klons, geeignet für die Transfektion und Rettung von infektiösen Viren, erfolgt durch alkalische Lyse mit einem speziell für die BAC-Reinigung entwickelten Handelskit (siehe Tabelle Materialien). Das Kit muss einen ATP-abhängigen Exonuklease-Verdauungsschritt enthalten, der die bakterielle genomische DNA-Kontamination entfernt und die Isolierung von BAC-cDNA mit einem Reinheitsgrad ermöglicht, der dem mit der Cäsiumchlorid-Methode ähnelt.
<ol><li>Wachsen Sie eine einzelne Kolonie von E. coli DH10B, die den pBAC-ZIKV infektiösen Klon in 5 ml Medium mit 12,5 g/ml Chloramphenicol bei 37°C für 8 h mit sanftem Schütteln (200-250 U/min) trägt.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml Bakterienkultur (Schritt 2.1) zu 500 ml LB mit 12,5 g/ml Chloramphenicol in einem 2 L-Kolben hinzu und wachsen Sie die Zellen bei 37°C für 14-16 h (bis zu einem OD600 von 0,6-0,8). HINWEIS: Reiche Brühen, wie Terrific Broth (TB), können extrem hohe Zelldichten erzeugen, was zu einer geringeren Ausbeute und weniger Reinheit der BAC cDNA führt.</li>
	<li>Reinigen Sie den BAC-infektiösen cDNA-Klon durch alkalische Lyse mit einem kommerziellen Kit, das speziell für die BAC-Reinigung entwickelt wurde, nach den Spezifikationen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien). Bewahren Sie die gereinigte BAC cDNA bei 4 °C auf. Je nach BAC-Größe können Erträge von 30 g ultrareinem BAC-cDNA-Klon erzielt werden. HINWEIS: Trocknen Sie das DNA-Pellet nicht mehr als 5 min, da eine Übertrocknung das Auflösen der BAC cDNA erschwert. Aufgrund der großen Größe des BAC cDNA-Klons vermeiden Sie Wirbel oder Pipettieren, um das Abscheren von Plasmid zu verhindern.</li>
</ol>3. Rettung von infektiösem rZIKV aus dem BAC cDNA Klon durch Transfektion von Vero-Zellen
HINWEIS: Infektiöse rZIKV wird durch die Transfektion von Vero-Zellen mit dem klonten pBAC-ZIKV cDNA unter Verwendung eines kommerziellen kationischen Lipidtransfektionsreagenzes wiederhergestellt (siehe Materialtabelle; Abbildung 3).
<ol><li>Einen Tag vor der Transfektion Platte auf 6-Well-Platten 5 x 105 Vero-Zellen/well im Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium [DMEM] ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum [FBS], 2 mM L-Glutamin und 1% nicht essentiellen Aminosäuren) ohne Antibiotika bis zur Transfektion 90% konfluente Zellmonolayer zu erhöhen. HINWEIS: Wir empfehlen, die Virusrettung in Triplicaten durchzuführen.</li>
	<li>
Gleichgewichtsserum reduziertes Medium (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur und Herstellung von Transfektionsmischungen in sterilen Mikrofugenrohren für jede Transfektionsprobe wie folgt.
	<ol>
<li>Fügen Sie 4 g des BAC-cDNA-Klons in 250 l serumreduziertes Medium hinzu und mischen Sie sorgfältig, wodurch Wirbel vermieden werden, um das Plasma-Scheren zu verhindern.</li>
		<li>In einem separaten Röhrchen 12 l Transfektionsreagenz (1 mg/ml) (siehe Materialtabelle)in 250 l serumreduziertem Medium verdünnen, durch Wirbel mischen und bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.</li>
		<li>Kombinieren Sie die verdünnte BAC cDNA und das Transfektionsreagenz (mit einem Verhältnis von 1:3 von DNA:Transfektionreagenz), mischen Sie sorgfältig unter Vermeidung von Wirbeln, und inkubieren bei Raumtemperatur für 20-30 min.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Während der Inkubationszeit der BAC cDNA/Transfektionreagenzmischung, waschen Vero-Zellen mit Wachstumsmedium ohne Antibiotika und lassen Sie die Zellen in 1 ml frischem Medium ohne Antibiotika. HINWEIS: Die Zugabe von Antibiotika während des Transfektionsprozesses kann die Transfektionseffizienz verringern.</li>
	<li>Die 500 l des BAC cDNA/Transfektionsreagenz-Gemischs (schritt 3.2.3) tropfenweise auf die Vero-Zellen verteilen, durch Hin- und Herschaukeln der Platte mischen und die Zellen in einem 5% CO2 befeuchteten Inkubator bei 37 °C für 6 h inkubieren.
</li>
	<li>Entfernen Sie das Transfektionsmedium, fügen Sie 2 ml frisches Wachstumsmedium mit Antibiotika (100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin) hinzu, inkubieren Sie die Zellen in einem 5 % CO2 befeuchteten Inkubator bei 37 °C und überprüfen Sie täglich die Induktion zytopathischer Wirkung (CPE ). HINWEIS: ZIKV CPE ist in Vero-Zellen sehr ausgeprägt und zeichnet sich durch das Vorhandensein von abgerundeten und birefringischen Zellen aus, die sich in der Gewebekultur überlagern und schweben.</li>
	<li>Sammeln Sie alle 24 h Aliquots (100 l) der Vero-Zellgewebekultur-Überreste (Schritt 3,5), um die Effizienz der Viruswiederherstellung zu bestimmen, indem Sie das Vorhandensein von ZIKV mit einem Standard-Plaque-Assay an frischen Vero-Zellen bewerten (Abbildung 4A).</li>
	<li>Nach vier bis sechs Tagen Transfektion, wenn der CPE etwa 50%-75% beträgt (Abbildung 4B), sammeln Sie die Gewebekultur-Überstände in 15 ml konischen Röhren und Zentrifuge bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C, um Zellablagerungen zuentfernen.
</li>
	<li>Die übers.ZIKV enthaltenden Überstande ernten und die Zellpellets entsorgen. Aliquot den Überstand in Kryoröhren und lagern Sie sie bei -80 °C, um das Vorhandensein von gerettetem rZIKV weiter zu bestätigen.</li>
</ol>4. Titration von recovered rZIKV
<ol><li>Einen Tag vor der Titration, Samen auf 12-Well-Platten 2,5 x 105 Vero-Zellen/gut im Wachstumsmedium, um 90% konfluente Zellmonolayer zum Zeitpunkt der Titration zu erhöhen. HINWEIS: Wir empfehlen, die Titration des wiedergewonnenen rZIKV in Triplicaten durchzuführen.</li>
	<li>Entfernen Sie ein Aliquot des Überstandes aus dem Gefrierschrank (Schritt 3.8) und machen Sie serielle 10-fache Verdünnungen im Wachstumsmedium ohne FBS.</li>
	<li>Waschen Sie Vero-Zellen 2x mit phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) und fügen Sie 200 L/Well jeder Virusverdünnung in Dreifache hinzu. Legen Sie Platten in einen 5% CO2 befeuchteten Inkubator bei 37 °C und Gestein alle 15 min für eine 90 min Adsorptionszeit.</li>
	<li>Entfernen Sie das virale Inokulum, überlagern Sie die Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium, das 2% FBS, 1% DEAE-Dextran und 0,6% Agar Noble enthält, und bebrüten bei 37 °C unter 5% CO2 für 3-4 Tage. HINWEIS: Es ist möglich, Agarose, Methylcellulose oder andere Overlay-Medien zu verwenden. Die Zeit für die richtige Plaquebildung variiert je nach verwendeter Überlagerung und ZIKV-Stamm.</li>
	<li>
Beheben Sie ZIKV-infizierte Zellen mit 1 ml/Well von 4% Formaldehyd, das in PBS bei Raumtemperatur für 1 h verdünnt wird, entfernen Sie die Überlagerung und visualisieren Sie die viralen Plaques, indem Sie sie mit 0,1% Kristallviolett in 20% Methanol bei Raumtemperatur für 15 min färben.
	<ol>
<li>Entsorgen Sie das Kristallviolett, waschen Sie 3x mit Wasser, lassen Sie die Platten trocknen und zählen Sie die Plaques manuell (Abbildung4C, linke Sbplatte). Viraler Titer wird als Plaque-Bildeinheiten pro Milliliter (PFU/ml) berechnet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Alternativ können virale Plaques durch Immunstainierung mit dem monoklonalen Antikörper pan-flavivirus E protein mouse (mAb) 4G2 (Abbildung4C, rechtes Panel) visualisiert werden.
	<ol>
<li>Zur Beurteilung von ZIKV-Plaques durch Immunfärbung, nach der Fixierung und Entfernung des Overlay-Agars wie oben beschrieben (in Schritt 4.5), waschen Sie die Zellen 2x mit PBS und permeabilisieren Sie sie durch Inkubation mit 200 l/Well von 0,5% Triton-X100 in PBS für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie die Permeabilisationslösung, waschen Sie die Zellen 3x mit PBS, und blockieren Sie sie mit 200 L/Well der Blockierlösung (10% FBS in PBS) für 1 h bei Raumtemperatur. HINWEIS: In diesem Schritt können weitere Standard-Blockierlösungen (z.B. 2,5% BSA in PBS) verwendet werden.</li>
		<li>Entfernen Sie die blockierende Lösung und inkubieren Sie die Zellen mit 200 l/Well des Panflavivirus E-Proteins mAb 4G2, das in einer blockierenden Lösung (1 g/ml) für 1 h bei 37 °C verdünnt wird. HINWEIS: Andere mAb- oder polyklonale Antikörper (pAb) können anstelle von 4G2 zur Immunfärbung und detektion von Virusplaques verwendet werden.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS, und inkubieren Sie sie mit 200 l biotinylantinierten Anti-Maus-Sekundärantikörpern verdünnt (nach der Empfehlung des Herstellers) in Blockierlösung für 1 h bei 37 °C.</li>
		<li>Entfernen Sie den sekundären Antikörper, waschen Sie die Zellen 4x mit PBS und visualisieren Sie die viralen Plaques mit einem Peroxidase-Kit auf Avidin-/Biotinbasis nach den Vorgaben des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Bestätigung der erfolgreichen rZIKV Rettung
HINWEIS: Um die Identität des geretteten Virus weiter zu bestätigen, wird die ZIKV E-Proteinexpression mittels Immunfluoreszenz mit der Maus mAb 1176-56 speziell für ZIKV E Protein analysiert (Abbildung 4D). Dieses mAb ist spezifisch für ZIKV E Protein, im Gegensatz zur Situation des Panflavivirus E Protein mAb 4G2 (Schritt 4.6.3). Alternativ kann die Virusidentität durch Sequenzierung bestätigt werden.
<ol><li>Einen Tag vor der Immunfluoreszenzanalyse bedeckt Samen die Lips in 24-Well-Platten, die 1 x 105 Vero-Zellen/well im Wachstumsmedium enthalten, um bis zur Infektion 90 % konfluente Zellmonolayer zu erhöhen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 2x mit PBS und infizieren Sie sie mit einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 0,5 PFU/Zelle des geretteten Virus im Wachstumsmedium ohne FBS (100 l/well) in Dreifacher). Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 90 min.</li>
	<li>Nach viraler Adsorption das virale Inokulum entfernen, 0,5 ml frisches Wachstumsmedium mit 2% FBS hinzufügen und die Zellen in einem 5% CO2 befeuchteten Inkubator bei 37 °C für 48 h inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Gewebekulturüberstand, fixieren Sie die Zellen mit 150 L/Well von 4% Paraformaldehyd in PBS für 20 min bei Raumtemperatur, und permeabilisieren Sie die Zellen mit 150 l/well von 0,5% Triton-X100 in PBS für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Nach dem Entfernen der Permeabilisationslösung und dem Waschen der Zellen 3x mit PBS, blockieren Sie die Zellen mit 150 L/Well der Blockierlösung während 1 h bei Raumtemperatur. HINWEIS: Der Zellscan wird mit alternativen Blockierlösungen (z.B. 2,5% BSA in PBS) blockiert.</li>
	<li>Entfernen Sie die Blockierende Lösung und inkubieren Sie die Zellen mit 100 l/Well von mAb 1176-56, spezifisch für ZIKV E-Protein, verdünnt in Blockierlösung (1 g/ml) für 1 h bei 37 °C.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS, inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 1 h mit 100 L/Well von Alexa Fluor 488-konjugiertem Anti-Maus-Sekundärantikörper verdünnt (auf Empfehlung des Herstellers) in Blockierlösung, waschen Sie die Zellen ausgiebig mit PBS und inkubieren Sie sie mit 150 l/Well von 4',6'-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI; 1 mg/ml) verdünnt 1:200 in PBS bei Raumtemperatur für 10 min.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS, montieren Sie die Abdeckungen auf einem Antifade-Montagemedium (siehe Materialtabelle) und analysieren Sie die Proben unter einem Fluoreszenzmikroskop. HINWEIS: Für die Langzeitlagerung Proben bei 4 °C lagern, vor Licht geschützt.</li>
</ol>6. Verstärkung und Generierung von Viralstocks
HINWEIS: Sobald die Identität des geretteten Virus bestätigt ist (Abschnitt 5), verstärken Sie das Virus auf Vero-Zellen und erzeugen Virale Bestände für weitere Studien.
<ol><li>Vero-Zellen in 100 mm x 21 mm Platten an 90% Zusammenfluss wachsen und mit einem MOI von 0,1 PFU/Zelle infizieren, wie zuvor beschrieben.</li>
	<li>Wenn der CPE etwa 75% (ca. 48-72 h Nachinfektion) beträgt, sammeln Sie den Gewebekulturüberstand in einem 50 ml kegelförmigen Rohr und Zentrifuge bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C, um den zellulären Schmutz zu entfernen.</li>
	<li>Den Überstand, der rZIKV enthält, zu ernten und das Zellpellet zu entsorgen. Aliquot den Überstand in Kryoröhren und lagern Sie sie bei -80 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie ein Virus Aliquot aus dem Gefrierschrank und bestimmen Sie den viralen Titer durch Plaque-Assay wie zuvor beschrieben (Abschnitt 4).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Infektiöse cDNA-Klone sind wesentliche molekulare Werkzeuge für die Grundlagenforschung von RNA-Viren und die Entwicklung von Impfstoffen und/oder die Identifizierung antiviraler Strategien. Bei vielen positiv gestrandeten RNA-Viren, einschließlich Flaviviren, ist die Erzeugung infektiöser cDNA-Klone jedoch aufgrund der Instabilität der geklonten cDNAs schwierig, wenn sie in Bakterien mit Standard-Plasmiden mit hoher Kopierzahl vermehrt werden. Im Falle von ZIKV und anderen Flaviviren ist diese Instabilität hauptsächlich auf die undichte Expression toxischer viraler Proteine von kryptischen bakteriellen Promotoren im viralen Genom14,15,16,17 zurückzuführen. . Hier beschreiben wir ein alternatives und leistungsfähiges Protokoll zur Erzeugung eines stabilen ZIKV-Infektiösen CDNA-Klons in voller Länge als einzelnes Plasmid, basierend auf der Verwendung des BAC-Plasmids pBeloBAC1134 (Abbildung 2A), um das Toxizitätsproblem, die CMV-Promotor, um die Expression der vRNA im Zellkern transfizierter Zellen zu ermöglichen, und der HDV RZ, um vRNAs mit genauen 3'-Enden zu erzeugen (Abbildung 2B). Mit dieser Methode haben wir erfolgreich einen vollständig stabilen infektiösen Klon des ZIKV-Stamms RGN erzeugt, der die effiziente und zuverlässige Rückgewinnung von infektiösem rZIKV nach der direkten Transfektion anfälliger Vero-Zellen ermöglicht (Abbildung 3 und Abbildung 4).
In den letzten Jahren wurden große Anstrengungen unternommen, um die Instabilitätsprobleme im Zusammenhang mit ZIKV-infektiösen cDNA-Klonen zu überwinden, und mehrere Ansätze wurden erfolgreich umgesetzt18, einschließlich der In-vitro-Ligation von cDNA-Fragmenten24 ,25, kopierarme Plasmide19,20, die Inaktivierung kryptischer bakterieller Promotoren durch die Einführung von stillen Mutationen26,27, Intron Insertion21, 22 , 23, die Gibson-Bauart30, die ISA-Methode28,29und die Verwendung von CPER31. Obwohl diese Ansätze das Toxizitätsproblem überwinden und nützlich sind, um ZIKV-infektiöse cDNA-Klone zu erzeugen, sind einige von ihnen mühsam und stellen mehrere Nachteile dar, einschließlich der Notwendigkeit von In-vitro-Ligations- und Transkriptionsschritten, die Viren reduzieren. Erholungseffizienz oder die Einführung einer hohen Anzahl von stillen Mutationen, um kryptischen bakteriellen Promotor zu inaktivieren, die virale Fitness beeinflussen könnte, unter anderem. Der in diesem Protokoll beschriebene Ansatz bietet die folgenden Vorteile. i) Das BAC-Plasmid pBeloBAC1134 hat eine streng kontrollierte Replikation, die eine oder zwei Kopien des Plasmids pro Zelle enthält, was die Toxizität minimiert und eine stabile Wartung von Bakterien instabiler cDNAs ermöglicht. ii) Die Vermehrung und Modifikation von BAC-Plasmiden ist fast ähnlich denen herkömmlicher Plasmide, wenn man die in diesem Protokoll beschriebenen geringfügigen Änderungen berücksichtigt, um großformatige BAC-DNA-Fragmente und kopierarme Plasmide zu manipulieren. Insbesondere kann der BAC cDNA-Klon auch durch homologe Rekombination mit dem Red-Rekombinationssystem42,43,44. iii) in E. coli modifiziert werden. intrazelluläre Expression von capped ZIKV vRNA und die Wiederherstellung von infektiösen Viren, ohne dass ein In-vitro-Transkriptionsschritt erforderlich ist. iv) Infektiöse sZIKV wird nach der direkten Transfektion von anfälligen Zellen (z.B. Vero) mit dem BAC cDNA Klon erzeugt. Da die DNA-Transfektion in Säugetierzellen effizienter ist als die RNA-Transfektion, ist die Effizienz der Viruswiederherstellung mit dem BAC-Ansatz höher als die, die mit RNA-Transkripten beobachtet wird, wodurch die Anzahl der Passagen in Kulturzellen reduziert wird, um einen viralen Bestand zu erzeugen, und die Einführung unerwünschter Mutationen durch Zellkulturanpassung zu begrenzen.
Schließlich wird das Potenzial des BAC-Ansatzes durch die erfolgreiche Anwendung dieser Methode (mit leichten Modifikationen) unterstützt, um infektiöse cDNA-Klone anderer Flaviviren, einschließlich des Dengue-Virus36, und mehrere Coronaviren mit hoher Wirkung in Gesundheit von Mensch und Tier, wie übertragbare Gastroenteritis Coronavirus37 (TGEV), Fein infektiöse peritonitis Virus38 (FIPV), humanes Coronavirus OC4339 (HCoV-OC43), schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus40 (SARS-CoV) und das Middle East respiratory syndrome coronavirus41 (MERS-CoV), unter anderem.
In dem hier beschriebenen Protokoll sind zwei wichtige Schritte zu berücksichtigen. Eine wichtige Überlegung ist die Identifizierung geeigneter einzigartiger Restriktionsstellen im viralen Genom, die im BAC-Plasmid fehlen. Wenn keine ausreichenden Restriktionsstellen verfügbar sind, können während des Klonens durch die Einführung von stillen Nukleotidmutationen neue Restriktionsstandorte erzeugt werden. Ein weiteres wichtiges Problem ist, dass die BAC-Plasmide nur in einer oder zwei Kopien pro Zelle vorhanden sind, und daher werden niedrige Erträge von BAC-Plasmiden mit einer hohen Kontamination der bakteriellen genomischen DNA mit Standardprotokollen für hoch- und Plasmide mit mittlerer Kopierzahl. Dieses potenzielle Problem lässt sich mit großen Kulturvolumina leicht lösen und das BAC-Plasmid mit einem kommerziellen Kit reinigen, das speziell für die BAC-Reinigung entwickelt wurde.
Zusammenfassend haben wir einen leistungsstarken ZIKV-Reverse-Genetik-Ansatz entwickelt, der auf der Verwendung eines BAC basiert, der angepasst werden könnte, um stabile und voll funktionsfähige infektiöse cDNA-Klone anderer positiv gestrandeter RNA-Viren zu erzeugen, um das Studium der Biologie dieser und die Entwicklung von Impfstoffen und/oder die Identifizierung antiviraler Arzneimittel zu erleichtern.

ZIKV ist ein von Mücken übertragenes Mitglied der Gattung Flavivirus innerhalb der Familie Flaviviridae, die derzeit einen globalen Gesundheitsnotstand darstellt1. Wie andere Flaviviren ist ZIKV ein umhülltes RNA-Virus mit einer eisaeralartigen Struktur, die ein positives, einsträngiges RNA-Molekül von etwa 10,8 kb enthält (Abbildung 1)2. Das virale Genom kodiert ein großes Polyprotein von ca. 3.423 Aminosäuren, die durch virale und zelluläre Proteasen in drei strukturelle Proteine (Capsid [C], Prämembran/Membran [prM/M], und Hüllkurve [E]) verarbeitet werden, die an der Bildung der Viruspartikel und sieben nichtstrukturelle (NS) Proteine (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B und NS5), die an der Genomreplikation, Virusmontage und Umgehung der Immunantwort des Wirts beteiligt sind (Abbildung 1)3.
Historisch gesehen wurde eine ZIKV-Infektion mit einer leichten fiebrigen Erkrankung in Verbindung gebracht4,5. Jedoch, die explosive jüngste Pandemie der ZIKV-Infektionen in süd- und mittelamerika, dem Südpazifik und der Karibik6,7,8, und seine Assoziation mit dem Auftreten des Guillain-Barré-Syndroms und Mikrozephalie9,10,11,12,13, haben die historische Wahrnehmung verändert und die Relevanz von ZIKV als wichtiger menschlicher Erreger potenziert. In diesem Sinne wird die Entwicklung molekularer Instrumente, wie infektiöse cDNA-Klone, die Untersuchung der viralen Pathogenese und die Entwicklung genetisch definierter Impfstoffe sowie die Identifizierung antiviraler Medikamente zur Behandlung von ZIKV-Infektionen erleichtern. Wie bei anderen Flaviviren beschrieben, ist die Erzeugung von ZIKV-infektiösen Klonen aufgrund des Vorhandenseins kryptischer bakterieller Promotoren im viralen Genom14 schwierig, die die undichte Expression toxischer viraler Proteine während der Ausbreitung der cDNA-Klone in Bakterien mit Standard-Plasmiden mit hoher Kopierzahl15,16,17. Um dieses Toxizitätsproblem zu überwinden, wurden in den letzten zwei Jahren mehrere nicht-traditionelle Ansätze erfolgreich umgesetzt18. Dazu gehören die Verwendung von Plasmiden mit geringer Kopierzahl19,20, die Einfügung von Introns, um die toxischen Regionen21,22,23, die In-vitro-Ligation von cDNA-Fragmenten zu stören 24 , 25, Mutations-Silencing von kryptischen bakteriellen Promotoren im viralen Genom26,27, infektiöse subgenomische Amplika (ISA)28,29, die Gibson-Montagemethode30 , und die Verwendung von kreisförmiger Polymerase-Verlängerungsreaktion (CPER)31.
Hierin beschreiben wir das detaillierte Protokoll für die Konstruktion eines cDNA-Klons der ZIKV-Sorte ZIKV-RGN13in voller Länge, mit einem BAC zur Überwindung des Toxizitätsproblems und der Rettung von infektiösem rZIKV durch direkte Transfektion des BAC-cDNA-Klons in Vero Zellen32, eine von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Zelllinie für die Entwicklung von Humanimpfstoffen33. In diesem System wird die cDNA-Kopie des viralen Genoms in voller Länge im BAC-Plasmid pBeloBAC1134 (Abbildung 2A) zusammengestellt, einem Plasmid mit geringer Kopierzahl (ein bis zwei Kopien pro Zelle), das aus dem Escherichia coli F-Faktor35abgeleitet ist. die die Toxizität von Flavivirussequenzen während seiner Ausbreitung in Bakterien minimiert. Die cDNA des ZIKV-Genoms wird in pBeloBAC11 unter der Kontrolle des menschlichen CMV-Sofort-Frühpromotors zusammengesetzt, um die Expression der viralen (v)RNA im Zellkern transfizierter Zellen durch zelluläre RNA-Polymerase II zu ermöglichen, und am 3'-Ende durch die Hepatitis flankiert Deltavirus (HDV) Ribozym (RZ), gefolgt von den Sequenzen des Rinderwachstumshormons (BGH) Beendigung und Polyadenylierung Signale, um synthetische RNAs mit authentischen 5'- und 3'-Enden des viralen Genoms zu produzieren, bzw. (Abbildung 2B). Dieses cDNA-gestartete System führt zur intrazellulären Expression von capped viraler RNA, was die Wiederherstellung von infektiösem ZIKV ermöglicht, ohne dass ein In-vitro-Transkriptionsschritt erforderlich ist. Der BAC-Ansatz bietet eine leistungsfähige Methodik zur Konstruktion stabiler und voll funktionsfähiger infektiöser cDNA-Klone für andere Flaviviren sowie andere positiv gestrandete RNA-Viren36,37, 38,39,40,41.

<table><tbody><tr><td><stark>1. Reagenzien für die Molekularbiologie</td>Afe I New England BioLabs R0652S 10.000 Einheiten/ml AmpliTaq DNA-Polymerase <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific (Angewandte Biosysteme)</td><td>N8080161</td><td>5.000 Einheiten/mL</td></tr><tr><td>ApaL I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0507S</td><td>10.000 Einheiten/mL</td></tr><tr><td>Asc I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0558S</td><td>10.000 Einheiten/ mL</td></tr><tr><td>BamH I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td>10.000 Einheiten/mL</td></tr><tr><td>BstB I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0519S</td><td>20.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX DH10B Zellen&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>18290015</td><td>Elektroporationsküvetten für elektrostatische DH10B-Zellen</td></tr><tr><td>, 0,2 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2086</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>brennbares</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>brennbarer</td></tr><tr><td>Großbausatz (10)</td><td>QIAGEN</td><td>12462</td><td>Für die hochreine BAC-Zubereitung</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)12780029</td><td></td> <td>Kann auch hausgemacht werden</td></tr><tr><td>LB mit Agar</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>22700041</td><td>Kann auch hausgemacht werden</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck</td><td>106009</td><td>Flambable</td></tr><tr><td>Mlu I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0198S</td><td>10.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>Oligonukleotide</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Midi Kit (25)</td><td>QIAGEN</td><td>12143</td><td>Für die mittelgroße Herstellung von BAC-Plasmiden</td></tr><tr><td>Pml I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0532S</td><td>20.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>Polypropylen-Röhrchen (10 mL)</td><td>DeltaLab</td><td>175724</td><td>Andere kommerzielle Quellen sind akzeptabel</td></tr><tr><td>QIAEX II Gel-Extraktionskit (150)</td><td>QIAGEN</td><td>20021</td><td>Gel-Clean-up-Kit, optimiert für DNA-Fragmente größer als 10 kb</td></tr><tr><td>Garnelen-AlKaline-Phosphatase (rSAP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0371S</td><td>1.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>SOC-Medium</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>15544034</td><td>Kann auch hausgemacht werden</td></tr><tr><td>Synthese von cDNA-Fragmenten</td><td>Bio Basic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>10481220001</td><td>1.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td><stark>2. Zellkultur-Reagenzien</stark>6-Well-Platten</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific (Nunc)</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platten</td><td>ThermoFisher Scientific (Nunc)</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>ThermoFisher Scientific (Nunc)</td><td>142485</td><td></td></tr><tr><td>Agar Noble</td><td>VWR</td><td>214230</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Konjugat-Ameisen-Maus Sekundärer Antikörper</td><td>Variiert</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierter Anti-Maus-Antikörper</td><td>Variiert</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschalen (100 mm x 21 mm)</td><td>ThermoFisher Scientific (Nunc)</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Konische Röhrchen (15 mL)</td><td>VWR</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>Konische Röhrchen (50 mL)</td><td>VWR</td><td>525-0155</td><td></td></tr><tr><td>Kristallviolett</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Giftiges und krebserregendes</td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific (HyClone))</td><td>SV30160,03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Giftiges und krebserregendes</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>11668019</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Nichtessentielle Aminosäuren</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduziertes Serummedium</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>31985070</td><td>Transfektionsmedium</td></tr><tr><td>Pan-Flavivirus E Protein mAb 4G2</td><td>BEI Resources</td><td>NR-50327</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-S</td><td>Toxisches und krebserregendes</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagenz</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Kit</td><td>Vector Laboratories Inc</td><td>PK-4010</td><td>Avidin/Biotin-basiertes Peroxidase-Kit</td></tr><tr><td>Vero Cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ZIKV E Protein mAb 1176-56</td><td>BioFront Technologies</td><td>BF-1176-56</td><td></td></tr><tr><td><stark>3. Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Gel-Elektrophorese-System</td><td>Bio-Rad</td><td>1704468</td><td>Andere kommerzielle Quellen sind akzeptabel</td></tr><tr><td>Biosicherheit Klasse II CO2 Schrank</td><td>Variiert N</td><td>/A</td><td>Andere kommerzielle Quellen sind akzeptabel</td></tr><tr><td>Desktop-Kühlzentrifuge</td><td>Variiert</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Variiert</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge</td><td>Variiert</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser Elektroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td>Andere Maschinen sind akzeptabel</td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>A24811</td><td>Andere Maschinen sind akzeptabel</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Variiert</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

rettung des rekombinanten zika-virus aus einem bakteriellen künstlichen chromosom cdna-klon

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

Die Assoziation von Zika-Virus (ZIKV) Infektion mit neurologischen Komplikationen während der jüngsten weltweiten Ausbruch und das Fehlen von zugelassenen Impfstoffen und / oder antiviralen haben die dringende Notwendigkeit, ZIKV Reverse genetische Systeme zu entwickeln, um die Studium der ZIKV-Biologie und Entwicklung therapeutischer und/oder prophylaktischer Ansätze. Wie bei anderen Flaviviren wurde jedoch die Erzeugung von ZIKV-infektiösen cDNA-Klonen in voller Länge aufgrund der Toxizität viraler Sequenzen während der Amplifikation bei Bakterien behindert. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir einen nicht-traditionellen Ansatz entwickelt, der auf der Verwendung von bakteriellen künstlichen Chromosomen (BACs) basiert. Mit diesem Ansatz wird die cDNA-Kopie des ZIKV-Stamms Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) aus vier synthetischen DNA-Fragmenten erzeugt und unter der Kontrolle des humanen Zytomegalievirus (CMV) in das einkopierte pBeloBAC11-Plasmid zusammengestellt. sofort-frühzeitigen Projektträger. Der zusammengesetzte BAC cDNA-Klon ist während der Ausbreitung in Bakterien stabil, und das infektiöse rekombinante (r)ZIKV wird in Vero-Zellen nach der Transfektion des BAC-cDNA-Klons zurückgewonnen. Das hier beschriebene Protokoll bietet eine leistungsfähige Technik für die Erzeugung von infektiösen Klonen von Flaviviren, einschließlich ZIKV, und anderen positiv-strang-RNA-Viren, insbesondere solche mit großen Genomen, die Stabilitätsprobleme während der bakteriellen Vermehrung.

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Erzeugung stabiler ZIKV-CDNA-Infektiöse Klone in voller Länge unter Verwendung eines BAC, um die Toxizitätsprobleme im Zusammenhang mit mehreren flaviviralen Sequenzen zu minimieren. Effiziente Rückgewinnung von infektiösem rZIKV aus dem BAC cDNA Klon kann leicht nach der Transfektion anfälliger Vero-Zellen erreicht werden (Abbildung 2). Mit diesem Protokoll haben wir einen stabilen cDNA-Klon der ZIKV-Sorte RGN32 in voller Länge erzeugt, indem wir vier überlappende cDNA-Fragmente sequenziell in das BAC-Plasmid pBeloBAC1134 mit konventionellen Klonmethoden und einzigartigen Restriktionsstellen im viralen Genom (Abbildung 2). Der cDNA-Klon in voller Länge wurde am 5'-Ende vom humanen CMV-Promotor flankiert, um die Expression von vRNA im Zellkern transfizierter Zellen zu ermöglichen, und am 3'-Ende durch die HDV RZ, gefolgt von den BGH-Polyadenylierungs- und -Terminidensequenzen, um RNAs zu erzeugen, die das exakte 3'-Ende des viralen Genoms (Abbildung 2). Die Stabilität des erzeugten BAC cDNA-Klons in Bakterien sowie seine einfache Manipulation mit Standard-Rekombinanten-DNA-Technologien unterstreicht das Potenzial des BAC cDNA-Ansatzes für die schnelle und zuverlässige Generierung stabiler cDNA-Klone ZIKV und andere Flaviviren oder positiv gestrandete RNA-Viren mit instabilen viralen Genomen.
Sobald der BAC cDNA-Klon zusammengesetzt war (Abbildung 2), konnte das infektiöse Virus nach der direkten Transfektion anfälliger Vero-Zellen mit dem BAC-cDNA-Klon mit kationischen Liposomen leicht zurückgewonnen werden(Abbildung 3). Dieses cDNA-gestartete System ermöglichte die intrazelluläre Expression der gekapselten vRNA, die die Wiederherstellung von infektiösen Viren ermöglichte, ohne dass ein In-vitro-Transkriptionsschritt erforderlich war. Mit diesem Ansatz konnten wir rZIKV-RGN mit Titfern über 106 PFU/ml bei 5 Tagen Nachtransfektion retten (Abbildung 4A). Darüber hinaus induzierte das gerettete Virus eine klare CPE (Abbildung 4B), erzeugte homogene Plaques von etwa 2 mm Größe (Abbildung 4C), und seine Identität wurde durch Sequenzierung (Daten nicht gezeigt) und Immunfluoreszenzanalyse mit dem mAb-spezifischen für ZIKV E-Protein, 1176-56 (Abbildung 4D). In-vitro-Daten deuten darauf hin, dass sich der wiedergewonnene rZIKV-RGN effizient in Vero-Zellen und auf Werte im Vergleich zu einem natürlichen ZIKV-Isolat32 repliziert hat (Daten nicht dargestellt). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass infektiöse rZIKV aus in einem BAC montierten cDNA-Klonen in voller Länge gerettet werden kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig1.jpg"> Abbildung 1 : ZIKV Genomorganisation und Virionstruktur. (A) Genomorganisation: ZIKV enthält eine positive einsträngige RNA, die als einzelnes Polyprotein übersetzt wird. Das übersetzte Polyprotein wurde durch virale (Pfeile) und Wirtsproteasen (Diamanten) zur Herstellung der strukturellen Proteine Capsid (C, blau), Matrix (M, braun) und Umhüllung (E, grün) und sieben nichtstrukturellen Proteinen (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B und NS5) gespaltet. Die 5' und 3' unübersetzten Regionen (UTRs) am Ende des viralen Genoms sind mit schwarzen Linien gekennzeichnet. (B) Virionsstruktur: ZIKV-Virionen wurden mit den E- und M-Proteinen verziert, verankert in einem Lipid-Doppelschicht mit einer ikosaedralen Struktur. Unter der viralen Umhüllung befand sich das virale Nukleocapsid, das aus dem C-Protein bestand, das mit der viralen genomischen RNA assoziiert war. Diese Figur wurde von évila-Pérez et al.18adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig2.jpg"> Abbildung 2 : Montage des ZIKV-Infektiösen cDNA-Klons in voller Länge in einem BAC. (A) Schematische Darstellung des pBeloBAC11 BAC:Die regulatorischen Gene parA, parB, parCund repE,der F-Faktor-Replikationsursprung (OriS), das Chloramphenicol-resistente Gen (Cmr) und das lac Z-Gen sind indiziert. Die relevanten Restriktionsstellen, die zur Zusammenstellung des infektiösen ZIKV-cDNA-Klons verwendet werden, werden unterstrichen. (B) Montage des INfektiösen CDNA-Klons in der ganzen Länge in den pBeloBAC11 BAC:Vier überlappende DNA-Fragmente (Z1-Z4), die das gesamte ZIKV-Genom abdecken (Abbildung 1) und flankiert von den angegebenen Restriktionsstellen, wurden durch chemische und sequenziell in pBeloBAC11 geklont, um den infektiösen ZIKV-cDNA-Klon pBAC-ZIKV zu erzeugen. Die inteiöse cDNA in voller Länge wurde unter der Kontrolle des menschlichen Zytomegalievirus-Sofort-Frühpromitens (CMV) montiert und am 3'-Ende durch das HDV-Ribozym (RZ) und die Beendigungs- und Polyadenylierungssequenzen des Rinderwachstumshormons (BGH) flankiert. Die Akronyme für die viralen Gene und regulatorischen Elemente sind wie in Abbildung 1beschrieben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig3.jpg"> Abbildung 3 : Workflow zum Generieren von rZIKV aus dem BAC cDNA-Klon. Vero-Zellen bei 90% des Zusammenflusses wurden in Monolayer mit dem ZIKV-InfektiösecDNA-Klon pBAC-ZIKV (Abbildung 2) mit kationischen Liposomen transfiziert. Nach 4-6 Tagen nach der Transfektion, als CPE offensichtlich war, wurden gewebekulturüberstände, die rZIKV enthalten, gesammelt und auf das Vorhandensein von Viren untersucht (Abbildung 4) und zur viralen Amplifikation in Vero-Zellen verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig4.jpg"> Abbildung 4 : Rückgewinnung und In-vitro-Charakterisierung von rZIKV. (A) Rettung von infektiösem rZIKV aus dem BAC-cDNA-Klon: Vero-Zellen bei 90 % des Zusammenflusses (6-Well-Plattenformat, Triplicate) wurden mit 4 g/well pBAC-ZIKV (Abbildung3) und an den angegebenen Tagen nach der Transfektion verspottet oder transfiziert, Virustiter in Gewebekulturüberstand wurden durch Plaque-Assay (PFU/mL) bestimmt. Die Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen von drei verschiedenen Transfektionsexperimenten an. Die gepunktete schwarze Linie gibt die Erkennungsgrenze (50 PFU/ml) an. (B) Virale CPE:Vero-Zellen bei 90% Zusammenfluss (6-Well-Plattenformat, Triplicate) waren mock-infiziert (oben) oder infiziert (MOI von 0,5 PFU/Zelle) mit rZIKV, und bei 48 h Nachinfektion wurde das Vorhandensein von CPE durch Lichtmikroskopie bewertet. SkalaBalken = 100 m . (C) Viralplaque-Assay und Immunfärbung: Vero-Zellen bei 90% Zusammenfluss (12-Well-Plattenformat) wurden mit rZIKV infiziert, und bei 72 h Postinfektion wurden virale Plaques durch kristallviolette Färbung (links) oder durch Immunfärbung ( rechts) mit dem Panflavivirus E Protein mAb 4G2. Skalenstäbe = 5 mm. (D) Immunfluoreszenz:Vero-Zellen bei 90% Zusammenfluss (24-Well-Plattenformat, Triplicate) wurden infiziert (MOI von 0,5 PFU/Zelle) mit rZIKV und bei 48 h Nachinfektion durch Immunfluoreszenz mit dem mAb 1176-56, spezifisch für ZIKV E-Protein. Zellkerne wurden mit DAPI befleckt. Ein repräsentatives zusammengeführtes Bild von ZIKV-infizierten Vero-Zellen wird gezeigt. Das weiße Quadrat oben rechts stellt ein vergrößertes Bild von ZIKV-infizierten Vero-Zellen dar. Skalenbalken = 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Die jüngste Epidemie des Zika-Virus unterstreicht, wie wichtig es ist, umgekehrte genetische Ansätze zur Entwicklung von Impfstoffen und/oder therapeutischen Strategien zu entwickeln. Hier beschreiben wir das Protokoll zur Rettung eines infektiösen rekombinanten Zika-Virus aus einem cDNA-Klon in voller Länge, der in einem bakteriellen künstlichen Chromosom unter der Kontrolle des menschlichen Zytomegalievirus zusammengebaut wurde.

Rettung des rekombinanten Zika-Virus aus einem bakteriellen künstlichen Chromosom cDNA-Klon

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist die Erzeugung eines infektiösen rekombinanten Zika-Virus aus einem cDNA-Klon in voller Länge, der in einem bakteriellen künstlichen Chromosom unter der Kontrolle des menschlichen Zytomegalievirus sofort-früh prognostmontiert wird. Die Entwicklung eines umgekehrten genetischen Systems für RNA-Viren wie das Zika-Virus ermöglicht die direkte Manipulation des Virusgenoms, um mehrere Aspekte der Virusbiologie und Pathogenese zu untersuchen und eine Impfstoffstrategie zu entwickeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Konstruktion des infektiösen Klons des Zika-Virus als bakterielles künstliches Chromosom die mit dem Flavivirus-Genom verbundene Toxizität überwindet und die Rettung von infektiösen Viren durch direkte Transfektion des BAC-cDNA-Klons in anfällige Zellen ermöglicht.Diese Methode könnte auf die Konstruktion stabiler und voll funktionsfähiger infektiöser cDNA-Klone für andere Flaviviren sowie andere positiv gestrandete RNA-Viren angewendet werden. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, erstellen Sie den Zika-Virus-cDNA-Klon, wie im Textprotokoll beschrieben, unter Verwendung geeigneter Einschränkungssites. Vier DNA-Fragmente, die das Genom des Zika-Virus überspannen, die vom menschlichen CMV-Promotor am Fünf-Prim-Ende flankiert werden, und das Hepatitis-Delta-Virus Ribososo und das Rinderwachstumshormon-Ende und Polyadenylierungssequenzen am Drei-Prim-Ende werden in einem bakteriellen künstlichen Chromosomenplasmid zusammengesetzt.Zuerst wachsen sie eine einzige Kolonie von E.coli DH10B, die den pBAC-Zika-Virus infektiösen Klon in fünf MilliliterLB-Medium mit Chloramphenicol für acht Stunden bei 37 Grad Celsius mit sanftem Schütteln trägt. Dann 500 Milliliter des LB-Mediums, das Chloramphenicol enthält, in einen Zweiliterkolben geben. Fügen Sie einen Milliliter der vorbereiteten Bakterienkultur in den Kolben und wachsen die Zellen bei 37 Grad Celsius für 14 bis 16 Stunden, bis die OD600 etwa 0,6 bis 0,8 beträgt.Danach verwenden Sie ein kommerzielles Kit speziell für BAC-Reinigung entwickelt, um die BAC-Infektion cDNA Klon durch alkalische Lyse zu reinigen, indem Sie die Anweisungen des Herstellers. Einen Tag vor der Transfektion platten Vero-Zellen in die Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit einer Dichte von 500.000 Zellen pro Brunnen im Wachstumsmedium. Um den Transfektionsmix vorzubereiten, fügen Sie vier Mikrogramm des BAC cDNA-Klons zu 250 Mikroliter Serum reduzierten Medium sund und sorgfältig mischen.In einem separaten Rohr 12 Mikroliter Transfektionsmittel in 250 Mikroliter Serum reduziert Medium verdünnen. Wirbel bei Raumtemperatur für fünf Minuten mischen und inkubieren. Als nächstes kombinieren Sie die verdünnte BAC cDNA mit dem Transfektionsmittel.Sorgfältig mischen und bei Raumtemperatur 20 bis 30 Minuten inkubieren. Während dieser Inkubationszeit verwenden Sie Wachstumsmedium ohne Antibiotika, um die Vero-Zellen zu waschen und die Zellen in einem Milliliter frisches Medium ohne Antibiotika zu lassen. Dann verteilen Sie die 500 Mikroliter der cDNA und Transfektionreagenz-Mischung auf die Vero-Zellen tropfenweise.Die Platte hin und her schaukeln, um die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für sechs Stunden zu mischen und zu bebrüten. Danach entfernen Sie das Transfektionsmedium und fügen Sie zwei Milliliter frisches Wachstumsmedium mit Antibiotika hinzu. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, wobei sichergestellt ist, dass sie jeden Tag auf Induktion der zytopathischen Wirkung überprüfen.Nach vier bis sechs Tagen Transfektion, wenn die CPE ist etwa 50 bis 75%sammeln die Gewebekultur Überstände in 15-Milliliter konischen Röhren und Zentrifuge für 10 Minuten Zellabfall zu entfernen. Dann ernten Sie die Überstande, die das rekombinante Zika-Virus enthalten, und entsorgen Sie die Zellpellets. Aliquot den Überstand in Kryoröhren und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.Zunächst können Vero-Zellen zu 90 % zusammengezüchtet werden. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und infizieren Sie sie mit dem geretteten Virus mit der Vielzahl der Infektion von 0,1 in Wachstumsmedium mit 2%FBS. Legen Sie die Platten der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und Gestein alle 15 Minuten für die 90-minütige Adsorptionszeit.Nach viraler Adsorption, entfernen Sie das virale Inokulum und fügen Sie frisches Wachstumsmedium mit 2%FBS. Drei oder vier Tage zu den zuvor verwendeten Bedingungen inkubieren. Wenn die CPE ist etwa 75%sammeln die Gewebekultur Überstand und Zentrifuge, um Zellablagerungen zu entfernen.Dann ernten Sie den Überstand, der das rekombinante Zika-Virus enthält, und entsorgen Sie das Pellet. Aliquot der Überstand in Kryoröhren. Die Rohre in eine Gefrierbox geben und bei minus 80 Grad Celsius aufbewahren.Wenn Sie bereit sind, entfernen Sie ein Virus aliquot aus dem Gefrierschrank und bestimmen Sie den viralen Titer durch Plaque-Assay, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie wird ein stabiler, vollständiger cDNA-Klon des Zika-Virusstamms Rio Grande do Norte Natal erzeugt, indem vier überlappende cDNA-Fragmente sequenziell in das bakterielle künstliche Chromosom pBeloBAC11 mit herkömmlichen Klonmethoden und einzigartigen Restriktionsstellen im viralen Genom klonen. Dieser cDNA-Klon in voller Länge wurde am Fünf-Prim-Ende vom humanen Zytomegalievirus-Promotor flankiert, um die Expression viraler RNA im Zellkern transfizierter Zellen und am Drei-Primat-Ende durch das Hepatitis-Delta-Virus Ribosom gefolgt von der Rinderwachstumshormon-Beendigung und Polyadenylierungssequenz zu ermöglichen, um RNAs zu erzeugen, die das exakte Drei-Prim-Ende des viralen Genoms enthalten.Sobald die BAC cDNA montiert ist, kann das infektiöse Virus nach der direkten Transfektion von anfälligen Vero-Zellen mit dem BAC-cDNA-Klon mit kationischen Liposomen leicht zurückgewonnen werden. Mit diesem Ansatz kann das R-Zika-Virus RGN mit Tittern von mehr als einer Million Plaquebildenden Einheiten pro Milliliter gerettet werden. Darüber hinaus induziert das gerettete Virus eine klare zytopathische Wirkung und erzeugt homogene Plaques von etwa zwei Millimetern Größe.Die gerettete Virusidentität wird durch Immunfluoreszenzanalyse mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper für das Zika-Virus-E-Protein bestätigt. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass das infektiöse rekombinante Zika-Virus aus in einem BAC zusammengesetzten cDNA-Klonen in voller Länge gerettet werden kann. Zusammenfassend haben wir einen leistungsstarken genetischen Ansatz des Zika-Virus entwickelt, der auf der Verwendung eines bakteriellen künstlichen Chromosoms basiert, das angepasst werden könnte, um die stabilen und funktionellen Infektionen mit dem cDNA-Klon anderer positiv-strangRNA-Viren zu erzeugen, um die Untersuchung der Pathologie zu erleichtern, einen Impfstoff zu entwickeln und die Identifizierung von Medikamenten mit antiviraler Aktivität zu erleichtern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Rettung von Influenza A-Viren von Plasmid-DNA ist eine grundlegende und wichtige experimentelle Technik, die Influenza-Forscher an rekombinanten Viren zu erzeugen, um mehrere Aspekte in der Biologie des Influenza-Virus zu untersuchen und als potentielle Vektoren oder Impfstoffe verwendet werden können.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Rettung von rekombinanten Arenaviren von geklonten cDNAs, ein Ansatz, so genannte Reverse Genetik, ermöglicht es den Forschern, die Rolle der spezifischen viralen Genprodukte, sowie den Beitrag ihrer unterschiedlichen spezifischen Domänen und Rückstände zu untersuchen, um viele verschiedene Aspekte der Biologie von Arenavirus . Ebenso Techniken reverser Genetik in FDA-zugelassenen Zelllinien (Vero) für die Impfstoffentwicklung bietet neue Möglichkeiten für die Erzeugung und sichere Impfstoffe...

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

Newcastle Disease Virus (NDV) wurde ausgiebig in den letzten Jahren, um neue Vektoren für Impfung und Therapie zu entwickeln, unter anderem untersucht. Diese Studien wurden durch Techniken, um rekombinante Virus aus cDNA zu retten, wie die, die wir hier beschreiben, möglich.

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Hier wird ein Protokoll zur Erstellung eines infektiösen bakteriellen künstlichen Chromosoms vorgestellt, das eine cDNA in voller Länge der positivsträngigen genomischen RNA des Japanischen Enzephalitis-Virus enthält. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine funktionsfähige cDNA anderer positivsträngiger RNA-Viren zu konstruieren, was es zu einem leistungsstarken genomischen Werkzeug für die Untersuchung der Virusbiologie macht.

Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Zika-Virus (ZIKV), ein neu auftretender Erreger, wird mit fetalen Entwicklungsstörungen und Mikrozephalie in Verbindung gebracht. Die Etablierung eines effektiven infektiösen Zellkultursystems ist entscheidend für die Erforschung der ZIKV-Replikation sowie für die Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten. In dieser Arbeit werden verschiedene virologische Assays zum ZIKV dargestellt und diskutiert.

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Dieses Protokoll beschreibt die Wiederherstellung des infektiösen Zika-Virus aus einem zwei-Plasmid-infektiösen cDNA-Klon.

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Wir berichten mit einer künstlichen intronischen kleine RNA Ausdruck Strategie, um eine mangelfreie rekombinante Aedes Aegypti Densovirus (AaeDV) in Vivo -Delivery-System zu entwickeln. Eine detaillierte Anleitung für den Bau, die Verpackung und die Quantitative Analyse der rAaeDV Vektoren sowie für Larven Infektion wird beschrieben.

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Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um Zika Virus spezifische diagnostische Peptide mit einer High-Density-Peptid-Microarray entdecken. Dieses Protokoll kann für andere neu auftretende Infektionskrankheiten readly angepasst werden.

Zika-Virus spezifische diagnostische Epitop Entdeckung

Ein Protokoll, Antigen-spezifische T-Zell-Reaktionen in den Organen der Immunabwehr des Ifnar1- / - Mausmodell für die Zika-Virusinfektion (ZIKV) zu bewerten ist beschrieben. Diese Methode ist von zentraler Bedeutung für die Untersuchung der zellulären Mechanismen des Schutzes und immunpathogenese ZIKV Impfstoffe und ist auch wertvoll für die Beurteilung der Wirksamkeit.

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

Das vorgestellte Protokoll kann die Vektorkompetenz von Aedes aegypti-Mückenpopulationen für ein bestimmtes Virus, wie Zika, in einer Containment-Umgebung bestimmen.

Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

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Lernen Sie die Rettung von rekombinantem Zika-Virus aus einem bakteriellen künstlichen Chromosom cDNA-Klon. Diese Methode nutzt Vero-Zellen und ermöglicht die Entwicklung von Impfstoffstrategien.

Rettung des rekombinanten Zika-Virus aus einem bakteriellen künstlichen Chromosom cDNA-Klon

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