Name: Genotypisierung von Sea Anemone während der frühen Entwicklung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Lernen Sie die nicht-tödliche Genotypisierung von Nematostella vectensis während der Gastrulation zur Analyse postembryonaler Entwicklungsphänotypen. Diese Methode ermöglicht die frühe Mutantenidentifikation ohne Embryonenverlust.

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Wir danken anonymen Rezensenten für Kommentare zur früheren Version des Manuskripts, die das Manuskript verbessert hat. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der University of Arkansas unterstützt.

1. Induktion von Laichen, In-vitro-Fertilisation und Entgeleeung
<ol><li>Halten Sie Nematostella vectensis im Meerwasser mit einem Salzgehalt von 12 Teilen pro Tausend (ppt) in der Dunkelheit bei 16 °C, Fütterung Artemia täglich.</li>
	<li>Am Tag vor der Laichinduktion die Tiere in einen temperatur- und lichtgesteuerten Inkubator geben. Programmieren Sie den Inkubator so, dass die Tiere bei 25 °C 8 h Licht ausgesetzt sind. Optional: Füttern Sie einzelne Tiere einkleines Stück Austern (<1 mm 3), bevor Sie sie in den Brutkasten legen, um das Laichen zu verbessern.</li>
	<li>Lassen Sie die Tiere im Brutkasten für 1 h bei 16 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie die Tiere aus dem Brutkasten und lassen Sie sie auf einer Tischplatte mit Licht bei Raumtemperatur (RT), um das Laichen zu ermöglichen. Das Laichen erfolgt in der Regel innerhalb der nächsten 1,5-2 h.</li>
	<li>Wenn Männchen und Weibchen in getrennten Behältern sind, legen Sie Eipakete aus dem weiblichen Behälter in einen Sperma-haltigen männlichen Behälter, indem Sie eine Transferpipette verwenden, deren Spitze geschnitten wird, um die Öffnung zu vergrößern, damit die Eier nicht durch mechanische Beanspruchung während der verlegen. Lassen Sie die Befruchtung der Eier zu, indem Sie sie mindestens 15 min im männlichen Behälter lassen.</li>
	<li>Entgelee die Ei-Pakete in Meerwasser mit 3% Cystein (pH 7.4) auf einer Petrischale oder in einem 15 ml Rohr. Rühren Sie 12 min lang sanft auf einem Shaker.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um Klumpen aufzubrechen und weiter für weitere 2-3 min zu agitieren, bis sie vollständig entgelt werden.</li>
	<li>Entfernen Sie Cystein, indem Sie die Medien durch frisches Meerwasser für mindestens 5x ersetzen.</li>
	<li>Bewahren Sie die befruchteten Eier auf einer glasigen Petrischale bei 16 °C oder RT auf.</li>
</ol>2. Chirurgische Entfernung eines Aboralgewebes aus einem Gastorula-Embryo
<ol><li>Bereiten Sie einen DNA-Extraktionspuffer vor, der aus 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 und 1 mg/mL-Proteinase K besteht. Verwenden Sie 20 ml des Extraktionspuffers pro Embryo. Mischen Sie gut durch Wirbeln und aliquot den Puffer in PCR-Röhren.</li>
	<li>1% Agarose im Meerwasser auflösen und in eine Petrischale gießen, um den Boden zu bedecken. Kühlen Sie auf einer Tischplatte, um ein Gelbett zu machen. Gießen Sie frisches Meerwasser, um das Gelbett in der Petrischale zu bedecken.</li>
	<li>24 h Embryon nach der Befruchtung (hpf) (Früh- bis Mittelgastrulastadium) in die Petrischale mit einem Agarose-Gelbett übertragen.</li>
	<li>Legen Sie eine Wolframnadel in einen Nadelhalter und sterilisieren, indem Sie die Nadelspitze in Alkohol (70% oder höher) tauchen und in Flammen setzen, um den Alkohol abzubrennen.</li>
	<li>Verwenden Sie unter einem Sezierendes Mikroskop (bei 20x bis 40x Vergrößerung) die Wolframnadel, um eine Depression auf dem Agarosebett zu machen, indem Sie ein Stück Oberflächenagarose von der Größe eines zu manipulierenden Embryos entfernen, und legen Sie den Embryo mit seiner seitlichen nach unten gerichtet, um die Bewegung des Embryos für die Mikrochirurgie einzuschränken.</li>
	<li>Verwenden Sie die Wolframnadel, um ein Stück Aboralgewebe gegenüber der oralen blastoporalen Öffnung chirurgisch zu verbrauchen. Ein aborales Drittel bis ein Viertel des embryonalen Gewebes entlang der oral-aboralen Achse ist in der Regel ausreichend.</li>
	<li>Verwenden Sie eine P20-Pipette, um das isolierte Abbruchgewebe (in <2 ml) in ein PCR-Rohr mit 20 ml DNA-Extraktionspuffer zu übertragen.</li>
	<li>Übertragen Sie den embryonalen Embryo nach der Operation in einen Brunnen, der mindestens 500 ml Süßwasser in einer 24- oder 96-Well-Platte enthält.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.4–2.8 für die Anzahl der Embryonen nach Bedarf.</li>
	<li>Legen Sie die Brunnenplatte mit post-surgery embryos in einem Inkubator bei 16 °C oder RT, bis die Genotypisierung abgeschlossen ist.</li>
</ol>3. Genomische DNA-Extraktion und Genotypisierung PCR
<ol><li>Drehen Sie die PCR-Röhren, die den DNA-Extraktionspuffer und isolierte embryonale Gewebe enthalten, kurz mit einer Minizentrifuge (z.B. bei 2.680 x g für 10 s) herunter.</li>
	<li>Um genomische DNA aus einzelnen Embryonen zu extrahieren, inkubieren Sie die PCR-Röhren bei 55 °C für 3 h. Wirbel für 30 s alle 30 min, um das Aufbrechen von Zellklumpen zu gewährleisten und die Zelllyse zu verbessern.</li>
	<li>Inkubieren Sie die PCR-Röhren bei 95 °C für 5 min, um die Proteinase K zu inaktivieren.</li>
	<li>GDNA-Extrakte bei 4 °C oder auf Eis aufbewahren und sofort zur PCR übergehen. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden, indem gDNA-Extrakte in einem -20 °C-Gefrierschrank platziert werden.</li>
	<li>Richten Sie eine PCR-Reaktion mit extrahierter gDNA als Vorlage ein, um den genomischen Ort von Interesse zu verstärken.<ol>
<li>Wenn sich verschiedene Allele am Ort des Interesses in der Größe unterscheiden, so dass der Größenunterschied durch Agarose-Gel-Elektrophorese erkannt werden kann, entwerfen Sie einen einzigen Satz von Primern, um den gesamten Ort zu verstärken.</li>
		<li>Alternativ können Sie allelespezifische Primer verwenden, die PCR-Produkte nur in Gegenwart des spezifischen Alleels erzeugen; z. B. durch Entwerfen des Primers, der an einen Bereich bindet, der Einfüge-/Löschmutationen enthält.</li>
		<li>Verwenden Sie einen typischen 20 ml PCR-Reaktionsmix wie folgt: 5 ml gDNA-Extrakte, 8 ml nukleasefreies Wasser, 4 ml PCR-Puffer, 0,2 ml 10mM dNTPs, 0,6 ml DMSO, 1 ml 10 ml Vorwärtsgrundierung, 1 ml 10 ml Reverse Primer und 0,2 ml DNA-Polymerase (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Mehrere Primer können in einer PCR-Reaktion verwendet werden. So können beispielsweise ein universeller Vorwärtsprimer und zwei allelespezifische Reverse Primer kombiniert werden, sofern die beiden Reverse Primer so konzipiert sind, dass pcR-Produkte unterschiedlicher Größe erzeugt werden, so dass das Vorhandensein/Fehlen der beiden Allele eindeutig sein kann. Gelelektrophorese bestimmt (siehe Abschnitt repräsentative Ergebnisse).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie agarose GelElektrophorese, um die Größe und Präsenz / Abwesenheit von PCR-Produkten zu bestimmen. Passen Sie den Zustand der Agarose-Gel-Elektrophorese (z. B. Agarose-Gel-Prozentsatz, V/cm und Dauer) in Abhängigkeit von der erwarteten Größe der PCR-Produkte an.</li>
	<li>Verwenden Sie die Ergebnisse von PCR in Bezug auf die Größe und Anwesenheit/Abwesenheit von PCR-Produkten, um jedem embryonalen Embryo nach der Operation einen Genotyp zuzuweisen. Wenn z. B. von verschiedenen Allelen erwartet wird, dass pcR-Produkte unterschiedlicher Größe erzeugt werden, verwenden Sie die Größeninformationen, um den Genotyp für jeden Embryo zuzuweisen. Wenn allelespezifische Primer verwendet werden, sollten die Daten über das Vorhandensein/Fehlen von PCR-Produkten verwendet werden, um jedem Embryo einen Genotyp zuzuweisen.</li>
	<li>Sortieren Sie Embryonen nach Genotyp.</li>
</ol>

<ol><li>Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+hypotheses+of+basal+animal+phylogeny+using+complete+sequences+of+large+and+small+subunit+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).</li>
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<li>He, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377(2018).</li>
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<li>Servetnick, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-mediated+excision+of+Nematostella+brachyury+disrupts+endoderm+development%2C+pharynx+formation+and+oral-aboral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning.</a> Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).</li>
<li>Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-bilaterian+origin+of+the+blastoporal+axial+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer.</a> Nature Communications. 7, 11694(2016).</li>
<li>Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+axis+specification+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).</li>
<li>Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+developmental+potential+along+the+animal-vegetal+axis+in+the+anthozoan+cnidarian%2C+Nematostella+vectensis%2C+is+mediated+by+Dishevelled%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled.</a> Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).</li>
<li>Shinzato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Acropora+digitifera+genome+to+understand+coral+responses+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change.</a> Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).</li>
<li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+jellyfish+Aurelia+and+the+evolution+of+animal+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity.</a> Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).</li>
<li>Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+a+reef-building+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).</li>
<li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+doses+of+CRISPR%2FCas9+ribonucleoprotein+efficiently+induce+gene+knockout+with+low+mosaicism+in+the+hydrozoan+Clytia+hemisphaerica+through+microhomology-mediated+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion.</a> Scientific Reports. 8, 11734(2018).</li>
<li>Artigas, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gonad-expressed+opsin+mediates+light-induced+spawning+in+the+jellyfish+Clytia%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia.</a> eLife. 7, e29555(2018).</li>
</ol>

Der Autor hat nichts zu verraten.

Beschrieben hier ein PCR-basiertes Protokoll, um einen einzelnen Seeanemonen-Embryo zu genotypisieren, ohne das Tier zu opfern. Nach dem Laichen und Entgelten dürfen sich die befruchteten Eier zu Gastrulae entwickeln. Die aborale Region jedes Gastorula-Embryos wird operativ entfernt, und das isolierte Aboralgewebe wird für die nachfolgende genomische DNA-Extraktion verwendet, während die verbleibenden postoperativen Embryonen heilen und die Entwicklung fortsetzen. Die gDNA-Extrakte werden dann für einen PCR-Test verwende...

Die Cnidarians repräsentieren eine vielfältige Gruppe von Tieren, die Quallen, Korallen und Seeanemonen umfassen. Es handelt sich um Diploblasten, die aus Ektoderm und Endoderm bestehen und durch eine extrazelluläre Matrix (Mesoglea) getrennt sind. Cnidaria ist eine Schwestergruppe zur Speziiose Bilateria, zu der traditionelle Tiermodelle wie Drosophila und Mus gehören1. Zusätzlich wird angenommen, dass die Divergenz Cnidaria-Bilateria in der vorkambrischen Periode2aufgetreten ist. Als solche sind vergleichende Studien an Cnidarians und Bilaterianern unerlässlich, um Einblicke in die Biologie ihres jüngsten gemeinsamen Vorfahren zu gewinnen. Kürzlich hat die vergleichende Genomik gezeigt, dass Cnidarians und Bilaterianer viele Entwicklungs-Toolkit-Gene wie Kerb und bHLH teilen, was impliziert, dass ihr gemeinsamer Vorfahrbereitsen diese Gene hatte3. Die Rolle dieser Entwicklungs-Toolkit-Gene im letzten gemeinsamen Vorfahren von Cnidaria und Bilateria ist jedoch vergleichsweise weniger gut verstanden. Um dieses Problem anzugehen, ist es wichtig zu untersuchen, wie diese tief konservierten Gene bei Cnidarians funktionieren.
Eines der aufkommenden cnidarian genetischen Modelle ist die anthozoanE Nematostella vectensis. Sein Genom wurde3sequenziert, und eine Vielzahl von genetischen Werkzeugen, einschließlich Morpholino-vermittelter Genknockdown, Meganuklease-vermittelte Transgenese und CRISPR-Cas9-vermittelte Genknockins und Knockouts, sind jetzt für den Einsatz in diesem Tier verfügbar. Darüber hinaus ist die Nematostella-Entwicklung relativ gut verstanden. Während der Embryogenese tritt die Gastrulation durch Invagination4auf und der Embryo entwickelt sich zu einer freischwimmenden Planulalarve. Die Planula verwandelt sich anschließend in einen sessilen Polypen mit Mund und umlaufenden Tentakeln. Der Polypen wächst dann und erreicht die Geschlechtsreife.
CRISPR-Cas9-vermittelte gezielte Mutagenese wird jetzt routinemäßig verwendet, um die Genfunktion in Nematostella vectensis5,6,7,8,9zu untersuchen. Zur Erzeugung von Knockout-Mutanten in Nematostellawird ein Cocktail mit lokusspezifischen Ein-Guide-RNAs und dem Endonuklease-Cas9-Protein zunächst in unbefruchtete oder befruchtete Eier injiziert, um F0-Gründertiere zu produzieren, die typischerweise Mosaik. F0-Tiere werden anschließend zur Geschlechtsreife erhoben und miteinander gekreuzt, um eine F1-Population zu erzeugen, von denen eine Teilmenge Knockout-Mutanten6sein kann. Alternativ können geschlechtsreife F0-Tiere mit Wildtieren gekreuzt werden, um F1-Heterozygoten zu erzeugen, und F1-Heterozygoten, die ein Knockout-Allel im Ort des Interesses tragen, können dann miteinander gekreuzt werden, um F2-Nachkommen zu produzieren, ein Viertel von denen erwartet werden, knockout mutants5sein. Beide Ansätze erfordern eine Methode zur Identifizierung von Knockout-Mutanten aus einer genetisch heterogenen Population. Polyp Tentakel können verwendet werden, um genomische DNA für genotypisieren6,7zu extrahieren. In Fällen, in denen die Entwicklungsfunktion des Gens untersucht wird und mutierte Embryonen das Polypenstadium nicht erreichen (d. h. aufgrund der mit der Mutation verbundenen Larventoalität), müssen Knockout-Mutanten früh in der Ontogenidentifizierten identifiziert werden. Hier wird ein PCR-basiertes Protokoll beschrieben, um einzelne Tiere im Gastrulastadium zu genotypisieren, ohne das Tier zu opfern, was die Identifizierung von Knockout-Mutanten aus einer genetisch heterogenen Population von Embryonen ermöglicht. Die Dauer des gesamten Genotypisierungsprozesses hängt von der Anzahl der zu gesiebenden Embryonen ab, erfordert aber minimal 4-5 h.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Peltier Kühlbrutkasten</td><td>Shellab</td><td>SRI6PF</td><td>Wird für die Laichinduktion verwendet</td></tr><tr><td>Instant ocean meersalz</td><td>Instant ocean</td><td>138510</td><td></td></tr><tr><td>Salinengarnelenzysten</td><td>Aquatic Eco-Systems, Inc.</td><td>BS90</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteinhydrochlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Standard Orbital Shaker, Modell 3500</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCl, 1M, pH8.0</td><td>QUALITÄT BIOLOGISCH</td><td>351-007-01</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>VWR</td><td>BDH9258</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5M pH8</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40 Ersatz</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Lösung (20 mg/ml),</td><td>RNA-Qualität ThermoFisher</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>710</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präpariernadelhalter</td><td>Roboz</td><td>RS-6060</td><td></td></tr><tr><td>Wolfram-Präpariernadel</td><td>Roboz</td><td>RS-6063</td><td></td></tr><tr><td>PCR Eppendorf Mastercycler Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>E6336000024</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>GLWamide universal forward primer</td><td></td><td></td><td>5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3'</td></tr><tr><td>Reverse Primer speziell für glw-a</td><td></td><td></td><td>5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3"</td></tr><tr><td>Reverse Primer spezifisch für glw-c </td><td></td><td></td><td>5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3'</td></tr></tbody></table>

genotypisierung von sea anemone während der frühen entwicklung

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Beschrieben ist hier ein PCR-basiertes Protokoll, um den Gastorula-Stadium-Embryo des anthozoischen cnidären Nematostella vectensis zu genotypisieren, ohne das Leben des Tieres zu opfern. Nach In-vitro-Fertilisation und Enthaarung dürfen sich Zygoten für 24 h bei Raumtemperatur entwickeln, um das Früh- bis Mittelgastrulastadium zu erreichen. Die Gastorula-Embryonen werden dann auf einem Agarose-Gelbett in einer Petrischale mit Meerwasser platziert. Unter dem Sezieren des Mikroskops wird eine Wolframnadel verwendet, um ein Aboralgewebefragment von jedem Embryo operativ zu trennen. Embryonen nach der Operation dürfen dann heilen und weiterentwickelt werden. Genomische DNA wird aus dem isolierten Gewebefragment extrahiert und als Vorlage für die ortsspezifische PCR verwendet. Der Genotyp kann anhand der Größe von PCR-Produkten oder des Vorhandenseins/Fehlens von allelespezifischen PCR-Produkten bestimmt werden. Nachderinwerden von Embryonen wird dann nach dem Genotyp sortiert. Die Dauer des gesamten Genotypisierungsprozesses hängt von der Anzahl der zu gescreenen Embryonen ab, erfordert aber minimal 4–5 h. Diese Methode kann verwendet werden, um Knockout-Mutanten aus einer genetisch heterogenen Population von Embryonen zu identifizieren und ermöglicht Analysen von Phänotypen während der Entwicklung.

Das Nematostella-Genom hat einen einzigen Ort, der ein Vorläuferprotein für das Neuropeptid GLWamid kodiert. Drei Knockout-Mutant-Allele an diesem Ort (glw-a, glw-bund glw-c) wurden bereits 5 gemeldet. Vier heterozygote Männchen, die ein Wild-Typ-Allel (+) und Knockout-Allel-Glw -cam GLWamide-Lokus (Genotyp: +/glw-c)trugen, wurden mit einem heterozygoten Weibchen gek...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Meeresanemone Nematostella vectensis während der Gastrulation zu genotypisieren, ohne den Embryo zu opfern.

Genotypisierung von Sea Anemone während der frühen Entwicklung

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Dieses Protokoll ermöglicht es einem Forscher, mutierte Seeanemonen während der frühen Embryogenese zu identifizieren, so dass der phänotype postembryonale Entwicklung analysiert werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie verwendet werden kann, um einzelne Seeanemonen früh in der Ontogenie zu georten, ohne das Leben des Tieres zu opfern. Die Demonstration dieses Verfahrens wird Miguel Silva sein, ein Student aus meinem Labor.Am Tag vor der Laichinduktion die Anemone nematostella vectensis in einen temperatur- und lichtgesteuerten Inkubator geben und den Inkubator so programmieren, dass die Tiere acht Stunden Licht bei 25 Grad Celsius ausgesetzt sind. Entfernen Sie am nächsten Tag die Tiere aus dem Brutkasten und lassen Sie sie bei Raumtemperatur auf einer Bankplatte, wenn das Licht eingeschaltet ist, um das Laichen zu ermöglichen, das innerhalb der folgenden eineinhalb bis zwei Stunden auftreten wird. Verwenden Sie eine Transferpipette, deren Spitze geschnitten wird, um die Öffnung zu vergrößern, um Eipakete aus dem weiblichen Behälter in einen spermahaltigen männlichen Behälter zu legen und sie für mindestens 15 Minuten im männlichen Behälter zu lassen, um eine Befruchtung zu ermöglichen.Nach der Befruchtung, um die Ei-Pakete zu entjelly, legen Sie sie in Meerwasser mit 3%Cystein auf einem Glas Petrischale und sanft auf einem Shaker für 12 Minuten rühren. Dann brechen Klumpen mit einer Plastikpipette und weiter für weitere zwei bis drei Minuten zu agitieren, bis vollständig dejellied. Bewahren Sie die befruchteten Eier auf der gleichen Schale bei 16 Grad Celsius oder bei Raumtemperatur auf.Am nächsten Tag bereiten Sie DEN DNA-Extraktionspuffer wie im Manuskript beschrieben vor, mischen Sie sie gut durch Wirbel nieren und aliquotieren Sie sie in PCR-Röhren, indem Sie 20 Mikroliter zu jeder Röhre hinzufügen. 1%Agarose im Meerwasser auflösen, in eine Petrischale gießen, um den Boden zu bedecken, und auf einer Bankplatte abkühlen, um ein Gelbett zu machen. Bedecken Sie das Gelbett mit frischem Meerwasser.24-Stunden-Embryonen nach der Befruchtung mit einer Pipette in die agarosegelbetthaltige Petrischale übertragen. Legen Sie eine Wolframnadel in einen Bedarfshalter und sterilisieren, indem Sie ihre Spitze in Alkohol tauchen und setzen Sie es in Flammen, um den Alkohol zu verbrennen. Unter einem Sezieren Mikroskop, machen Eine Depression auf der Agarose, indem Sie die Wolframnadel verwenden, um ein Stück Oberflächen-Agarose über die Größe eines zu manipulierenden Embryos zu entfernen.Dann, mit der Wolfram-Nadel, legen Sie den Embryo in die Depression mit seiner seitlichen Seite nach unten, um die Bewegung des Embryos für die Mikrochirurgie zu beschränken. Um eine erfolgreiche Operation durchzuführen, ist es wichtig, die Bewegung des Embryos zu beschränken. Mit der Wolframnadel, chirurgische entfernen Sie ein Stück Aboralgewebe entlang der oralen Aboralachse, gegenüber der oralen blastoporalen Öffnung.Mit einer P20-Pipette das isolierte Abbruchgewebe in eine PCR-Röhre mit 20 Mikroliter DNA-Extraktionspuffer übertragen. Übertragen Sie den embryonalen Embryo nach der Operation in einen Brunnen einer 24-Well-Platte, die mindestens 500 Mikroliter frisches Meerwasser enthält. Und legen Sie die Platte mit post-chirurgischen Embryonen in einem Inkubator bei 16 Grad Celsius, bis die Genotypisierung abgeschlossen ist.Um genomische DNA aus einzelnen Embryonen zu extrahieren, drehen Sie zunächst die PCR-Röhren, die den DNA-Extraktionspuffer und isolierte embryonale Gewebe enthalten, mit einer Minizentrifuge kurz herunter. Dann inkubieren Sie die Rohre bei 55 Grad Celsius für drei Stunden, während Wirbel für 30 Sekunden alle 30 Minuten, um das Aufbrechen von Zellklumpen zu gewährleisten und die Zelllyse zu verbessern. Nach der Inaktivierung der Proteinase K bei 95 Grad Celsius für vier Minuten, richten Sie eine PCR-Reaktion mit extrahierter genomischer DNA als Vorlage ein, um den Ort des Interesses zu verstärken.Design gewünschte Primer, wie im Manuskript beschrieben. Richten Sie eine 20-Mikroliter-PCR-Reaktion ein. Führen Sie nach Abschluss der PCR eine Agarose-Gel-Elektrophorese durch, um die Größe und das Vorhandensein oder Fehlen von PCR-Produkten zu bestimmen, und stellen Sie sicher, dass der Zustand der Agarose-Gel-Elektrophorese in Abhängigkeit von der erwarteten Größe der PCR-Produkte angepasst wird.Verwenden Sie PCR-Ergebnisse in Bezug auf Größe und Anwesenheit oder Abwesenheit oder PCR-Produkte, um jedem postoperativen Embryo einen Genotyp zuzuweisen und dann Embryonen nach ihrem Genotyp zu sortieren. Das Nematostella-Genom hat einen einzigen Ort, der ein Vorläuferprotein für das Neuropeptid GLWamid kodiert. Drei Knockout-Mutant-Allele am Ort des Ortes wurden bereits gemeldet.PCR-Ergebnisse von zufällig beprobten Embryonen unter der Nachkommenschaft einer F1-Kreuzung zwischen einem heterozygoten Weibchen, das ein A-Knockout-Allel trägt, und heterozygoten Männchen, die ein C-Knockout-Allel tragen, zeigen verschiedene Genotypen. Embryonen eins und zwei zeigen ein einziges PCR-Band, das der erwarteten Größe von A Knockout Allel entspricht. Embryonen drei und sechs zeigen zwei PCR-Bänder mit den erwarteten Größen für die Knockout-Allele A und C.Embryos vier, sieben und acht zeigen ein einzelnes PCR-Band, das der erwarteten Größe des C-Knockout-Alleels entspricht.Embryo 5 zeigt keine Bänder, was auf den Mangel an Primerbindung hindeutet. Um die Möglichkeit eines genomischen DNA-Extraktionsversagens auszuschließen, wurde eine andere PCR mit einem Reverse Primer ausgeführt, der an die Wildtypsequenz binden kann. Wenn ein PCR-Produkt von der erwarteten Größe nachgewiesen wurde, war die genomische DNA-Extraktion erfolgreich.Während kein Produkt auf einen Fehler bei der Extraktion hindeutete. Obwohl dieses Protokoll für Seeanemonen-Embryonen konzipiert ist, ist es sicher möglich, diese Methode auf andere Cnidarians anzuwenden, wie Korallen und Quallen, wo genomische Informationen und Embryonen zugänglich sind. Nach diesem Verfahren werden die identifizierten Mutanten verwendet, um den Entwicklungsphänotyp zu bewerten.Zum Beispiel können histologische Techniken wie Dieimmunostainierung verwendet werden, um Defekte in der Morphologie zu bewerten, während In-situ-Hybridisierung, quantitative RT-PCR in Echtzeit und RNA-seq zur Beurteilung von Defekten in der Genexpression verwendet werden können. Auch live Bildgebung kann verwendet werden, um Verhaltensmängel während der post-embryonalen Entwicklung zu bewerten, wie bei Larven oder in frühen Polypen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Methoden, die morphanten Embryonen sind unerlässlich, um Entwicklungsmechanismen und Gen-regulatorische Netzwerke zu studieren. Das Sea Star Patiria miniata ist ein aufstrebendes Modellsystem für diese Studien. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Erhalt von Gameten erzeugende Kulturen von Embryonen und schnelle Mikroinjektion von Zygoten von dieser Spezies.

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