Name: Generation von Organellen von Maus extrahepatische Gallenwege (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Organellen aus dem extrahepatischen Gallengang der Maus zur Untersuchung von Cholangiozytenbiologie und Zellinteraktionen. Dieses reproduzierbare Modell ermöglicht kosteneffiziente Forschung an adultem Gewebe.

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Diese Arbeit wurde von der American Association für die Studie der Leber Krankheiten Pinnacle Award (n.r.) und die National Institutes of Health, National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Nieren-Erkrankungen (awards P30 DK34933, n.r., P01 DK062041, J.L.M.) unterstützt. Wir danken Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) für seine Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of Michigan genehmigt.
1. Vorbereitung der Ausrüstung und Materialien für die Maus EHBD Isolierung
<ol><li>Bereiten Sie seeding Medium und waschen Puffer (Table of Materials) in 50 mL konische Röhrchen vor und halten sie bei 4 ° C oder auf Eis bis zur Verwendung.</li>
	<li>Richten Sie eine OP-Tisch (Abb. 1 b). Bereiten Sie sterilisierte chirurgische Instrumenten (Abbildung 1).</li>
	<li>Legen Sie eine sterile 24-Well-Platte im 37 ° C Gewebekultur Inkubator, es Vorwärmen.</li>
	<li>Legen Sie eine aliquote Keller Matrix auf Eis. Verwenden Sie Keller Matrix nur, wenn es vollständig verflüssigt ist.</li>
</ol>2. EHBD Isolation und biliären organoide Kultur
<ol><li>
Isolation und Vorbereitung einer einzelnen Zelle Aussetzung der Maus EHBD
	<ol>
<li>Einschläfern Sie Erwachsenen Mäuse (älter als 2 Monate) nach den institutionellen Richtlinien. Platzieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage. Öffnen der Bauchhöhle mit einer Mittellinie Ansatz aus- und Einfahren der Leber auf das Zwerchfell.</li>
		<li>Der Gallengang befindet sich unmittelbar unterhalb der Leber Hilum durch leichtes Ziehen der proximale Duodenum mit einer Gefäßklemme zu identifizieren. Das umliegende Gewebe mit einer Skalpellklinge trennen Sie EHBD. Halten Sie das proximale Ende der Choledochus mit Zangen, distal oberhalb der Stelle mit den Zwölffingerdarm zu sezieren Sie, dann sezieren Sie das proximale Ende des Kanals aus der Leber (Abbildung 1). Legen Sie sofort isolierte EHBD (Abbildung 1E) in kalten Waschpuffer.</li>
		<li>Entfernen Sie die EHBD aus dem Puffer waschen und in 0,5 mm-Abschnitte mit einem sterilen Skalpellklinge Blatt vor den Mund. Legen Sie das Gewebe auf einer Glasplatte auf dem Eis während des Verfahrens (Abbildung 1 b).</li>
		<li>Legen Sie die EHBD Abschnitte in ein Röhrchen mit 500 µL des Puffers Dissoziation. 20 min bei 37 ° c inkubieren Neutralisieren Sie die Dissoziation Puffer durch Zugabe von 500 µL eiskalte Zellkulturmedium.</li>
		<li>Genannte die Zellsuspension nach oben und unten durch 18 G und 20 G Nadeln, jeweils 20 Mal voran. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 µm Zelle Sieb und sammeln Sie der Durchfluss in einem 50 mL-Tube. Hinweis: Pre-Zustand das Sieb mit 500 µL steriler Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor der Filterung, um den Durchgang von der Zellsuspension zu erleichtern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aufbau EHBD Organellen
	<ol>
<li>Zentrifuge die Durchströmung von Schritt 2.1.5 bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig den überstand. Die Zellen in 1 mL eiskaltes sterile PBS aufzuwirbeln. Übertragen Sie die Wiederfreisetzung in eine neue 1,5 mL Tube. Wiederholen Sie Schritt 2.2.1.</li>
		<li>Entfernen Sie nach Zentrifugation vorsichtig den Überstand aus gewaschenen Zellen am unteren Rohr gesammelt. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 120 µL des verflüssigten eiskalten Keller Matrix durch nach oben und unten mit P200 Tipps pipettieren. Hinweis: Zelle Pellet Wiederfreisetzung im Keller Matrix hat auf Eis-Bad durchgeführt werden.</li>
		<li>Platte 40 µL der Zelle Wiederfreisetzung im Keller-Matrix in die Mitte eines Brunnens in eine vorgewärmte 24-Well-Platte. Hinweis: Vermeiden Sie Absaugen von Luft beim Bearbeiten von Keller-Matrix, um Blasenbildung zu vermeiden.</li>
		<li>Die Platte mit Zellen im Keller Matrix in den 37 ° C Gewebekultur Inkubator für 15 Minuten oder bis Keller Matrix verfestigt Nukleinsäuretablette zurück. Fügen Sie 600 µL des Mediums Aussaat in jede Vertiefung (Table of Materials) bis zu 37 ° C erwärmt. Die Platte in der Gewebekultur Inkubator 37 ° C zurück.</li>
		<li>Ersetzen Sie die Aussaat Medium mit 600 µL des Kulturmediums frische organoide in 3 Tagen und danach alle 3 Tage. Organoide Wachstum mit einem inversen Mikroskop zu überwachen. Verwendung Organellen für eine nachgeschaltete Anwendung oder Split alle 7 bis 9 Tage vor der Anhäufung von Schutt und organoide Zusammenbruch Intraluminal eingehalten werden (Abbildung 2A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EHBD organoide Passage und Lagerung
<ol><li>
Durchgang von EHBD Organellen 1:3 bis 1:4 alle 7 bis 9 Tage
	<ol>
<li>Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen und fügen Sie 400 µL eiskaltem PBS hinzu. Aufschwemmen der Organellen durch sanft Pipettieren das Gemisch nach oben und unten 10 Mal in den Brunnen. Übertragen Sie die Mischung auf eine 1,5 mL-Tube.</li>
		<li>Passage der Mischung durch eine 25 G Nadel 4 Mal um die Organellen zu distanzieren. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 400 X g für 4 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und Aufschwemmen der Zellen im Keller Matrix (1:3 bis 1:4) für die weitere Kultivierung (Schritt 2.2.4.) oder Waschen der Zellen mit Eis kaltem PBS zur Weiterverarbeitung. Hinweis: 250-300 Zellen sind in der Regel in der 24-Well-Platte für downstream-Anwendungen beschichtet. Plattieren Effizienz kann durch Hellfeld Mikroskopieren mit einem inversen Mikroskop am Tag 3-5 Nach Passagierung durch das zählen der Organellen und berechnen ihre Prozent aus anfänglichen Zellzahl ausgewertet werden. mRNA kann von EHBDOs waschen mit PBS-Puffer über das standard-Protokoll über Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Langzeitlagerung von EHBD Organellen
	<ol>
<li>Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen und waschen Sie die Organellen mit Raumtemperatur PBS. PBS aus dem Brunnen zu entfernen, ohne zu stören den Keller Matrix Tropfen.</li>
		<li>Fügen Sie 500 µL eiskalte Zelle Einfrieren Medium zum Brunnen. Sanft Aufschwemmen der Organellen in verflüssigtem Keller Matrix und Zelle Einfrieren Medium und übertragen Sie die Mischung in kryogenen Fläschchen.</li>
		<li>Speichern Sie den Fläschchen bei-80 ° C für 48 h Transfer die Fläschchen mit einem Stickstofftank für die langfristige Lagerung in einer Dampfphase.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EHBD organoide Pprocessing für die Einbettung von Paraffin
<ol><li>Die EHBDOs in 500 µL eiskaltem PBS (4 ° C) durch pipettieren und ab 5 bis 10 Mal aufzuwirbeln. Sammeln Sie resuspendierte EHBDO in verflüssigtem Keller Matrix in eine 1,5 mL-Tube. Hinweis: Um zu vermeiden, brechen Organellen, unten ca. 2-3 mm ein P1000-Tip abgeschnitten und den Überstand vorsichtig zu entfernen.</li>
	<li>Zentrifuge EHBD Organellen bei 350 X g für 5 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne störende organoide Pellet.</li>
	<li>Die Organellen 1 mL eiskaltes 4 % Paraformaldehyd (PFA) hinzu und inkubieren die Organellen in 4 % PFA über Nacht bei 4° c Entfernen Sie die 4 % PFA von Organellen, die mit einer P1000-Spitze nach der Inkubation über Nacht.</li>
	<li>Das Rohr mit der Organellen 1000 µL der Raumtemperatur PBS hinzufügen und 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Zentrifugieren Sie dem Rohr mit Organellen mit PBS-Puffer bei 350 X g für 5 min. Wiederholen dieses Prozesses zwei weitere Male.</li>
	<li>Entfernen Sie PBS zu und fügen Sie 1 mL 30 % Ethanol zu den Organellen. 5 min bei RT inkubieren</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 350 X g für 5 min bei RT. Entfernen Sie 30 % Ethanol. 1 mL 70 % igem Ethanol zugeben und 5 min bei RT inkubieren</li>
	<li>Entmischen bei 350 X g für 5 min. entfernen 70 % Ethanol. Fügen Sie 1 mL 100 % Ethanol und 5 min bei RT inkubieren Hinweis: Organellen können in 100 % igem Ethanol bei Raumtemperatur für bis zu 48 h vor der Weiterverarbeitung aufzubewahren.</li>
	<li>Erhitzen Sie Probe Verarbeitung Gel in einer Mikrowelle für 20 s oder bis verflüssigt. Fügen Sie 50 µL der Probe Verarbeitung Gel in das Rohr mit Organellen. Legen Sie das Rohr auf Eis, bis die Probe Verarbeitung Gel verfestigt wird.</li>
	<li>Entfernen Sie die Tropfen der Probe Verarbeitung Gel mit Organellen aus der Tube und zwischen die blauen Schaumstoffpatrone in einer Kassette zur Weiterverarbeitung in der Gewebe-Prozessor. Verwenden Sie 15 Minuten für jeden Schritt im Paraffin-Embedder, bei der Weiterverarbeitung...</li>
	<li>Abschnitt Paraffin-eingebetteten Organellen in Probe Verarbeitung gel bei 4 µm. fortfahren mit immunhistochemischen Färbung als zuvor beschriebenen16.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.

Diese Arbeit beschreibt die Generation eine organotypischen 3-dimensionales Modell der Maus EHBD Cholangiocytes. Wichtige Schritte zur EHBDO Kultur Generation gehören sorgfältige EHBD Dissektion zur Vermeidung von Bauchspeicheldrüse Zelle Kontamination, Wartung von sterilen Bedingungen gegen Bakterien- und Pilzinfektionen Kontamination und sorgfältige Manipulation nach der Zentrifugierung zu vermeiden die Verlust von Zellmaterial. Eine enge Einhaltung der beschriebenen Temperaturbedingungen ist erforderlich. Es gibt eini...

Cholangiopathies sind unheilbare chronische progressive Störungen, die biliären Zellen in Intra- und extrahepatische Gallenwege Kanäle (EHBDs)1betreffen. Einige Cholangiopathies, wie primäre sklerosierende Cholangitis, Gallengangskarzinom und biliären Atresie Choledochal Zysten betreffen überwiegend EHBDs. Entwicklung von Therapien für Cholangiopathies ist durch die begrenzte Verfügbarkeit von präklinischen Modellen eingeschränkt. Darüber hinaus früheren Studien konzentrierten sich auf Cholangiopathies zusammengefasst: Leber, Intra- und EHBDs. Allerdings Intra- und EHBDs haben einen ausgeprägten embryonalen Ursprung, und gilt somit als unterschiedliche molekulare Pathologien. Intrahepatischen Gallenwege entwickeln sich aus den intrahepatischen duktalen Platten und der kranialen Teil der hepatischen Divertikel, ganze EHBDs zu entwickeln, aus dem kaudalen Teil des hepatischen Divertikel2. Sie verlassen sich auch auf verschiedene Vorläuferzellen Zelle Fächer für Erwachsene Homöostase, einschließlich Kanäle von Hering in intrahepatischen Gallenwege und Peribiliary Drüsen im EHBDs2,3. Verwendung von Tiermodellen für präklinische Studien wird durch Kosten begrenzt und aus ethischen Gründen minimiert werden. Reduktionistische, reproduzierbare, Zeit und Kosten sparende in-vitro-Modelle sind daher sehr wünschenswert.
Die meisten frühere Studien von Cholangiopathies verwendete normale Maus oder Ratte Krebs Modelle oder menschlichen Gallengangskarzinom Zelllinien aus intra- und EHBDs4,5,6,7. Aber diese sind Modelle der transformierten Zellen und nicht normal Cholangiocyte Biologie Homöostase oder in einem gesunden Zustand rekapitulieren. Jüngste Fortschritte in der Entwicklung von organotypischen Kultur Modellen ermöglichte die Entwicklung von 3-dimensionalen Strukturen aus verschiedenen Gewebetypen, einschließlich Artischockenblättern Gewebe, obwohl nicht normale Maus EHBDs8,9, 10. Diese "Orgel-ähnlichen" Strukturen abzielen, primäre Gewebe imitiert und in eine künstliche Nische Unterstützung Selbsterneuerung der Organ-spezifischen Stamm/Stammvater Zellen11angebaut.
"Organoide" ist ein breiter Begriff, der meisten allgemein beschreibt 3-dimensionale Gewebemodelle Stammzellen abgeleitet. Organellen können aus umprogrammiert pluripotenten generiert werden Stammzellen vertreten durch embryonale Stammzellen und induzierte pluripotente Stammzellen. Sie können auch aus adulten Stammzellen organspezifischen12generiert werden. Einige Cholangiocyte organoide Modelle wurden in früheren Studien vorgeschlagen. So, Organellen, die von menschlicher pluripotenter Stammzellen abgeleitet wurden berichteten7,9,13 und sind wertvoll, Zeit effiziente Tools, die für die gleichzeitige Erzeugung von verschiedenen Zelltypen ermöglicht. Diese pluripotenten Stammzelle-derived Organellen spiegeln jedoch nicht vollständig die Struktur und Funktionalität der primären adult EHBD Cholangiocytes.
Organellen von adulten Stammzellen des menschlichen9 abgeleitet und feline10 Leber wurden auch vorgeschlagen. Feline Modelle sind nicht weit verbreitet und haben begrenzte Tool Rüstzeug zu Studienzwecken. Darüber hinaus können diese Leber abgeleitet adulten Stem Cell-derived Organellen nicht extrahepatische Cholangiocytes aber eher intrahepatischen Cholangiocytes modellieren.
EHBD organoide Generation wurde von menschlichen normal EHBDs14 und Maus EHBD Gallengangskarzinom15berichtet. Allerdings Zugang zu menschlichen EHBD Gewebe ist äußerst begrenzt, und Organellen, abgeleitet von einer genetischen Mausmodell Gallengangskarzinom15 repräsentieren nicht gesund Cholangiocyte Biologie an der Homöostase und genetisch veränderten Zellen abgeleitet sind.
Um die Grenzen der pluripotenten Stammzelle - und Leber-derived Cholangiocyte organoide Modelle und des eingeschränkten Zugangs zu menschlichem Gewebe benötigt in präklinischen Modellen zu begegnen, haben wir ein EHBD organoide Mausmodell (Abbildung 1A) entwickelt. Dieses Manuskript beschreibt die Entwicklung einer Technik für Maus EHBD-abgeleitete Organellen von Erwachsenen Gewebe. Diese EHBD Organellen benannt EHBDOs werden in-vitro-Instrument für die Untersuchung der Mechanismen, die EHBDs Cholangiocyte Homöostase und Krankheit Prozesse, z. B. Cholangiopathies.

<table><tbody><tr><td><stark>L-WRN Zellkulturmedium</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>1%</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>100 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td><stark>Waschpuffer</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>50 mL</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>125 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Amphotericin B&nbsp;</td><td>6,25 & Mikro; g/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15290-018</td></tr><tr><td>Organoid-Nährmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-WRN Konditioniertes Medium&nbsp;</td><td>1:1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>1:1</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>N-Glutamin</td><td>10 & Mikro; l/mL</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td></tr><tr><td>N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure, HEPES</td><td>10 mM</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td></tr><tr><td>B27</td><td>10 & Mikro; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td></tr><tr><td>N2</td><td>10 &micro; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td></tr><tr><td>Organoid-Aussaatmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Organoid-Nährmedium&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)50</td> <td>ng/ml</td>, <td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td></tr><tr><td>Fibroblasten-Wachstumsfaktor-10 (FGF10)</td><td>100 ng/ml</td>, <td>PeproTech</td><td>100-26</td></tr><tr><td>Primäre Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 19 (CK19) Antikörper, Kaninchen</td><td>1:250</td>, <td>Abcam</td><td>ab53119</td></tr><tr><td>Geschlechtsbestimmende Region Y-Box 9 (SOX9) Antikörper, Kaninchen</td><td>1:200</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20095</td></tr><tr><td>Pankreas Duodenal Homeobox 1 (PDX1) Antikörper, Kaninchen</td><td>1:2000</td><td>DSRB</td><td>F109-D12</td></tr><tr><td>E-Cadherin Antikörper, Ziege</td><td>1:500</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-31020</td></tr><tr><td>Acetylierter &alpha;-Tubulin Antikörper, Maus</td><td>1:500</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td></tr><tr><td>Sekundärantikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 markiertes Anti-Kaninchen, Esel IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td></tr><tr><td>594 markiertes Anti-Ziegen, Esel IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11058</td></tr><tr><td>568 markiertes Anti-Maus, Ziege IgG2b</td><td>1:500</td><td>Invitrogen</td><td>A-21144</td></tr><tr><td>TopFlash Wnt Reporter Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><stark>TopFlash HEK293 Zelllinie</td><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td></tr><tr><td>Luciferase Assay Kit</td><td></td><td>Biotium</td><td>30003-2</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td></tr><tr><td>0,4 % Trypanblau Lösung</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td></tr><tr><td>Zusätzliche Materialien und Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basement Matrix, phenolfreies Matrigel</td><td></td><td>CORNING</td><td>356237</td></tr><tr><td>Dissoziationspuffer, Accutase</td><td></td><td>Gibco</td><td>A1110501</td></tr><tr><td>Zellkultur-Gefriermedium, Recovery</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12648010</td></tr><tr><td>Zellsieb (70 & Mikro; m, steril)</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td></tr><tr><td>Guanidiniumthiocyanat-Phenol-RNA-Extraktion, TRIzol</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td></tr><tr><td>Gel für die Probenverarbeitung, HistoGel</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td></tr><tr><td>Universelles Mykoplasmen-Nachweiskit</td><td></td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td></td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7524</td></tr><tr><td>50 mL konisches Zentrifugenröhrchen</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td></td><td>Nikon</td><td>Eclipse E800</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td></td><td>Biotium</td><td>30003-2</td></tr><tr><td>Autopsie-Tablett</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>13-814-61</td></tr></tbody></table>

generation von organellen von maus extrahepatische gallenwege

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, die extrahepatische Gallengänge (EHBDs) beeinflussen, gehören biliären Atresie, Primär sklerosierende Cholangitis und Gallengangskarzinom. Sie haben keine effektive therapeutische Optionen. Werkzeuge, um EHBD zu studieren, sind sehr begrenzt. Unser Ziel war es, eine Organ-spezifischen, vielseitig, Erwachsenen Stammzellen abgeleitet, präklinische Cholangiocyte Modell zu entwickeln, die leicht vom Wildtyp und gentechnisch veränderter Mäuse generiert werden können. So berichten wir über die neuartige Technik der Entwicklung eines EHBD organoide (EHBDO) Kultur von Erwachsenen Maus EHBDs. Das Modell ist kostengünstig, leicht analysiert werden, und hat mehrere downstream-Anwendungen. Im einzelnen beschreiben wir die Methodik der Maus EHBD Isolation und einzelne Zelle Dissoziation, organoide Kultur Einleitung, Fortpflanzung, und langfristige Wartung und Lagerung. Dieses Manuskript beschreibt auch EHBDO Verarbeitung für Immunohistochemistry, Fluoreszenz-Mikroskopie und mRNA Fülle Quantifizierung durch Echtzeit-quantitative reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR). Dieses Protokoll hat deutliche Vorteile neben der Produktion von EHBD-spezifische Organellen. Die Verwendung eines konditionierten Mediums aus L-WRN Zellen reduziert deutlich die Kosten für dieses Modell. Die Verwendung der Maus EHBDs bietet fast unbegrenzte Gewebe für Kultur-Generation, im Gegensatz zu menschlichem Gewebe. Generierte Maus EHBDOs enthalten eine reine Bevölkerung von Epithelzellen mit Markern der endodermische Stammvater und differenzierte biliären Zellen. Kultivierte Organellen homogene Morphologie durch mehrere Gänge zu erhalten und nach längerer für langfristige Lagerung in flüssigem Stickstoff gewonnen werden können. Das Modell ermöglicht die Untersuchung der Gallenwege Stammvater Zellproliferation, pharmakologisch manipuliert werden und kann aus gentechnisch veränderter Mäuse generiert werden. Zukünftige Studien werden benötigt zur Optimierung der Kulturbedingungen um Effizienzsteigerung Beschichtung, funktionale Zelle Reife und direkten Zell-Differenzierung zu bewerten. Entwicklung von Kokulturen Modellen und einer mehr biologisch neutral extrazelluläre Matrix sind ebenfalls wünschenswert.

Unser Protokoll beschreibt die Generation der Maus EHBD Organellen, die gewebespezifische und Erwachsenen Stammzellen abgeleitet sind. Nachdem die Organellen kultiviert werden, kann eine zystische Struktur Formation bereits 1 Tag nach der EHBD Isolation beobachtet werden. Kontamination mit Fibroblasten wird in der Regel nicht während Kultur Generation beobachtet. EHBDO Beschichtung Effizienz beträgt ca. 2 % Wenn Sie isoliert von Neugeborenen oder Erwachsenen (älter als 2 Monate) Mäuse (<s...

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Maus extrahepatische Gallenwege 3-dimensionale organoide Systems. Diese biliären Organellen können in Kultur Cholangiocyte Biologie gepflegt werden. Biliären Organellen express Marker der Stammvater und biliären Zellen und polarisierten epithelialen Zellen zusammengesetzt sind.

Generation von Organellen von Maus extrahepatische Gallenwege

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Dieses murine extrahepatische Gallengang-Organoidsystem kann den begrenzten Zugang zu präklinischen Cholangiopathienmodellen und die Grenzen von pluripotenten Stammzell- und Leber-abgeleiteten Cholangiocyten-Organoidmodellen adressieren. Unser Modell ist erwachsenengewebespezifisch, reduktionistisch, reproduzierbar und zeit- und kosteneffizient. Es wird für Laboratorien von besonderem Nutzen sein, die keinen Zugang zu menschlichen Geweben haben.Unsere Technik ermöglicht die Kultivierung einer nahezu unbegrenzten Anzahl von extrahepatischen Gallengangscholangiozyten, um die Geweberegeneration und Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen. Demonstriert wird das Verfahren von Junya Shiota, einem Post-Doc aus meinem Labor. Für intrahepatische GallengangIsolierung, legen Sie die erwachsene Maus in eine Supine-Position und öffnen Sie die Bauchhöhle entlang der Mittellinie.Ziehen Sie die Leber zurück, um auf dem Zwerchfell zu ruhen und verwenden Sie ein Hämostat, um das proximale Zwölffingerdarm sanft zu ziehen, um den gemeinsamen Gallengang direkt unter dem Leberhilum zu offenbaren. Verwenden Sie ein Skalpell, um den extrahepatischen Gallengang von den umgebenden Geweben zu trennen. Halten Sie das proximale Ende des gemeinsamen Gallengangs mit Zangen, sezieren Sie den Kanal distal direkt über seinem Punkt mit dem Zwölffingerdarm, bevor das proximale Ende des Kanals aus der Leber seziert wird.Den isolierten extrahepatischen Gallengang sofort in eine Glasplatte mit Kaltwaschpuffer auf Eis legen, dann den Gallengang aus dem umgebenden Gewebe reinigen und in 0,5-Millimeter-Abschnitte zerkleinern. Wenn das gesamte Gewebe gehackt wurde, übertragen Sie die Abschnitte in ein Rohr mit 500 Mikroliter Dissoziationspuffer für eine 20-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Neutralisieren Sie am Ende der Dissoziation den Puffer mit 500 Mikrolitere eiskaltem Zellkulturmedium und trituieren Sie die Gewebesuspension 20 Mal durch eine 18-Spur-Nadel und dann 20-mal durch eine 20-Spur-Nadel.Filtern Sie dann die resultierende Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Rohr. Um eine gallenförmige Organoidkultur zu etablieren, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter eiskalten, sterilen PBS wieder auf und übertragen Sie die Zellen für eine zweite Zentrifugation in ein 1,5-Milliliter-Rohr.Setzen Sie das gewaschene Pellet in 120 Mikrolitervergoldung, eiskalte Kellermatrix und Platte 40 Mikroliter Zellen in die Mitte von drei Brunnen einer 37 Grad Celsius erwärmten, 24-Well-Platte, dann legen Sie die Platte in einem 37 Grad Celsius Gewebekultur-Inkubator für etwa 15 Minuten. Wenn die Kellermatrix erstarrt ist, fügen Sie 600 Mikroliter 37 Grad Celsius Saatmedium zu jedem Brunnen hinzu, bevor Sie die Platte zum Inkubator zurückgeben. Ersetzen Sie nach drei Tagen und danach alle drei Tage das Aussaatmedium durch 600 Mikroliter frisches organoides Kulturmedium und überwachen Sie das Organoidwachstum regelmäßig mit einem invertierten Mikroskop.Um die extrahepatischen Gallengangskulturen zu durchdringen, pipette die Organoide in jedem Brunnen mit 400 Mikrolitere eiskaltem PBS 10 mal pro Brunnen, bevor der Brunneninhalt in einzelne 1,5-Milliliter-Röhren übertragen wird. Durcheine jede Mischung viermal durch eine 25-Spur-Nadel, um die Organoide zu dissoziieren und die Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. Setzen Sie dann die Zellen in der Kellermatrix mit dem entsprechenden Verhältnis für die Neubeschichtung wieder aus.Für eine langfristige extrahepatische Gallengang-Organoidlagerung, waschen Sie jeden Brunnen von Organoiden mit Raumtemperatur PBS, ohne die KellermatrixTropfen zu stören und fügen Sie 500 Mikroliter eiskaltes Gefriermedium zu jedem Brunnen hinzu. Die Organoide vorsichtig wieder aufhängen und die Mischung in einzelne kryogene Fläschchen übertragen, dann die Fläschchen 48 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius platzieren, bevor die Organoide zur Langzeitlagerung in einer Dampfphase in einen Stickstofftank übertragen werden. Um die Organoide für die Paraffineinbettung vorzubereiten, ersetzen Sie das Medium durch 500 Mikroliter vier Grad Celsius PBS und übertragen Sie die Suspension von jedem Brunnen in einzelne 1,5-Milliliter-Röhren mit verflüssigter Kellermatrix.Sammeln Sie die Organoide durch Zentrifugation und verwenden Sie eine modifizierte P1000 Pipettenspitze, um die Überräube sorgfältig zu entfernen, ohne die Pellets zu stören. Dann fügen Sie einen Milliliter eiskalte, 4%Paraformaldehyd zu den Organoiden für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen die Fixierung durch einen Milliliter Raumtemperatur PBS für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur ersetzen und die Organoide dreimal durch Zentrifugation waschen.Nach der letzten Wäsche die Organoide in einem Milliliter 30% Ethanol für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur wieder aufsetzen, gefolgt von einer fünfminütigen Inkubation in einem Milliliter 70% Ethanol bei Raumtemperatur. Am Ende der 70%ethanol Inkubation die Organoide durch Zentrifugation sammeln und die Organoide in einem Milliliter 100% Ethanol für fünf Minuten bei Raumtemperatur wieder aussetzen. Am Ende der 100%ethanol Inkubation, Wärme Probe Verarbeitung Gel in einer Mikrowelle für 20 Sekunden oder bis verflüssigt, und fügen Sie 50 Mikroliter des Liquifizierten Gelzuleines zu jeder Röhre von Organoiden.Legen Sie die Röhren auf Eis, bis das Probenverarbeitungsgel erstarrt ist, und übertragen Sie den Tropfen der Organoide von jedem Rohr auf die blauen Schwammpolster in einer Kassette zur Weiterverarbeitung im Paraffin-Einbau. Legen Sie die Kassette in einen 15 Minuten pro Schritt programmierten Gewebeprozessor und abschnitten Sie dann die paraffineingebetteten Organoide in Probenverarbeitungsgel mit vier Mikrometern pro Abschnitt für immunhistochemische Färbung und Analyse nach Standardprotokollen. Extrahepatische Gallengang organoide Beschichtung Effizienz ist etwa 2%, wenn von neonatalen oder erwachsenen Mäusen isoliert.Nach Durchgang zwei erhöht sich die Beschichtungseffizienz von extrahepatischen Gallengangsorganoiden, die von erwachsenen Mäusen abgeleitet wurden, auf 11% und bleibt stabil. Die Mehrheit der Organoide zeigt eine zystische Morphologie in allen Passagen mit seltenen unregelmäßigen Organoiden. Die Organoide erreichen einen Wachstumsgipfel von fünf bis sieben Tagen, danach beginnen sie, sich intraluminale Ablagerungen anzusammeln und verschlechtern sich.Daher sollten die Organoide zur Aufrechterhaltung der Organoidkultur alle sieben bis zehn Tage geteilt werden. Bei der Analyse mit Immunfluoreszenz bestehen extrahepatische Gallenkanal-Organoide aus einer reinen Population von Epithelzellen, die durch E-Cadherin gekennzeichnet sind. Organoide Zellen zeigen auch Marker von Gallenvorläuferzellen sowie Marker der Gallendifferenzierung.Wichtig ist, dass ein hoher Prozentsatz organoider Zellen ein primäres Cilium besitzt, das durch acetyliertes Alpha Tubulin gekennzeichnet ist, was ein Merkmal normaler Cholangiocyten ist und eine geeignete organoide Zellpolarisation nahelegt. Eine enge Einhaltung des beschriebenen Temperaturzustandes ist erforderlich. Eine sorgfältige Gallengangssektion verhindert eine Kontamination der Bauchspeicheldrüsenzellen.Der Verlust von zellulärem Material kann durch sorgfältige Manipulation nach zentrifugieren vermieden werden. Diese Organoide können als präklinische Modelle verwendet werden, genetisch und pharmakologisch manipuliert, oder verwendet werden, um Medikamente und die Auswirkungen von Infektionserregern zu testen. Diese Methode kann von Laboren verwendet werden, die genetisch veränderte Mausmodelle nutzen möchten, um die Mechanismen der Cholangiozytenbiologie weiter zu untersuchen.

generation-of-organoids-from-mouse-extrahepatic-bile-ducts

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Eine Technik, um Cholangiozyten aus den extrahepatischen Gallengänge von neugeborenen Mäusen zu isolieren, wird beschrieben. Die Kanäle sind sorgfältig seziert und dann Zellen werden durch Auswuchs in dicken Kollagen-Gelen isoliert. Diese Methode bietet ein nützliches Werkzeug für das Studium extrahepatischen Gallengang Entwicklung und Pathologie.

Isolierung von Neugeborenen Extrahepatische Cholangiozyten

Die in diesem Protokoll beschriebenen dreidimensionalen Kulturverfahren rekapituliert Bauchspeicheldrüse Entwicklung von verteilten embryonalen Maus-Pankreasvorläuferzellen, einschließlich ihrer erheblichen Ausweitung, Differenzierung und Morphogenese in einem verzweigten Organ. Dieses Verfahren ist zugänglich Bildgebung, funktionelle Störungen und Manipulationen der Nische.

In-vitro-Pankreas Organogenese von Dispersed embryonalen Maus-Vorläufer

Wir präsentieren eine recht einfache und empfindliche Methode zur genauen Quantifizierung der Gallengangsdichte in der Mausleber. Diese Methode kann bei der Bestimmung der Auswirkungen von genetischen und ökologischen Modifikatoren und der Wirksamkeit potenzieller Therapien in Mausmodellen von Gallenerkrankungen helfen.

Bestimmung der Gallengangsdichte in der Mausleber

Wir zeigen eine Methode zur Nekropsie und Zerlegung von Prostatakrebsmodellen der Maus, die sich auf die Prostatatumorsektion konzentriert. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Erzeugung von Maus-Prostatatumor-Organoiden wird ebenfalls vorgestellt.

Generierung von Tumororganoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs

Dreidimensionale (3D) zelluläre Systeme sind relevante Modelle zur Untersuchung der Organogenese. Eine hydrogelbasierte Methode für die Produktion von Gallenzysten und deren Charakterisierung wird vorgeschlagen. Dieses Protokoll entschlüsselt die Barrieren der 3D-Charakterisierung, mit einer einfachen und zuverlässigen Methode, um die Effizienz der Zystenbildung und ihre Funktionalität zu bewerten.

Generierung und quantitative Charakterisierung funktioneller und polarisierter Gallenepithelzysten

Aus Maushepatozyten wurde ein langfristiges Ex-vitro-3D-Organoidkultursystem etabliert. Diese Organoide können durch Lentivirus-Infektion der shRNA /ektopischen Konstruktion, siRNA-Transfektion und CRISPR-Cas9-Engineering durchpasst und genetisch manipuliert werden.

Etablierung und genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden

Für die Beobachtung von neonatalen Gallengangsstörungen der Maus sind ein intakter Gallengang und eine effiziente Vorbereitung erforderlich. Daher wurde erfolgreich ein neuer Ansatz zur Isolierung des gesamten extrahepatischen Gallengangsystems bei murinen Neugeborenen unter Beibehaltung der Integrität des Gallengangs entwickelt.

Extrahepatische Gallengangs- und Gallenblasendissektion bei neun Tage alten Maus-Neugeborenen

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von schnellen und reproduzierbaren endodermalen Leberorganoiden (eHEPOs). Mit diesem Protokoll können eHEPOs innerhalb von 2 Wochen hergestellt werden und langfristig (mehr als 1 Jahr) expandieren, ohne ihre Differenzierung und Funktionalität zu verlieren.

Erzeugung von funktionellen endodermalen Leberorganoiden

Organoide, die aus Patiententumoren erzeugt werden, werden orthotopisch in die Leber der Maus injiziert. Die Resektion von nicht-tumorösem Lebergewebe führt zu einer regenerativen Umgebung im Lebergewebe, in dem sich der Tumor befindet.

Ein von Patienten mit hepatozellulärem Krebs abgeleitetes Organoid-Xenotransplantat-Modell zur Untersuchung des Einflusses der Leberregeneration auf das Tumorwachstum

Dieses Protokoll stellt eine optimierte zweistufige Kollagenase-Leberperfusionstechnik in einem Rattenmodell vor und zeigt die Verwendung von isolierten Hepatozyten für die in vitro Langzeitkultur von 3D-Organoiden.

Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist

Erfahren Sie die Herstellung von Organellen aus dem extrahepatischen Gallengang der Maus zur Untersuchung von Cholangiozytenbiologie und Zellinteraktionen. Dieses reproduzierbare Modell ermöglicht kosteneffiziente Forschung an adultem Gewebe.

Generation von Organellen von Maus extrahepatische Gallenwege

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