Name: Bakterielle Zellkultur auf der Einzelzellebene im Riesenvesikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Einzelzellkultur bakterieller Zellen in Riesenvesikeln mittels Tröpfchentransfermethode. Diese Technik ermöglicht die direkte Beobachtung von Bakterienwachstum in Echtzeit.

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Diese Arbeit wurde von einer Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER, No. 16812285) des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) japans unterstützt, einem Stipendium für junge Wissenschaftlerforschung (Nr. 18K18157, 16K21034) von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) bis M.M., und Grant-in-Aid von MEXT bis K.K. (Nr. 17H06417, 17H06413).

1. Herstellung von GVs, die Bakterienzellen enthalten, nach der Tröpfchenübertragungsmethode
<ol><li>Bereiten Sie Lipid-Lagerlösungen von 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (POPC, 10 mM, 1 ml) und 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[Biotinyl(Polyethylenglycol)-2000] (Biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 ml) in Chloroform/ Methanollösung (2/1, v/v) und lagern Sie den Lagerbestand bei -20 °C.</li>
	<li>Herstellung einer lipidhaltigen Öllösung
	<ol>
<li>Gießen Sie 20 l der POPC-Lösung und 4 l der Biotin-PEG-DSPE-Lösung in ein Glasrohr (Abbildung1b i)).</li>
		<li>Verdampfen Sie das organische Lösungsmittel durch Luftstrom zu einem Lipidfilm und legen Sie den Film 1 h in einen Trockenbauort, um das organische Lösungsmittel vollständig zu verdampfen (Abbildung 1b (ii)). HINWEIS: Es ist notwendig, das organische Lösungsmittel in einer Dunstabzugshaube zu verdampfen.</li>
		<li>Fügen Sie der Glasdurchstechflasche 200 l Mineralöl (0,84 g/ml, Materialtabelle)hinzu (Abbildung 1b (iii)).</li>
		<li>Den Eröffnungsteil der Glasdurchstechflasche mit Folie umwickeln und in einem Ultraschallbad (120 W) mindestens 1 h beschallen (Abbildung1b (iii)). Die Endkonzentrationen von POPC und Biotin-PEG-DSPE betragen 1 mM bzw. 0,002 mM.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorkultur von Bakterienzellen
	<ol>
<li>E. coli in 1x LB Medium (1 g Hefeextrakt, 2 g Bacto Trypton und 2 g Natriumchlorid in 200 ml entionisiertem Wasser) aus einer LB-Platte impfen und bei 37 °C für 12–14 h (über Nacht) inkubieren.</li>
		<li>Nach der Inkubation 20 l der Kulturlösung sammeln und auf 1,98 ml frisches 1x LB-Medium übertragen und die Zellen für 2 h wieder kulturieren.</li>
		<li>Überprüfen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) Wert der Vorkulturlösung (vorbereitet in Schritt 1.3.2). Es sollte eine vorkulturelle Lösung von OD600 = 1.0–1.5 verwendet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der äußeren und inneren wässrigen Lösungen von GVs
	<ol>
<li>Glukose in 1x LB-Medium auflösen, um eine äußere wässrige Lösung von GVs vorzubereiten. Bereiten Sie 20 ml einer Glukoselösung (500 mM) vor.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Glukoselösung mit 1x LB medium bis 200 mM (Tabelle 1).</li>
		<li>Sucrose in 1x LB Medium auflösen, um eine innere wässrige Lösung von GVs vorzubereiten. Bereiten Sie 20 ml einer Saccharoselösung (500 mM) vor.</li>
		<li>Mischen Sie die Vorkulturlösung (OD600 = 1,0–1,5), die Saccharoselösung (500 mM) und 1x LB medium (Tabelle 1). Der endgültige OD600-Wert der Kulturlösung sollte 0,01–0,015 und die endgültige Saccharosekonzentration 200 mM betragen. HINWEIS: Achten Sie darauf, osmotischen Druck zu vermeiden. Es ist notwendig, die Konzentration zwischen der inneren und äußeren wässrigen Lösung auszugleichen.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von Wasser-in-Öl (W/O) Tröpfchen, die Bakterienzellen enthalten
	<ol>
<li>Fügen Sie 2 l der inneren wässrigen Lösung von GVs (in Schritt 1.4.4) bis 50 l der lipidhaltigen Öllösung (Mineralöl mit POPC und Biotin-PEG-DSPE) in ein 0,6 ml Deckelkunststoffrohr (Abbildung1b (iv)) ein.</li>
		<li>Emulgieren Sie die beiden Komponenten im Kunststoffrohr, indem Sie das Rohr von Hand tippen (Abbildung1b (v)).</li>
	</ol></li>
	<li>Bildung von GVs, die Bakterienzellen enthalten
	<ol>
<li>50 l der äußeren wässrigen Lösung von GVs (in Schritt 1.4.2) in ein 1,5 ml Deckelkunststoffrohr (Abbildung1b (vi)) geben und 150 l der lipidhaltigen Öllösung (Mineralöl mit POPC und Biotin-PEG-DSPE) auf der Oberfläche des äußeren wässrigen Lösung(Abbildung 1b (vii)). Inkubieren Sie diese Probe bei Raumtemperatur (RT, 25 °C) für 10–15 min. Überprüfen Sie, ob die Schnittstelle zwischen Öl und wässrigen Lösungen flach ist.</li>
		<li>Fügen Sie 50 l der W/O-Tröpfchenlösung (in Schritt 1.5.2) an der Schnittstelle des Öls und der wässrigen Lösung mit einer Pipette hinzu (Abbildung1b (viii)).</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das 1,5 ml-Kunststoffrohr (ab Schritt 1.6.2) für 10 min bei 1.600 x g bei RT in einer Desktop-Zentrifuge (Abbildung1b (ix)). Nach der Zentrifugation das Öl (obere Schicht) aus dem 1,5-ml-Kunststoffrohr mit einer Pipette ansaugen und die GVs mit Bakterienzellen sammeln (Abbildung 1b (x)).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vorbereitung eines GV-Beobachtungssystems (Bakterielles Zellkultursystem)
<ol><li>
Herstellung von kleinen Vesikeln (SVs) für konstruktiv ng a unterstützte Bilayer-Membran
	<ol>
<li>Gießen Sie 20 l der POPC-Lösung und 4 l der Biotin-PEG-DSPE-Lösung in ein Glasrohr (unter Verwendung der gleichen Lipidzusammensetzung wie bei der GV-Vorbereitung in Schritt 1.1).</li>
		<li>Verdampfen Sie das organische Lösungsmittel durch Luftstrom zu einem Lipidfilm und legen Sie diese Probe in einem Trockengerät für 1 h, um das organische Lösungsmittel vollständig zu verdampfen.</li>
		<li>Fügen Sie 200 l 200 mM Glukose in 1x LB Medium (die äußere wässrige Lösung von GVs) in die Glasdurchstechflasche ein.</li>
		<li>Den Eröffnungsteil der Glasdurchstechflasche mit Folie umwickeln und in einem Ultraschallbad (120 W) mindestens 1 h beschallen.</li>
		<li>Bereiten Sie SVs nach dem Extrusionsverfahren21 mit einem Miniextruder und einer Polycarbonatmembran mit 100 nm Porengröße vor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung einer handgefertigten Kammer
	<ol>
<li>Bohren Sie ein 7-mm-Loch mit einem Hohlstanz auf einer doppelseitigen Dichtung (10 mm x 10 mm x 1 mm).</li>
		<li>Die doppelseitige Dichtung mit dem Loch auf ein Abdeckglas (30 mm x 40 mm, Dicke 0,25–0,35 mm) kleben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung einer unterstützten Doppelschichtmembran auf dem Deckglas im Loch der Kammer
	<ol>
<li>Fügen Sie 30 l der SV-Lösung in das Loch der Kammer (in Abschnitt 2.2) und inkubieren bei RT für 30 min.</li>
		<li>Waschen Sie das Loch vorsichtig zweimal mit 20 l 1x LB Medium, das 200 mM Glukose (die äußere wässrige Lösung von GVs) durch Pipettieren enthält.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immobilisierung von GVs auf der unterstützte Zweischichtmembran auf dem Deckglas im Loch der Kammer
	<ol>
<li>10 l Neutravidin mit der äußeren wässrigen Lösung von GVs (1 mg/ml) in das Loch einführen und bei RT 15 min inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie das Loch vorsichtig zweimal mit 20 l 1x LB Medium, das 200 mM Glukose (die äußere wässrige Lösung von GVs) durch Pipettieren enthält.</li>
		<li>Fügen Sie alle Lösung strotzenden GVs (in Schritt 1.6.3) in das Loch der Kammer und versiegeln Sie mit einem Abdeckglas (18 mm x 18 mm, Dicke 0,13–0,17 mm) (Abbildung 2b).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mikroskopische Beobachtung des Bakterienzellwachstums in GVs
	<ol>
<li>Stellen Sie ein mikroskopisches Heizbühnensystem mit einem invertierten Mikroskop ein, das mit einer 40x/0,6 numerischen Blende (NA) Objektivlinse mit einem langen Arbeitsabstand ausgestattet ist (Abbildung 2b).</li>
		<li>Platzieren Sie die Kammer auf dem mikroskopischen Heizbühnensystem (Abbildung 2b). Inkubieren Sie die GVs, die Bakterienzellen in der Kammer enthalten, in einem statischen Zustand für 6 h bei 37 °C.</li>
		<li>Erfassen und aufzeichnen Sie Mikroskopbilder des Bakterienzellwachstums in GVs alle 30 min mit hilfe einer wissenschaftlichen Komplementär-Metalloxid-Halbleiterkamera (sCMOS).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene innerhalb von GVs. Bei dieser einfachen Methode werden GVs gebildet, die Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene enthalten, indem die Tröpfchenübertragungsmethode verwendet wird. Im Vergleich zu anderen Ansätzen zur Gewinnung von GVs, die Bakterienzellen enthalten, hat diese Methode zwei Vorteile: (i) es ist leicht zu entwickeln, und (ii) ein kleines Volumen (2 l) der Probenlösung ist erforderlich, um die GVs vorzubereiten. Die T...

Die Kultur der Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene hat zunehmend Beachtung gefunden. Die Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene innerhalb eines begrenzten Raumes kann bakterielle Funktionen wie phänotypische Variabilität1,2,3,4, Zellverhalten5, 6 , 7 , 8 , 9und Antibiotikaresistenz10,11. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in Kulturtechniken kann die Kultur einzelner Bakterien auf engstem Raum erreicht werden, z. B. in einem Well-Chip4,7,8, Geltröpfchen12,13 , und Wasser-in-Öl (W/O) Tröpfchen5,11. Um das Verständnis oder die Nutzung einzelner Bakterienzellen zu fördern, sind weitere technische Entwicklungen der Kultivierungstechniken erforderlich.
Vesikel, die die biologische Zellmembran imitieren, sind kugelförmige Kompartimente, die aus amphiphilen Molekülen bestehen und verschiedene Materialien aufnehmen können. Vesikel werden nach Größe klassifiziert und umfassen kleine Vesikel (SVs, Durchmesser < 100 nm), große Vesikel (LVs, <1 m) und Riesenbläschen (GVs, >1 m). SVs oder LVs werden aufgrund ihrer Affinität zur biologischen Zellmembran14häufig als Arzneimittelträger eingesetzt. GVs wurden auch als Reaktorsystem für den Bau von Protozellen15 oder künstlicheZellen16verwendet. Die Verkapselung biologischer Zellen inGVs wurde 17,18berichtet, und somit zeigen GVs in Kombination mit dem Reaktorsystem Potenzial als Zellkultursystem.
Hier beschreiben wir zusammen mit einem Video von experimentellen Verfahren, wie VVs als neuartige Zellkulturgefäße verwendet werden können19. GVs, die Bakterien enthalten, wurden nach der Tröpfchentransfermethode20 hergestellt und dann auf einer unterstützten Membran auf einem Deckglas immobilisiert. Wir nutzten dieses System, um das Bakterienwachstum auf einzelzelliger Ebene in GVs in Echtzeit zu beobachten.

<table><tbody><tr><td>Bactotrypton</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>032-21921</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas (18 x 18 mm)</td><td>Matsunami Glas Ind.</td><td>C018181</td><td>Dicke 0,13&ndash; 0,17 mm</td></tr><tr><td>Deckglas (30 x 40 mm)</td><td>Matsunami Glas Ind.</td><td>Dicke nach Kundenwunsch</td><td>0,25&ndash; 0,35 mm</td></tr><tr><td>Desktop-Zentrifuge</td><td>Hi-Tech Co.</td><td>ATT101</td><td>Ausweichrotor</td></tr><tr><td>Typ Doppelseitige Dichtung (10 & x 1 x / 10 x 1 mm)</td><td>Nitoms</td><td>T4613</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen</td><td>AS ONE</td><td>6-306-01</td><td>Durham Fermentationsröhrchen</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX-73</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>133-16771</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopisches Heiztischsystem</td><td>TOKAI HIT</td><td>TP-110R-100</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Nacalai Tesque</td><td>23334-85</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Olympus</td><td>LUCPLFLN 40&fach;/0.6 NA</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Membranen</td><td>Avanti Polar Lipide</td><td>610005</td><td>Porengröße 100 nm</td></tr><tr><td>sCMOS-Kamera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 plus</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallbad</td><td>AS ONE</td><td>ASU-3D</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>0,6 mL Kunststofftube mit Deckel</td><td>Watson</td><td>130-806C</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Kunststofftube mit Deckel</td><td>Sumitomo Bakelite Co.</td><td>MS4265-M</td><td></td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocolin</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850457P</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamin-N-[biotinyl(Polyethylenglykol)-2000]</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>880129P</td><td>Biotin-PEG-DSPE</td></tr></tbody></table>

bakterielle zellkultur auf der einzelzellebene im riesenvesikel

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Wir haben eine Methode zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzelliger Ebene in Riesigen Vesikeln (GVs) entwickelt. Bakterielle Zellkultur ist wichtig für das Verständnis der Funktion von Bakterienzellen in der natürlichen Umgebung. Aufgrund des technologischen Fortschritts können verschiedene bakterielle Zellfunktionen auf einzelzeller Ebene auf engstem Raum aufgedeckt werden. GVs sind kugelförmige mikrogroße Kompartimente, die aus amphiphilen Lipidmolekülen bestehen und verschiedene Materialien, einschließlich Zellen, aufnehmen können. In dieser Studie wurde eine einzelne Bakterienzelle durch die Tröpfchenübertragungsmethode in 10–30 m GVs eingekapselt und die GVs, die Bakterienzellen enthielten, auf einer unterstützten Membran auf einem Glassubstrat immobilisiert. Unsere Methode ist nützlich, um das Echtzeitwachstum einzelner Bakterien in GVs zu beobachten. Wir kultivierten Escherichia coli (E. coli) Zellen als Modell innerhalb von GVs, aber diese Methode kann an andere Zelltypen angepasst werden. Unsere Methode kann in den Bereichen Mikrobiologie, Biologie, Biotechnologie und Synthetische Biologie eingesetzt werden.

Wir stellen eine einfache Methode zur Generierung von GVs vor, die einzelne Bakterienzellen mit der Tröpfchenübertragungsmethode enthalten (Abbildung 1). Abbildung 1a zeigt ein schematisches Bild der Ausfällung von GVs, die Bakterien enthalten. W/O-Tröpfchen, die Bakterien enthalten, werden durch Zentrifugation über die Öl-Wasser-Schnittstelle (Lipid-Monolayer) zu GVs übertragen. Der Dichteunterschied zwischen Saccharose (innere ...

Wir zeigen die einzellige Kultur von Bakterien in riesigen Vesikeln (GVs). GVs, die Bakterienzellen enthalten, wurden nach der Tröpfchentransfermethode hergestellt und auf einer unterstützten Membran auf einem Glassubstrat zur direkten Beobachtung des Bakterienwachstums immobilisiert. Dieser Ansatz kann auch an andere Zellen angepasst werden.

Bakterielle Zellkultur auf der Einzelzellebene im Riesenvesikel

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Dieses Protokoll bietet ein Mittel zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelliger Ebene in riesigen Vesikeln. Es ist einfach, die riesigen Vesikel zu entwickeln, und nur ein sehr kleines Volumen an Probenlösung ist erforderlich, um die Vesikel vorzubereiten. Demonstriert wird das Verfahren von Juri Ota, einem Doktoranden aus unserem Labor.Beginnen Sie mit 20 Mikroliter frisch zubereiteter POPC-Lösung und vier Mikroliter frisch zubereiteter Biotin-PEG-DSPE-Lösung zu einer Glasdurchstechflasche. Verdampfen Sie das organische Lösungsmittel durch Luftstrom, bis sich ein Lipidfilm bildet. Legen Sie den Film für eine Stunde in einen Trockenbau, um das organische Lösungsmittel vollständig zu verdampfen.Dann 200 Mikroliter Mineralöl in die Durchstechflasche geben. Die Öffnung der Durchstechflasche mit Kunststoffparaffinfolie abdecken und den Fläschcheninhalt in einem Ultraschallbad mindestens eine Stunde lang mit 120 Watt beschallen. Für eine kleine Vesikelzubereitung einen Lipidfilm erstellen, wie gerade gezeigt, und fügen Sie 200 Mikroliter 200 Millimeter Glukose in LB Medium in den Film.Dann beschallen Sie den Film mit 120 Watt für mindestens eine Stunde, gefolgt von der Extrusion der resultierenden Riesenbläschen in kleine Vesikel mit einem Miniextruder und einer Polycarbonatmembran mit einer Porengröße von 100 Nanometern. Für bakterielle Zellpräkultur, impfen E.coli von einer LB-Platte in Milliliter LB Medium für eine Nachtkultur bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Morgen 20 Mikroliter des Überstandes der Kultur für weitere zwei Stunden Kultur auf 1,98 Milliliter frisches LB-Medium übertragen.Überprüfen Sie am Ende der Inkubation die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600-Wert der Vorkulturlösung auf einem Spektralphotometer. Es sollte eine vorkulturelle Lösung mit einem OD 600 von einem bis 1,5 verwendet werden. Dann mischen Sie die Vorkulturlösung mit frisch zubereiteter Saccharoselösung und frischem LB-Medium, so Tabelle eins.Für die riesige Vesikelbildung 50 Mikroliter einer frisch zubereiteten äußeren wässrigen Lösung von Riesenbläschen zu einem 1,5 Milliliter-Kunststoffrohr hinzufügen. 150 Mikroliter der fetthaltigen Öllösung vorsichtig über die äußere wässrige Lösung von Riesenbläschen schichten. Inkubieren Sie die resultierende Lösung für 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie überprüfen, ob die Schnittstelle des Öls und wässrige Lösungen flach ist.Für Wasser und Öl Bakterienzelle enthalten Tropfen Bildung, fügen Sie zwei Mikroliter einer frisch zubereiteten inneren wässrigen Lösung von riesigen Vesikel zu 50 Mikroliter der beschallten lipidhaltigen Öllösung in einem 0,6 Milliliter Deckel Kunststoffrohr. Tippen Sie dann auf das Rohr, um die beiden Komponenten zu emulgieren. Als nächstes verwenden Sie eine Pipette, um 50 Mikroliter Wasser und Öltröpfchenlösung an die Schnittstelle des Öls und der wässrigen Lösung zu legen, und sedimentieren Sie die bakteriellen zellhaltigen Riesenbläschen durch Zentrifugation.Dann die obere Ölschicht ansaugen und die riesigen Vesikel sammeln. Um eine handgefertigte Kammer vorzubereiten, bohren Sie ein Sieben-Millimeter-Loch mit einem Hohlstanz auf eine 10 mal 10 mal 10 mal einen Millimeter doppelseitige Dichtung, und fügen Sie dann die doppelseitige Dichtung auf ein 30 mal 40 Millimeter-Deckglas ein. Um eine unterstützte Zweischichtmembran vorzubereiten, fügen Sie 30 Mikroliter der kleinen Vesikellösung in das Loch der handgefertigten Kammer ein.Inkubieren Sie die Vesikel bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Am Ende der Inkubation, waschen Sie das Loch vorsichtig zweimal mit 20 Mikroliter LB Medium, ergänzt mit 200 Millimiller Glukose. Um riesige Vesikel auf der Unterstützenden Zweischichtmembran zu immobilisieren, führen Sie 10 Mikroliter Neutravidin in äußere wässrige Riesenbläschenlösung für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur in das Loch ein.Am Ende der Inkubation, waschen Sie das Loch vorsichtig zweimal mit 20 MikroliterLB-Medium, ergänzt mit 200 Millimiller Glukose, und fügen Sie das gesamte Volumen der riesigen Vesikellösung in das Loch in der Kammer. Dann versiegeln Sie das Loch mit einem 18 mal 18 Millimeter-Abdeckungsglas. Um das Bakterienwachstum innerhalb der riesigen Vesikel zu überwachen, wählen Sie das 40-fache Objektiv auf einem invertierten Mikroskop aus, und legen Sie die Kammer auf das Mikroskop-Heizbühnensystem.Dann inkubieren Sie die bakteriellen zellhaltigen Riesenbläschen in der Kammer unter statischen Bedingungen für sechs Stunden bei 37 Grad Celsius, wobei Sie alle 30 Minuten Bilder des Bakterienzellwachstums mit der wissenschaftlich komplementären Metalloxid-Halbleiterkamera aufnehmen und aufzeichnen. Riesige Vesikel, die Bakterienzellen enthalten, haben in der Regel eine Größe von 10 bis 30 Mikrometern. Bei beiden Größen von Riesenbläschen durchlaufen die E.coli-Zellen Dehnungs- und Divisionsprozesse, wobei einige E.coli-Zellen während des sechsstündigen Beobachtungszeitraums zu einer sehr großen Anzahl von Zellen anwachsen.Die relative Häufigkeit von Riesenvesikeln, die eine einzelne Zellebene enthalten, beträgt etwa 10% der erhaltenen Riesenbläschen, und die riesigen Vesikel, die auf der Ebene der Einzelzellen verkapselt sind, sind etwa 50% der riesigen Vesikel, die Bakterienzellen enthalten. Die Stabilität der Öl-Wasser-Schnittstelle ist wichtig für die Gewinnung von riesigen Vesikeln, die Bakterienzellen enthalten. Achten Sie darauf, das Öl sorgfältig vor der riesigen Vesikelkorrektur zu aspirieren.Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Bakterielle Zellen auf einzelzelliger Ebene innerhalb einzelner Riesenbläschen kultiviert. Unsere Bakterielle Kulturmethode ist ein neues Werkzeug in der Mikrobiologie, um unbekannte Umweltbakterien zu kultivieren, um ihre Stoffwechselprodukte zu erhalten oder zu analysieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Watson, D. C., et.al. Skalierbare Isolierung und Reinigung von extrazellulären Vesikeln aus Escherichia coli und anderen Bakterien. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Isolierung und Konzentration von extrazellulären Vesikeln (EVs), die aus der äußeren Membran von gentechnisch veränderten Bakterien gewonnen werden. Der Prozess umfasst die Kultivierung der Bakterien, um EVs freizusetzen, gefolgt von sequenziellen Zentrifugations- und Filtrationsschritten, um Zellen und Ablagerungen...

Isolierung und Anreicherung von extrazellulären Vesikeln aus der äußeren Membran aus Bakterien

Quelle: Morita, M., et al. Bakterielle Zellkultur auf Einzelzellebene in riesigen Vesikel. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video zeigt eine Methode zur Kultivierung und Beobachtung einzelner Bakterienzellen, die in riesigen Vesikeln eingekapselt sind, die an einer gestützten Lipiddoppelschicht verankert sind. Das System ermöglicht eine stabile, langfristige Abbildung der Wachstumsdynamik einzelner Zellen in einer begrenzten, physiologisch relevanten Mikroumgebung.

Einzelzellkultur von Bakterien in riesigen Vesikeln

Quelle: Cabeen, M. T., et al. Einzellige mikrofluidische Analyse von Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)Das Video demonstriert den Einsatz eines mikrofluidischen Geräts zur Beobachtung des bakteriellen Wachstums auf Einzelzellebene. Es zeigt, wie nicht bewegliche bakterielle Zellen, die in mikrogroßen Gräben eingeschlossen sind, kontinuierlich unter einem Fluoreszenzmikroskop genährt und abgebildet werden. Das Setup ermöglicht eine Echtzeitvisualisierung der Zellteilung und der...

Verfolgung des Bakterienwachstums bei Einzelzellauflösung in einem mikrofluidischen System

In diesem Protokoll wird die Herstellung, der Aufbau und die grundlegende Bedienung eines mikrofluidischen Pikoliter-Bioreaktors (PLBR) für die Einzelzellanalyse von prokaryotischen Mikroorganismen vorgestellt. Industriell relevante Mikroorganismen wurden als Proof of Principle analysiert, was Einblicke in die Wachstumsrate, Morphologie und phänotypische Heterogenität über bestimmte Zeiträume ermöglicht, was mit herkömmlichen Methoden kaum möglich ist.

Mikrofluidischer Picoliter-Bioreaktor für die mikrobielle Einzelzellanalyse: Herstellung, Systemaufbau und Betrieb

Riesenvesikel mit hochgepackten mikrometergroßen Komponenten sind nützliche Zellmodelle. Das Wasser-in-Öl-Emulsionszentrifugationsverfahren ist ein einfaches, leistungsstarkes Werkzeug zur Herstellung von riesigen Vesikeln mit verkapselten Materialien.

Herstellung von Riesenvesikeln Encapsulating Microspheres durch Zentrifugation einer Wasser-in-Öl-Emulsion

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse von einzelnen Bakterienzelle Linien mit Bacillus Subtilis als Beispiel mikrofluidischen. Die Methode überwindet Mängel der traditionellen analytischen Methoden in der Mikrobiologie durch Beobachtung von Hunderten von Generationen der Zelle unter eng kontrollierbar und einheitliche Wachstumsbedingungen ermöglicht.

Einzellige mikrofluidischen Analyse von Bacillus subtilis

Hier beschreiben wir eine einzellige Mikro-Aspirationsmethode zur Trennung infizierter Amöben. Um virale Subpopulationen in Vermamoeba vermiformis zu trennen, die mit Faustoviren und unbekannten Riesenviren infiziert sind, haben wir das unten beschriebene Protokoll entwickelt und seine Fähigkeit demonstriert, zwei neuartige Riesenviren mit geringem Überfluss zu trennen.

Single Cell Micro-Aspiration als Alternative zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung für die Trennung von Riesenviren

Bakterien sezernieren nanometergroße extrazelluläre Vesikel (EVs), die bioaktive biologische Moleküle tragen. Die EV-Forschung konzentriert sich auf das Verständnis ihrer Biogenese, ihrer Rolle bei Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen und Krankheiten sowie ihrer potenziellen therapeutischen Anwendungen. Ein Workflow für die skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterien wird vorgestellt, um die Standardisierung der EV-Forschung zu erleichtern.

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die Isolierung, Konzentration und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus Cyanobakterienkulturen. Ansätze zur Reinigung von Vesikeln aus Kulturen auf verschiedenen Skalen, Kompromisse zwischen den Methoden und Überlegungen zur Arbeit mit Feldproben werden ebenfalls diskutiert.

Isolierung und Charakterisierung von zyanobakteriellen extrazellulären Vesikeln

Dieses Protokoll beschreibt das invertierte Emulsionsverfahren, das zur Verkapselung eines zellfreien Expressionssystems (CFE) in einem riesigen unilamellären Vesikel (GUV) zur Untersuchung der Synthese und des Einbaus eines Modellmembranproteins in die Lipiddoppelschicht verwendet wird.

Rekonstitution des bakteriellen Glutamatrezeptorkanals durch Verkapselung eines zellfreien Expressionssystems

In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Herstellung von zusammengesetzten Riesen-Unilamellären Vesikeln (cGUVs) mit einer Vesikel-in-Vesikel-Struktur mit angepasster elektrischer Leitfähigkeit im inneren, ringförmigen und äußeren Bereich vorgestellt. Bei der Elektroformation werden einfache GUVs synthetisiert, die durch osmotischen Schock in Stomatozyten und cGUVs umgewandelt werden, was ein wertvolles Modell für die Untersuchung der Biophysik kernhaltiger Zellen darstellt.

Synthese von zusammengesetzten Riesen-Unilamellenvesikeln: Ein biomimetisches Modell von Keimzellen

Erfahren Sie die Einzelzellkultur bakterieller Zellen in Riesenvesikeln mittels Tröpfchentransfermethode. Diese Technik ermöglicht die direkte Beobachtung von Bakterienwachstum in Echtzeit.

Bakterielle Zellkultur auf der Einzelzellebene im Riesenvesikel

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